基因工程載體3

質(zhì)粒載體載體噬菌體載體

動(dòng)物病毒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322

單鏈DNAM13載體

SV40載體

乳頭瘤病毒載體昆蟲(chóng)桿狀病毒載體柯斯(COS)載體

λ噬菌體載體

枯草桿菌質(zhì)粒載體pNC3酵母菌質(zhì)粒載體2μ

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體Ti一基因工程的基本元件

------載體四、E.coli質(zhì)粒載體

1.pBR322

是基因工程中最重要的一個(gè)人工質(zhì)粒,有萬(wàn)能質(zhì)粒之美稱(chēng).①pBR322的構(gòu)建復(fù)制子:松弛型選擇標(biāo)記:Amp、Tet篩選形式:抗性插入失活單一切點(diǎn):24個(gè)③物理圖譜②pBR322的特性pBR322plasmidF.BolivarR.L.RodriguezBacterialResistancepBR322酶切圖譜2.pUC系統(tǒng)美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的科學(xué)家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構(gòu)建來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素的抗性基因大腸桿菌β-半乳糖酶基因的啟動(dòng)子及其編碼的α-肽鏈基因（lacZ’）位于lacZ’基因內(nèi)的一段MCS區(qū)段2.pUC系統(tǒng)X-gal溴氯吲哚+β-半乳糖苷-----藍(lán)白斑篩選插入片段無(wú)酶活性白斑未插入片段有酶活性藍(lán)斑β-半乳糖苷酶3.TA載體經(jīng)TaqDNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)A酵母菌質(zhì)粒載體食品級(jí)微生物適合于真核基因表達(dá)基因產(chǎn)物外分泌七、酵母菌質(zhì)粒載體

多數(shù)酵母中含有一種能獨(dú)立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA，稱(chēng)為2μ質(zhì)粒，長(zhǎng)約6.3kb，有單一的復(fù)制起始點(diǎn)和一個(gè)自主復(fù)制功能區(qū)域（ARS片段）。整合型、復(fù)制型、附加型和穩(wěn)定型等類(lèi)型。

①含有E.coli質(zhì)粒的復(fù)制起始序列。②含有酵母的篩選標(biāo)記（如LEU2）③具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點(diǎn)。2.酵母菌質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1.酵母菌質(zhì)粒載體的類(lèi)型TypeNameDescriptionbacterialoriginColE1ColE1(pUC-type)originofreplicationpromoterGal1-10promoterGal1-10yeastpromoterselectablemarkerampRampicillinresistancegeneselectablemarkerchlRchloramphenicolresistancegeneLOSTinrecombined(withinsert)formselectablemarkerURA3URA3auxotrophyselectablemarker(yeast)yeastcentromereCEN4yeastcentromericsequenceyeastoriginARS1ARS1yeastoriginofreplication④酵母菌菌穩(wěn)定型型質(zhì)粒載載體著絲粒粒第二節(jié)節(jié)噬噬菌體體載體體一、λ噬菌體體載體體1.λ噬菌體體結(jié)構(gòu)構(gòu)特點(diǎn)點(diǎn):①線(xiàn)性性雙鏈鏈DNA分子②可在在E.coli中大量量繁殖殖③具非非必需需區(qū)(約1/3長(zhǎng)度度）④兩端端具12個(gè)個(gè)核苷苷酸單單鏈互互補(bǔ)粘粘性末末端λ噬菌體體線(xiàn)性性DNA分子的的粘性性末端端及其其環(huán)化化作用用（a）具有有互補(bǔ)補(bǔ)單鏈鏈末端端（粘粘性末末端））的λDNA分子。。（b）當(dāng)進(jìn)進(jìn)入宿宿主細(xì)細(xì)胞后后，通通過(guò)粘粘性末末端之之間的的堿基基配對(duì)對(duì)作用用實(shí)現(xiàn)現(xiàn)的線(xiàn)線(xiàn)性分分子的的環(huán)化化作用用，由由此形形成的的雙鏈鏈區(qū)叫叫做cos位點(diǎn)GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACGcos5’-P5’-P3’3’粘性末端環(huán)化作用（a）（b）2、λ噬菌體體的缺缺陷與與改造造λ噬菌體體的缺缺陷：：⑴酶酶切點(diǎn)點(diǎn)太多多5個(gè)BamH1位點(diǎn)，，6個(gè)BglⅠ位點(diǎn)，，5個(gè)EcoRⅠⅠ位點(diǎn)。。⑵野野生型型只能能接納納一定定長(zhǎng)度度的DNA。λ噬菌體體的75-105%，只能能接納納49kb××5%=2.45kb的DNA。λ噬菌體體的改改造：：⑴切切去非非必須須區(qū)段段，在在切去去的同同時(shí)，，加載載目的的基因因（15-23Kb）；⑵去去除過(guò)過(guò)多的的酶切切位點(diǎn)點(diǎn)，每每種酶酶只留留1-2個(gè)切口口；⑶增增加選選擇標(biāo)標(biāo)記基基因（（selectablemarker）；⑷建立λDNA的體外包裝裝。主要外殼蛋蛋白質(zhì)是基基因E的產(chǎn)物頭部前體連環(huán)DNA基因A的產(chǎn)物在cos位點(diǎn)切割噬噬菌體DNA包含在外殼殼中的基因因D的產(chǎn)物基因W和FII的產(chǎn)物組裝裝蛋白質(zhì)加加完整的尾尾部噬菌體的包包裝過(guò)程sup-細(xì)菌頭部基因（（琥珀突突變型）尾部基因（（琥珀突突變型）轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋蛋白質(zhì)質(zhì)合成組裝尾部所所需要的組組分“無(wú)頭部”的提取物組裝頭部所所需要的組組分“無(wú)尾部”的提取物溫育完整的噬菌菌體轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋蛋白質(zhì)質(zhì)合成T4噬菌體的體體外包裝λDNA的體外包裝裝體外包裝的的重組DNA比裸露的DNA導(dǎo)入受體細(xì)細(xì)胞的效率率高100-10000倍4.凱倫噬菌體體載體克隆隆過(guò)程5.λ噬菌體載體體優(yōu)點(diǎn):用途:主要用于建建立真核生生物的基因因文庫(kù)①感染高效效:比質(zhì)粒粒高百倍②容容量量大大:可可達(dá)達(dá)15Kb(不得得超超過(guò)過(guò)原原來(lái)來(lái)長(zhǎng)長(zhǎng)度度的的105%,不不得得短短于于原原來(lái)來(lái)長(zhǎng)長(zhǎng)度度的的75%)③易操操作作,易易保保藏藏二、、柯柯斯斯(COS)載體體(cosmid)1.柯柯斯斯載載體體的的組組成成帶有有抗抗藥藥性性標(biāo)標(biāo)記記帶有有質(zhì)質(zhì)粒粒的的復(fù)復(fù)制制起起始始點(diǎn)點(diǎn)帶有有多多個(gè)個(gè)限限制制酶酶的的單單一一切切點(diǎn)點(diǎn)帶有有λ噬菌菌體體粘粘性性末末端端片片段段由質(zhì)質(zhì)粒粒和和λ粘性性末末端端““尾尾巴巴””兩兩部部分分組組成成。。2.柯斯斯載載體體的的特特點(diǎn)點(diǎn)3.cosmid載體的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)能象λDNA一樣體外外包裝，，并高效效導(dǎo)入受受體細(xì)胞胞可以裝載載比質(zhì)粒?；颚薉NA大得多的的外源DNA片段cos區(qū)1.7kb+質(zhì)粒部分分外源DNA由于攜帶帶質(zhì)粒的的選擇標(biāo)標(biāo)記，便便于篩選選由于質(zhì)粒粒上的多多種單一一酶切位位點(diǎn)，便便于克隆隆。利用柯斯斯載體載載體進(jìn)行行基因克克隆的一一般程序序三、M13噬菌體克克隆載體體1.M13的特性:環(huán)狀,單鏈鏈DNA,6.407Kb2.M13噬菌體作為載載體優(yōu)越性單鏈DNA噬菌體的復(fù)制制，是以雙鏈鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這這種復(fù)制形式式的DNA簡(jiǎn)稱(chēng)RFDNA；不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸腸桿菌；單鏈DNA噬菌體顆粒的的大小，是受受其DNA的大小制約的的，不存在包包裝限制問(wèn)題題；可產(chǎn)生含外源源片斷的單鏈鏈DNA分子。2.M13載體的構(gòu)建五、噬菌體展展示載體其基本原理是是將外源DNA片段插入噬菌菌體編碼蛋白白基因PⅢ中，使外源DNA片段對(duì)應(yīng)的表表達(dá)產(chǎn)物融合合在噬菌體的的外殼蛋白中中形成融合蛋蛋白，呈現(xiàn)在在噬菌體表面面。質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w克隆DNA大片段±*++-構(gòu)建基因組文庫(kù)-++-構(gòu)建DNA文庫(kù)+---常規(guī)的亞克隆化+---構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+---序列分析+--+單鏈探針---+外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+---*

外源DNA如超過(guò)10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低

四種常用載體體的比較9、靜夜四無(wú)鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉葉樹(shù)，燈下下白頭人。。。06:03:1106:03:1106:0312/23/20226:03:11AM11、以我獨(dú)獨(dú)沈久，，愧君相相見(jiàn)頻。。。12月-2206:03:1106:03Dec-2223-Dec-2212、故人江江海別，，幾度隔隔山川。。。06:03:1106:03:1106:03Friday,December23,202213、乍見(jiàn)翻疑夢(mèng)夢(mèng)，相悲各問(wèn)問(wèn)年。。12月月-2212月月-2206:03:1106:03:11December23,202214、他鄉(xiāng)生白發(fā)發(fā)，舊國(guó)見(jiàn)青青山。。23十二月月20226:03:11上午午06:03:1112月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月226:03上上午午12月月-2206:03December23,202216、行行動(dòng)動(dòng)出出成成果果，，工工作作出出財(cái)財(cái)富富。。。。2022/12/236:03:1106:03:1123December202217、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時(shí)時(shí)，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點(diǎn)的的射線(xiàn)向前前。。6:03:11上上午6:03上上午06:03:1112月-229、沒(méi)有有失敗敗，只只有暫暫時(shí)停停止成成功??！。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有結(jié)結(jié)果果，，但但是是不不努努力力卻卻什什么么改改變變也也沒(méi)沒(méi)有有。。。。06:03:1106:03:1106:0312/23/20226:03:11AM11、成成功功就就是是日日復(fù)復(fù)一一日日那那一一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小小小努努力力的的積積累累。。。。12月月-2206:03:1106:03Dec-2223-Dec-2212、世世間間成成事事，，不不求求其其絕絕對(duì)對(duì)圓圓滿(mǎn)滿(mǎn)，，留留一一份份不不足足，，可可得得無(wú)無(wú)限限完完美美。。。。06:03:1106:03:1106:03Friday,December23,202213、不知知香積積寺，，數(shù)里里入云云峰。。。12月月-2212月月-2206:03:1106:03:11December23,202214、意志志堅(jiān)強(qiáng)強(qiáng)的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥塊一一樣任任意揉揉捏。。23十十二二月20226:03:11上上午06:03:1112月月-2215、楚塞三三湘接，，荊門(mén)九九派通。。。。十二月226:03上午午12月-2206:03December23,202216、少少年年十十五五二二十十時(shí)時(shí)，，步步行行奪奪得得胡胡馬馬騎騎。。。。2022/12/236:03:1106:03:1123December202217、空空山山新新雨雨后后，，天天氣氣晚晚來(lái)來(lái)秋秋。。。。6:03:11上上午午6:03上上午午06:03:1112月月-229、楊柳散和風(fēng)風(fēng)，青山澹吾吾慮。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、閱讀一切好好書(shū)如同和過(guò)過(guò)去最杰出的的人談話(huà)。06:03:1206:03:1206:0312/23/20226:03:12AM11、越是沒(méi)有本本領(lǐng)的就越加加自命不凡。。12月-2206:03:1206:03Dec-2223-Dec-2212、越是是無(wú)能能的人人，越越喜歡歡挑剔剔別人