基因重組及遺傳

第五章細(xì)菌基因重組及遺傳分析基因重組（generecombination）是指不同來(lái)源的遺傳物質(zhì)通過(guò)轉(zhuǎn)移和交換而重新組合的過(guò)程。高等動(dòng)植物和許多產(chǎn)生有性孢子的真核微生物的基因重組都是通過(guò)有性世代來(lái)完成。在細(xì)菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱(chēng)為供體（donor），而獲得基因的另一方稱(chēng)為受體（recipient）。第一節(jié)轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)化：是指某一基因型的細(xì)胞從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型細(xì)胞的DNA而使受體的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化因子的證實(shí)對(duì)促進(jìn)現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。

在實(shí)驗(yàn)室條件下，通常用CaCl2、cAMP、低溫培養(yǎng)、PEG介導(dǎo)及電脈沖等方法轉(zhuǎn)化細(xì)菌或其它微生物。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程大體可分為三個(gè)階段：感受態(tài)的出現(xiàn)DNA的吸附和進(jìn)入DNA的整合感受態(tài)的出現(xiàn)

感受態(tài)（competence）：是指受體菌細(xì)胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理狀態(tài)。一、轉(zhuǎn)化過(guò)程和機(jī)制

細(xì)菌細(xì)胞在特定時(shí)期產(chǎn)生一種稱(chēng)為感受態(tài)因子的小分子蛋白（5-10kD）。這種感受態(tài)因子可與細(xì)胞表面受體蛋白結(jié)合，使細(xì)胞產(chǎn)生感受態(tài)特異蛋白，其中包括細(xì)胞壁自溶素。自溶素使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來(lái)，使其具有與DNA結(jié)合的活性。因此，當(dāng)細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，就意味著細(xì)菌出現(xiàn)了感受態(tài)。

4.進(jìn)入細(xì)胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并整合到染色體上革蘭氏陽(yáng)性菌1.雙鏈DNA片段在DNA結(jié)合蛋白（黑色點(diǎn)）的幫助下吸附到細(xì)胞表面并由核酸酶（紫色橢圓）切成缺口2.由核酸酶降解其中一條單鏈3.未被降解的單鏈與感受態(tài)特異蛋白相互作用并進(jìn)入細(xì)胞DNA的吸附和進(jìn)入

在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細(xì)胞形成一種結(jié)合雙鏈DNA的膜結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化小體（transformasome）。該小體吸附DNA后，與細(xì)胞的內(nèi)外膜相融合而轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)側(cè)，再將雙鏈變成單鏈DNA。

轉(zhuǎn)化小體雙鏈DNA被轉(zhuǎn)化小體攝取轉(zhuǎn)化的雙鏈DNA（30-50kb）結(jié)合到膜受體上很快進(jìn)行同源重組使外源DNA整合到染色體上革蘭氏陰性菌DNA在進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞之前，要經(jīng)過(guò)可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸附的DNA對(duì)DNA酶敏感，并可以洗脫下來(lái)。隨著感受態(tài)細(xì)胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐步向不可逆吸附轉(zhuǎn)化，不可逆吸附DNA對(duì)DNA酶不敏感。吸附到細(xì)胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實(shí)驗(yàn)證明：肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化因子在100℃下逐漸失去轉(zhuǎn)化活性(DNA發(fā)生變性)。在逐漸冷卻過(guò)程中活性逐漸恢復(fù)(單鏈DNA復(fù)性成雙鏈)。說(shuō)明完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)化活性來(lái)說(shuō)是必要的，轉(zhuǎn)化的第一步，需要雙鏈DNA才能結(jié)合到細(xì)胞表面的結(jié)合位點(diǎn)上。當(dāng)DNA吸附后，被酶解開(kāi)成單鏈DNA，只有單鏈DNA才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與受體染色體DNA進(jìn)行整合。

流感嗜血菌特異性攝取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特異性攝取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色體上有600個(gè)拷貝的攝取序列。攝取序列雖然只有10-12bp，但很少隨機(jī)地出現(xiàn)在其他物種的DNA序列中，因此這些細(xì)菌對(duì)外源DNA的吸收具有選擇性。為什么有些細(xì)菌對(duì)攝取的DNA有特異性要求呢？近年來(lái)的研究表明，G-菌和G＋菌對(duì)單鏈DNA也能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化，但一般是在較低的pH值下進(jìn)行的。外源DNA片段在受體細(xì)胞中的命運(yùn)：外源DNA（紅色）轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞后，通過(guò)同源重組整合到染色體上，否則被降解成核苷酸。

DNA的整合

轉(zhuǎn)化為相相同或相相近物種種之間的的同源重重組提供供了可能能性，是是自然界界中基因因交換的的一條重重要途徑徑，在生生物變異異和進(jìn)化化中起著著重要作作用。轉(zhuǎn)化的效效率決定定于下列列三個(gè)內(nèi)內(nèi)在因素素：受體細(xì)胞胞的感受受態(tài)，決決定轉(zhuǎn)化化DNA能否進(jìn)入入細(xì)胞受體細(xì)胞胞的限制制系統(tǒng)，，決定轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化DNA在整合前前是否被被分解供體和受受體DNA的同源性性，決定定轉(zhuǎn)化DNA的整合。。由于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化DNA總是與順順序相同同或相似似的受體體DNA配合，所所以親緣緣關(guān)系越越近的其其同源性性也越強(qiáng)強(qiáng)，轉(zhuǎn)化化效率也也越高。。二、人工工轉(zhuǎn)化通過(guò)二價(jià)價(jià)陽(yáng)離子子處理，，大腸桿桿菌等部部分G-細(xì)菌能產(chǎn)產(chǎn)生感受受態(tài)通過(guò)制備備原生質(zhì)質(zhì)，大多多數(shù)細(xì)菌菌特別是是某些G+細(xì)菌已知許多多細(xì)菌包包括大腸腸桿菌均均無(wú)自然然轉(zhuǎn)化的的能力，，但經(jīng)人人工誘導(dǎo)導(dǎo)可使它它們形成成感受態(tài)態(tài)。如：：1970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)現(xiàn)DNA在含有高高濃度Ca2+的條件下下能夠被被受體細(xì)細(xì)胞攝入入和轉(zhuǎn)化化，隨后后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證明由由Ca2+誘導(dǎo)的人人工轉(zhuǎn)化化的大腸腸桿菌中中，其轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化DNA必須是一一種獨(dú)立立DNA復(fù)制子。。大腸桿菌菌的轉(zhuǎn)化化隨著研究究技術(shù)的的改進(jìn)和和經(jīng)驗(yàn)的的積累，，人們已已經(jīng)建立立了用Ca2+、Mg2+等誘導(dǎo)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)程序序，能對(duì)對(duì)大腸桿桿菌菌株株C600、JMl01、JMl09、DH5a等進(jìn)行有有效的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。先將大腸腸桿菌培培養(yǎng)至OD600=0.5～1接著用50-100mmol／LCaCl2處理制備備成感受受態(tài)細(xì)胞胞然后將DNA與感受態(tài)態(tài)細(xì)胞混混合在冰浴中中反應(yīng)20-40min進(jìn)行42℃熱擊可增增加DNA的吸收（（107個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA）最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化化方法是：由于異源的質(zhì)質(zhì)粒DNA分子能夠進(jìn)入入大腸桿菌細(xì)細(xì)胞，所以大大腸桿菌攝取取DNA是非選擇性的的。PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然形成成感受態(tài)的G+細(xì)菌如枯草芽芽孢桿菌和放放線菌，可通通過(guò)聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。這類(lèi)細(xì)菌必須須首先用細(xì)胞胞壁降解酶完完全除去它們們的肽聚糖層層，然后使其其維持在等滲滲的培養(yǎng)基中中，在PEG存在下，質(zhì)粒?；蚴删wDNA可被高效地導(dǎo)導(dǎo)入原生質(zhì)體體。電脈沖法（電穿孔法）在許多細(xì)菌和和真核系統(tǒng)中中，它們既無(wú)無(wú)自然的感受受態(tài)呈現(xiàn)也不不能用上述的的方法建立感感受態(tài)。因此此人們發(fā)展了了一種新的將將核酸分子導(dǎo)導(dǎo)入細(xì)胞的方方法，最突出出的是電穿孔(electroporation)法和基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化法。電穿孔法：是用高壓脈沖沖電流擊破細(xì)細(xì)胞膜或?qū)⒓?xì)細(xì)胞膜擊成小小孔，使各種種大分子(包括DNA)能通過(guò)這些小小孔進(jìn)入細(xì)胞胞，所以又稱(chēng)稱(chēng)電轉(zhuǎn)化。電場(chǎng)強(qiáng)度、電電脈沖的長(zhǎng)度度和DNA濃度基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化基因槍轉(zhuǎn)化法法首先由Sanford報(bào)道，該方法法是將包裹有有DNA的鎢顆粒像子子彈一樣用高高壓射進(jìn)細(xì)胞胞并使DNA留在細(xì)胞內(nèi)，，特別是留在在細(xì)胞器中。。用這種方法首首次成功地將將DNA導(dǎo)入酵母線粒粒體并引起線線粒體遺傳變變化。基因槍槍轉(zhuǎn)化現(xiàn)在被被廣泛地應(yīng)用用于植物的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化中三、建立轉(zhuǎn)化化方法的策略略被轉(zhuǎn)化對(duì)象（（轉(zhuǎn)化受體））轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建（目的的）轉(zhuǎn)化方法選擇擇四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用用在轉(zhuǎn)化中，如如果轉(zhuǎn)化因子子的兩個(gè)基因因是連鎖的，，那么它們可可以同時(shí)被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化，也稱(chēng)為為共轉(zhuǎn)化，連連鎖的兩個(gè)基基因距離越近近，其共轉(zhuǎn)化化頻率越高，，反之則低。。利用共轉(zhuǎn)化化率和連鎖的的二基因間的的距離的反比比關(guān)系可進(jìn)行行基因定位的的工作。1.連鎖檢測(cè)2.遺傳圖譜的繪繪制trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-（受體）的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化類(lèi)型trp2-his2重組率=2600+107+3660+418×100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418trp2-tyr1重組率=2600+1180+3660+685×100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重組率=418+1180+685+107×100%=13%11940+3660+418+1180+685+107trp2his2tyr1

3413403.基因中斷4.插入基因第二節(jié)接合合作用（conjugation）接合作用：是指在供體細(xì)細(xì)胞和受體細(xì)細(xì)胞直接接觸觸后，質(zhì)粒從從供體細(xì)胞向向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程，，也稱(chēng)細(xì)菌雜雜交。一、接合現(xiàn)象象的發(fā)現(xiàn)與證證實(shí)Lederberg和Tatum（1946年）建立了用用大腸桿菌K12的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺缺陷型菌株在在基本培養(yǎng)基基上是否生長(zhǎng)長(zhǎng)，來(lái)檢驗(yàn)細(xì)細(xì)菌雜交或重重組存在的方方法。在此以以前，沒(méi)有人人證實(shí)細(xì)菌雜雜交現(xiàn)象。細(xì)細(xì)菌雜交有別別于典型的有有性雜交，故故稱(chēng)為細(xì)菌接接合作用。A菌株B菌株混合培培養(yǎng)后后在基基本培培養(yǎng)基基中出出現(xiàn)的的原養(yǎng)養(yǎng)型菌菌落是是否是是雜交交的結(jié)結(jié)果？？必須要排除下下列幾種解釋釋?zhuān)阂皇羌?xì)菌細(xì)胞胞并沒(méi)有接合合，而是交換換了DNA(轉(zhuǎn)化作用)二是細(xì)胞并未未接合，而是是通過(guò)培養(yǎng)基基交換了養(yǎng)料料(互養(yǎng))三是細(xì)菌細(xì)胞胞并未接合而而是親本發(fā)生生了回復(fù)突變當(dāng)時(shí)Lederberg和Tatum已經(jīng)證明，當(dāng)當(dāng)把A菌株的培養(yǎng)液液經(jīng)過(guò)滅菌，，再加入到B菌株的培養(yǎng)液液中，沒(méi)有原原養(yǎng)型菌落，，這說(shuō)明上述述實(shí)驗(yàn)并非轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的結(jié)果。。1950年，Davis通過(guò)他的U形管試驗(yàn)進(jìn)一一步支持了Lederberg和Tatum的結(jié)論論。1.轉(zhuǎn)化作作用的的排除除營(yíng)養(yǎng)缺缺陷型型細(xì)胞胞通過(guò)過(guò)培養(yǎng)養(yǎng)基交交換養(yǎng)養(yǎng)料而而生長(zhǎng)長(zhǎng)的現(xiàn)現(xiàn)象亦亦稱(chēng)為為互養(yǎng)。2.互養(yǎng)的的排除除在A-B+T1s和A+B-T1r的雜雜交交中中，，將將基基因因型型A-B+T1s和A+B-T1r兩種種細(xì)細(xì)菌菌在在基基本本培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上混混合合培培養(yǎng)養(yǎng)，，接接觸觸較較短短的的一一段段時(shí)時(shí)間間以以后后，，噴噴上上噬噬菌菌體體T1，把把A-B+T1s細(xì)菌菌殺殺死死。。經(jīng)培培養(yǎng)養(yǎng)以以后后仍仍有有原原養(yǎng)養(yǎng)型型菌菌落落出出現(xiàn)現(xiàn)，，這這說(shuō)說(shuō)明明原原養(yǎng)養(yǎng)型型菌菌落落的的出出現(xiàn)現(xiàn)并并非非由由于于互互養(yǎng)養(yǎng)。。因?yàn)闉榇蟠竽c腸桿桿菌菌的的突突變變率率一一般般都都<10-8，若若兩兩個(gè)個(gè)基基因因同同時(shí)時(shí)回回復(fù)復(fù)突突變變，，則則其其可可能能性性只只有有<10-16（10-8×10-8），，這這種種幾幾率率在在平平板板上上是是很很難難檢檢測(cè)測(cè)到到的的，，所所以以混混合合培培養(yǎng)養(yǎng)能能出出現(xiàn)現(xiàn)10-5~10-6頻率的的菌落落一定定是重重組的的結(jié)果果。3.回復(fù)突突變的的排除除4.遺傳物物質(zhì)的的單向向轉(zhuǎn)移移正交實(shí)實(shí)驗(yàn)（A）Strs×（B）Strr用鏈霉霉素將將A菌株殺殺死重組體體的數(shù)數(shù)目變變化不不大(A)Strr×(B)Strs將B菌株殺殺死一個(gè)重重組體體也沒(méi)沒(méi)有出出現(xiàn)反交實(shí)實(shí)驗(yàn)（A）met-bio-（Strr或Strs）×（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）Hayse（1952）用正反雜雜交實(shí)驗(yàn)證證明，細(xì)菌菌重組的發(fā)發(fā)生只是染染色體單方方向的轉(zhuǎn)移移，而且染染色體的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移往往不不完全。把A菌株認(rèn)為是是供體，而B(niǎo)菌株是受體A菌株作為遺遺傳物質(zhì)的的供體，當(dāng)當(dāng)鏈霉素對(duì)對(duì)它進(jìn)行滅滅活以后，，并未影響響它傳遞遺遺傳物質(zhì)的的能力。B菌株作為遺遺傳物質(zhì)的的受體，一一旦被鏈霉霉素殺死以以后，必然然不能出現(xiàn)現(xiàn)重組體。。供體菌株又又稱(chēng)為雄性細(xì)胞，受體菌株株又稱(chēng)為雌性細(xì)胞StrrA突變型（不不育變種））⊙置冰箱1年后供體的的A菌株Strr×B菌株Strs可育的StrsA菌株共培養(yǎng)，一一起繁殖不能得到雜雜交子StrrA菌株×B菌株Strs恢復(fù)了StrrA突變型的可可育性F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)(Hayes)①大腸桿菌的的供體或雄雄性細(xì)胞(如A菌株)記為F+，帶有一個(gè)個(gè)性因子或或致育因子F(fertilityfactor)，而另一個(gè)個(gè)不帶性因因子F的受體或雌雌性細(xì)胞(如B菌株)叫做F-；②雜交F+×F-是可育的，，雜交F-×F-是不育的；；③F因子可以傳傳遞，從F+到F-細(xì)菌，但必必須通過(guò)細(xì)細(xì)胞接觸④F因子能夠自自發(fā)喪失，，一旦喪失失就不能再再恢復(fù)，除除非從另一一個(gè)F+細(xì)胞再把它它傳遞過(guò)來(lái)來(lái)。分析結(jié)果：：F因子是染色色體外的一一種遺傳結(jié)結(jié)構(gòu)，也就就是質(zhì)粒(plasmid)。F+是一種遺傳傳性狀F因子的存在在使細(xì)菌成成為F+F因子的喪失失使細(xì)菌成成為F-F+細(xì)菌分裂仍仍得到F+細(xì)胞二、F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)構(gòu)及其在細(xì)細(xì)胞中的存存在狀態(tài)F質(zhì)粒的遺傳傳結(jié)構(gòu)F質(zhì)粒的基因因組由三個(gè)個(gè)主要區(qū)段段組成：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)復(fù)制區(qū)、插插入?yún)^(qū)。長(zhǎng)度為33kb，由23個(gè)基因組成成，構(gòu)成一一個(gè)tra操縱子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW與性菌毛的的形成有關(guān)關(guān)traYZMIGD等與F因子的轉(zhuǎn)移移有關(guān)traG、traN影響雜交對(duì)對(duì)的配對(duì)形形成與否traI、traM決定DNA轉(zhuǎn)移起始traI編碼解旋酶酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA轉(zhuǎn)移；traY、traZ編碼的核酸酸內(nèi)切酶能能在轉(zhuǎn)移起起始區(qū)oriT上切開(kāi)一個(gè)個(gè)缺口。（1）轉(zhuǎn)移區(qū)(transferregion)復(fù)制區(qū)負(fù)責(zé)責(zé)F質(zhì)粒的自我我復(fù)制F質(zhì)粒自主復(fù)復(fù)制區(qū)為oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含含有復(fù)復(fù)制起起點(diǎn)。。F質(zhì)粒的的復(fù)制制是按按θ型方式式進(jìn)行行復(fù)制制，它它是一一種嚴(yán)嚴(yán)緊型型質(zhì)粒粒。F質(zhì)粒的的拷貝貝數(shù)能能被精精確地地控制制，一一個(gè)寄寄主細(xì)細(xì)胞約約有1~2個(gè)F質(zhì)粒。。rep（Freplicativeprotein）編碼一一組與與F質(zhì)粒復(fù)復(fù)制相相關(guān)的的蛋白白質(zhì)。。inc（incompatibility）基因產(chǎn)產(chǎn)物使使細(xì)胞胞具有有不相相容性性。（2）復(fù)制制區(qū)（（replicationregion）F質(zhì)粒插插入?yún)^(qū)區(qū)包含含4個(gè)插入入順序序：2個(gè)IS31個(gè)IS21個(gè)Tn1000（γδ）它們與與F質(zhì)粒的的整合合、切切除、、易位位有關(guān)關(guān)（3）插入入?yún)^(qū)（（insertionregion）2.F質(zhì)粒在在細(xì)胞胞內(nèi)的的存在在形式式根據(jù)大大腸桿桿菌細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)有無(wú)無(wú)F質(zhì)粒及及F質(zhì)粒在在細(xì)胞胞內(nèi)的的存在在狀態(tài)態(tài)可將將細(xì)胞胞分為為4種類(lèi)型型：F-、F+、Hfr、F’。F-：是細(xì)胞胞內(nèi)不不含F(xiàn)質(zhì)粒；；F+：是細(xì)胞胞內(nèi)含含有F質(zhì)粒且且獨(dú)立立染色色體外外；Hfr菌株(highfrequencyrecombinationstrain)：高頻重重組菌菌株：：是F質(zhì)粒整整合到到宿主主的染染色體體上，，隨著著宿主主染色色體的的復(fù)制制而復(fù)復(fù)制；；F’是指攜攜帶了了宿主主的一一部分分染色色體的的F質(zhì)粒。三、F質(zhì)粒與接合作作用1.F+×F-雜交有F質(zhì)粒的細(xì)胞在在形態(tài)學(xué)上可可以與F-明顯區(qū)別。除除了共有的大大量表面菌毛毛以外，F(xiàn)+還有少量（通通常在細(xì)胞對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中中只有1~3根）性菌毛。。纖細(xì)的蛋白白質(zhì)性菌毛有有的長(zhǎng)數(shù)毫米米，直徑約為為8nm。性菌毛在細(xì)細(xì)菌的接合過(guò)過(guò)程中起著十十分重要的作作用。2.Hfr×F-雜交Hfr菌株是怎樣形形成的呢?F質(zhì)粒有兩種方方式整合到染染色體上：同同源重組、質(zhì)質(zhì)粒和染色體體共有插入序序列和轉(zhuǎn)座子子。大腸桿菌菌染色體基因因組有7個(gè)IS1、13個(gè)IS2及6個(gè)IS3；F質(zhì)粒有1個(gè)IS2和2個(gè)IS3。3.F’’×F-雜交F質(zhì)粒在脫離Hfr細(xì)胞的染色體體時(shí)也會(huì)發(fā)生生差錯(cuò)，從而而形成帶有細(xì)細(xì)菌染色體基基因的F′質(zhì)粒。而F′因子又可通過(guò)過(guò)交換融合到到細(xì)菌染色體體的原來(lái)位置置上，回復(fù)到到原來(lái)的Hfr狀態(tài)。由于在F’×F-接合使用中能能專(zhuān)一性地向向F-轉(zhuǎn)移F′質(zhì)粒攜帶的供供體基因，因因而通過(guò)F′因子的轉(zhuǎn)移而而使受體菌改改變其遺傳性性狀，這種現(xiàn)現(xiàn)象也被稱(chēng)為為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。四、中斷雜交交試驗(yàn)和基因因定位中斷雜交：就是將兩個(gè)菌菌株（例如Hfra+strs×F-astrr）在培養(yǎng)液中中進(jìn)行通風(fēng)培培養(yǎng)，每隔一一定時(shí)間取樣樣，把菌液放放入組織搗碎碎器里攪拌以以中斷雜交，，經(jīng)過(guò)稀釋接接種到鑒別培培養(yǎng)基上，待待形成菌落后后鑒定它們的的基因型。1957年Wollman和Jacob首次進(jìn)行中斷斷雜交實(shí)驗(yàn)：：供體菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受體菌：F-strrthr?leu-azirtonrlac-gal-0azitonlacgalF0thrlactrphisthyargstrF282745616973Peptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasmidpCF10.(A)PeptidepheromonecCF10(triangles)isexpressedfromthechromosomeofbothplasmid-containingdonorcellsandplasmid-freerecipientcells.Inhibitorpeptide(stars)isexpressedfrompCF10andsecretedintothemediumtopreventpheromonefromthedonorcellfrominducingitself,probablythroughcompetitivebindingtothepheromonebindingproteinPrgZ.(B)PheromonefromanearbyrecipientcellisdetectedbyPrgZ.PrgZimportsthepeptidepheromoneusingthechromosomallyencodedOpp(Oligopeptidepermease)system.(C)ImportedcCF10inducesexpressionoftransfergenes,includingthecell–surfaceadhesinPrgB.(D)PrgBmediatesaggregationofthedonorandrecipientcells.Amatingchannelisthenformedandsingle-strandedpCF10istransferredtothedonorcellviaarollingcirclemechanism.AfterpCF10hasestablisheditselfintherecipientcell,theinhibitorpeptideandanothermechanismofnegativecontrol,PrgY,isexpressedtopreventself-inductionbyendogenouscCF10.第三節(jié)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬噬菌體為媒媒介，將供供體菌的部部分DNA轉(zhuǎn)移到受體體菌內(nèi)的現(xiàn)現(xiàn)象。因?yàn)闉榻^大多數(shù)數(shù)細(xì)菌都有有噬菌體，，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)作用較普普遍。另外外，轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA位于噬菌體體蛋白外殼殼內(nèi)，不易易被外界的的DNA水解酶所破破壞，所以以比較穩(wěn)定定。局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)：被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段僅僅是是那些靠近近染色體上溶源化化位點(diǎn)的基基因轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)：任何供體的的染色體都都可以轉(zhuǎn)移移至受體細(xì)細(xì)胞1952年Lederberg和他的學(xué)生生Zinder把鼠傷寒沙沙門(mén)菌的一一個(gè)突變菌菌株LT22(trp-)和另一個(gè)突突變菌株LT2(his-)在基本培養(yǎng)養(yǎng)基上進(jìn)行行混合培養(yǎng)養(yǎng)，結(jié)果在在107細(xì)胞中得到到大約100個(gè)原養(yǎng)型菌菌落。一、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開(kāi)U形管實(shí)驗(yàn)①可過(guò)濾因子子并不由于于DNA酶的處理而而失活；②可過(guò)濾濾因子和從從溶源性的的LT22菌株得來(lái)的的噬菌體(稱(chēng)為P22)具有相同的的大小和質(zhì)質(zhì)量；③可過(guò)濾濾因子加熱熱后失活，，用抗P22血清清處處理理后后也也失失活活；；④把把P22與LT2和LT22菌株株分分別別混混合合培培養(yǎng)養(yǎng)，，在在基基本本培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上不不出出現(xiàn)現(xiàn)原原養(yǎng)養(yǎng)型型菌菌落落。。結(jié)果果證證實(shí)實(shí)了了可可過(guò)過(guò)濾濾因因子子是是溫溫和和噬噬菌菌體體P22。這這就就是是最最早早發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)現(xiàn)現(xiàn)象象。通過(guò)過(guò)一一系系列列的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)，，證證實(shí)實(shí)可可過(guò)過(guò)濾濾因因子子具具有有下下列列一一些些特特性性：：轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)過(guò)過(guò)程程中中有有三三個(gè)個(gè)組組成成部部分分，，即即供體體、、噬噬菌菌體體和和受受體體。這這種種導(dǎo)導(dǎo)致致基基因因重重組組的的方方式式不不同同于于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化，，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化需需要要供供體體DNA和受體細(xì)細(xì)胞接觸觸，而轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)則是是以噬菌菌體為媒媒介將供供體遺傳傳物質(zhì)傳傳給受體體，無(wú)需需DNA和受體細(xì)細(xì)胞接觸觸。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分分為普遍性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)和局局限性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)，普遍性性轉(zhuǎn)導(dǎo)又又可分為為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)和流產(chǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。二、普遍遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)1.完全轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)P1供體收收集子代代噬菌體體菌苔計(jì)數(shù)數(shù)噬菌體體（完全培培養(yǎng)基））受體（缺陷型型大腸桿桿菌）選出重組組子（轉(zhuǎn)導(dǎo)子子）（基本培培養(yǎng)基））侵染裂裂解侵侵染野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率率=轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)數(shù)×100%=轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)數(shù)×100%侵染受體體的P1顆粒數(shù)噬噬菌斑斑數(shù)+轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)數(shù)2.流產(chǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)3.普遍性性轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)在遺遺傳學(xué)學(xué)和分分子生生物學(xué)學(xué)研究究中的的應(yīng)用用(1)共轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)：普遍性性轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)的重重要應(yīng)應(yīng)用之之一是是通過(guò)過(guò)測(cè)定定共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的的頻率率進(jìn)行行基因因定位位，所所謂共轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)(cotransduction)是指兩兩個(gè)處處在一一個(gè)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)片片段上上的基基因一一起整整合進(jìn)進(jìn)受體體染色色體中中。被共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的的兩個(gè)個(gè)基因因之間間的距距離不不能超超過(guò)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬噬菌體體所能能包裝裝的DNA長(zhǎng)度，，而且且越是是緊密密連鎖鎖的基基因其其共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)頻頻率也也越高高。F為共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)頻頻率，，d為基因因間距距離，，L為轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)片段段長(zhǎng)度度（這這里指指噬菌菌體基基因組組長(zhǎng)度度，用用分鐘鐘表示示）F=(1－d/L)3d=L(1－3√F)以thr+leu+為供體，以以thr-leu-為受體的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，，得到1%的thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，計(jì)計(jì)算thr和leu之間的遺傳傳圖距。（（P1噬菌體基因因組約為大大腸桿菌染染色體長(zhǎng)度度的2.4%）d=2.4×(1－3√0.01)=2.4×(1-0.215)=1.883(2)三點(diǎn)雜交法法：P1噬菌體所進(jìn)進(jìn)行的共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)被廣泛泛應(yīng)用于大大腸桿菌的的基因定位位中。1955年Lennox用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)寄主大腸腸桿菌染色色體，研究究基因連鎖鎖關(guān)系時(shí)發(fā)發(fā)現(xiàn)，thr和leu有時(shí)能、有有時(shí)不能與與第三個(gè)基基因ara共轉(zhuǎn)導(dǎo)。他用P1噬菌體感染染供體(thr+leu+ara+)，用所得到到的噬菌體裂解液去去感染受體體菌(thr-leu-ara-)，得到的結(jié)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)1可知：ara基因與leu基因靠得較較近，而與與thr基因相距較較遠(yuǎn)，排列列順序應(yīng)是是thr-ara-leu或thr-leu-ara。如果是前一一種情況，，則thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該該大多數(shù)含含有ara+基因；如果是后后一種形式式，則thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該該很少含有有是ara+，或者根本本沒(méi)有。而由實(shí)驗(yàn)2可知，thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子同時(shí)時(shí)又是ara+的占85％，所以上上述3個(gè)基因的排排列順序是是第1種。三、局限性性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransduction)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)：是指以噬菌菌體為媒介介，只能將將供體菌特特定的一個(gè)個(gè)或幾個(gè)基因轉(zhuǎn)移到受體體菌中的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。。導(dǎo)致局限性性轉(zhuǎn)導(dǎo)的一一般都是溫溫和噬菌體體，它們?cè)谠诠w菌染染色體上具具有特定的的整合位點(diǎn)點(diǎn)。在某些些條件下，，當(dāng)這種整整合狀的原原噬菌體脫離寄寄主染色色體時(shí)，，偶爾會(huì)會(huì)將整合合位點(diǎn)兩兩端相鄰鄰的基因錯(cuò)誤地切切離下來(lái)來(lái)，并組組裝到噬噬菌體顆顆粒中。。當(dāng)這種種噬菌體體感染另另一細(xì)菌菌時(shí)，就就將原寄寄主的基因轉(zhuǎn)移到另另一細(xì)菌菌中。1高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)的原理理不正常環(huán)環(huán)出形成成特殊性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒粒這種缺陷陷噬菌體亦是轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)噬菌體，它具有感感染能力力，能整整合到寄寄主染色色體相同同的位點(diǎn)點(diǎn)上形成成穩(wěn)定的的轉(zhuǎn)導(dǎo)子子。所得轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)子的頻頻率約為為10-6，稱(chēng)為低低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)。當(dāng)攜帶有g(shù)al基因的λ缺陷噬菌菌體和正正常的λ噬菌體在在同一細(xì)細(xì)胞時(shí)，，正常λ噬菌體整整合到寄主的染色體體上后，，產(chǎn)生兩個(gè)雜合合(細(xì)菌/噬菌體)att位點(diǎn)，λdgal缺陷噬菌菌體就可可以整合合到該位位點(diǎn)上。。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)子的形形成雜基因子子重組性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)再次整合合導(dǎo)致溶溶源性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)正常λ噬菌體幫助λdgal缺陷噬菌菌體整合合和繁殖殖，因此此被稱(chēng)為為助手噬菌菌體（helperphage）。這種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子不不穩(wěn)定，，因?yàn)樵删w體很容易易被誘導(dǎo)導(dǎo)切離下下來(lái)。在這種切切離的裂裂解物中中，有一一半是正正常λ噬菌體，，另一半半為λdgal缺陷噬菌菌體。如如果用這這種裂解解物去轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)另一一個(gè)Gal-菌株，其其轉(zhuǎn)化頻頻率理論論上可達(dá)達(dá)50%，所以也也稱(chēng)之為為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)。CRISPR結(jié)結(jié)構(gòu)及作作用機(jī)理理CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)為規(guī)規(guī)律律成成簇簇間間隔隔短短回回文文重重復(fù)復(fù)，，是是一一類(lèi)類(lèi)廣廣泛泛分分布布于于細(xì)細(xì)菌菌和和古古菌菌基基因因組組中中的的重重復(fù)復(fù)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)。CRISPR通過(guò)過(guò)與與一一系系列列相相關(guān)關(guān)蛋蛋白白、、前前導(dǎo)導(dǎo)序序列列一一起起，，為為原原核核生生物物提提供供對(duì)對(duì)抗抗噬噬菌菌體體等等外外源源基基因因的的獲獲得得性性免免疫疫能能力力。這種結(jié)構(gòu)最早早于1987年在大腸桿桿菌(Escherichiacoli)K12的iap基因側(cè)翼序列列中被發(fā)現(xiàn)，，后來(lái)，科學(xué)學(xué)家利用這個(gè)個(gè)小片段找到到了一種操作作簡(jiǎn)單、可對(duì)對(duì)多種生物的的基因組進(jìn)行行遺傳改造的的工具——CRISPR—Cas系統(tǒng)。后續(xù)的遺傳學(xué)學(xué)試驗(yàn)和生物物化學(xué)試驗(yàn)也也證實(shí)，這些些CRISPR序列與很多病病毒或者質(zhì)粒粒的DNA序列是互補(bǔ)的的，很有可能能是生物體抵抵御病毒等外外來(lái)人侵者的的一套特異性性防御機(jī)制，，就像是另外外一套適應(yīng)性性免疫反應(yīng)系系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)基本結(jié)結(jié)構(gòu)CRISPR系統(tǒng)由前導(dǎo)序序列（leadersequence，LS）、CRISPR基因座座以及一系列列Cas（CRISPR--associated）蛋白組成。Leader序列：Leader序列前導(dǎo)序列列由300～500bp堿基組成，位位于CRISPR的5’端，與第一個(gè)個(gè)重復(fù)序列直直接相連，是是一段在物種種內(nèi)相對(duì)保守守的AT富集的區(qū)域。。有研究表明明前導(dǎo)序列是是新插入序列列的識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)，也有研究究指出，它能能夠作為啟動(dòng)動(dòng)子，啟動(dòng)CRISPR基因座的轉(zhuǎn)錄錄。CRISPR基因座：CRISPR基因座由簡(jiǎn)簡(jiǎn)短穩(wěn)定的同同向重復(fù)序列列(directrepect，，DR)和長(zhǎng)長(zhǎng)度相近的非非重復(fù)的間隔隔序列(spacer)間隔排列而而成，稱(chēng)為R-S結(jié)構(gòu)。。其中重復(fù)序序列的片段長(zhǎng)長(zhǎng)度在21～～48b，且且含有5～7bp的回回文序列，通通常能形成穩(wěn)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)結(jié)構(gòu)，間隔序序列的長(zhǎng)度在在26～72bp，可可能來(lái)源于噬噬菌體、質(zhì)粒粒等外源DNA序列。Cas基因：cas基因是存在于于CRISPR位點(diǎn)附近近的一系列基基因，cas基因簇通常由由4～10個(gè)個(gè)保守基因組組成，它表達(dá)達(dá)出的cas蛋白對(duì)CRISPR防御御機(jī)制的實(shí)現(xiàn)現(xiàn)不可或缺。。cas基因根據(jù)其保保守程度可分分為核心cas基因、亞型特特異性cas基因和重復(fù)序序列相關(guān)未知知蛋白(repeat．．a(chǎn)ssociatedmysteriousproteins，RAMP)組件件基因。cas1～6基因廣廣泛存在于各各種CRISPR亞型中中，故被稱(chēng)為為核心cas基因，其編碼碼蛋白的功能能現(xiàn)已初步得得到證實(shí)，例例如，Casl和Cas2蛋白在所有有CRISPR類(lèi)型中均均存在，主要要在獲取新的的重復(fù)序列過(guò)過(guò)程中發(fā)揮作作用，Cas3則具有核酸酸酶和解旋酶酶的功能，主主要作用是剪剪切目標(biāo)基因因。CRISPR的工作原理理當(dāng)細(xì)菌抵御噬噬菌體等外源源DNA入侵侵時(shí)，在前導(dǎo)導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下下CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的的RNA前體體(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，，然后加工成成一系列短的的