醫(yī)學課件抗人球蛋白試驗

Coombs試驗是利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細胞凝集。抗人球法是檢測不完全抗體的經(jīng)典方法，其方法有兩類。直接Coombs試驗：是檢查被檢紅細胞上有無不完全抗體。間接Coombs試驗：是檢查血清中游離的不完全抗體Coombs試驗是利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細胞1天然抗體與免疫血型抗體比較天然抗體免疫血型抗體性質(zhì)完全抗體不完全抗體IgIgMIgG抗原刺激沒有可察覺的抗原刺激經(jīng)抗原刺激后才產(chǎn)生免疫發(fā)生的時間早期晚期分子量90萬15萬分子長度950250沉淀系數(shù)19S7S電泳分析IgM球蛋白IgG球蛋白對HDN的意義＊小大通過胎盤能力＊不能能反應溫度＊4℃比37℃強（冷抗體）37℃（溫抗體）對血型物質(zhì)＊能被血型物質(zhì)中和不被中和天然抗體與免疫血型抗體比較天然抗體免疫血型抗體性質(zhì)完全抗體2

IgM抗體

免疫球蛋白中8%-10%是由IgM組成IgM抗體分子量大，約為90萬，有十個抗原結(jié)合位點，可直接致敏和凝集紅細胞，它的平均壽命為10天，IgM抗原抗體反應中常激活補體，從而引起溶血反應。IgM抗體3IgM抗體在鹽水介質(zhì)中凝集紅細胞示意圖IgM抗體在鹽水介質(zhì)中凝集紅細胞示意圖4

IgG抗體IgG是體液免疫應答產(chǎn)生的主要抗體，在血清中含量最高。約占免疫球蛋白的75%。IgG是唯一的能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)的免疫球蛋白，同種IgG血型抗體通過胎盤，可引起新生兒溶血病。最常見的是ABO與Rh血型系統(tǒng)。IgG抗體5IgG凝集紅細胞示意圖

IgG在鹽水介質(zhì)中一般不產(chǎn)生凝集IgG凝集紅細胞示意圖IgG在鹽水介質(zhì)中一般不產(chǎn)生6抗球蛋白試驗抗球蛋白抗球蛋白試驗抗球蛋白7試劑及器材1、多特異性抗球蛋白試劑（lgG、C3d）；2、柱凝集抗人球卡；3、陽性對照細胞（取3份正常人O型Rh（D）陽性紅細胞等量混勻，經(jīng)生理鹽水洗滌后取少量壓積紅細胞，加抗D血清，置37℃水浴致敏1小時，取出后用生理鹽水洗滌3次，配成5%紅細胞懸液）；4、陰性對照細胞（取3份正常人O型紅細胞等量混勻，經(jīng)生理鹽水洗滌后，配成5%紅細胞懸液；或直接取Rh（D）陰性紅細胞）；5、受檢者5%（1%）紅細胞懸液；6、0.9%生理鹽水；7、柱凝集卡式配血系統(tǒng)8、滴管（加樣槍）、蠟筆或記號筆、試管、顯微鏡、37℃水浴箱、細胞洗滌離心機等。試劑及器材1、多特異性抗球蛋白試劑（lgG、C3d）；8直接抗球蛋白試驗（DAT）直接抗球蛋白試驗9原理患者體內(nèi)若有與紅細胞抗原不相合的不完全抗體存在，可與紅細胞結(jié)合形成抗原抗體復合物。但因不完全抗體分子量小，不能有效地連接抗原抗體復合物，僅使紅細胞處于致敏狀態(tài)。加入抗球蛋白血清，與紅細胞上吸咐的不完全抗體結(jié)合，在致敏紅細胞之間搭橋，出現(xiàn)肉眼可見的凝集。這種直接檢測體內(nèi)被抗體或（和）補體致敏紅細胞的試驗稱之為直接抗球蛋白試驗。原理患者體內(nèi)若有與紅細胞抗原不相合的不完全抗體存在，可與紅細10直接Coombs試驗抗人球蛋白自身抗體致敏RBC可見凝集直接Coombs試驗抗人球蛋白自身抗體致敏RBC可見凝集11手工法操作1、取患者抗凝全血適量于試管中，加生理鹽水洗滌3次，最后一次洗滌離心后，棄上清液，用生理鹽水配成5%紅細胞懸液；2、取3支試管，作好標記（患者、陽性、陰性）；3、取患者5%紅懸液1滴于試管中，加生理鹽水洗滌一次；盡可能棄凈上清液；4、在陽、陰性試管中分別加入陽性和陰性對照紅懸液1滴；5、在各管中滴加多特異性抗球蛋白試劑1滴，混勻；6、同時以1000r/min離心1分鐘，輕輕搖動，先用肉眼觀察管底紅細胞的凝集，再用低倍鏡觀察手工法操作1、取患者抗凝全血適量于試管中，加生理鹽水洗滌312柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好標記（患者、陽性、陰性）。2、分別加入1%被檢紅懸、陽性紅懸、陰性紅懸各50ul。3、不孵育，將卡放入專用離心機離心。4、取出凝集Coombs卡，觀察試驗結(jié)果。柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好13DAT操作表反應物檢測管陽性對照陰性對照被檢紅細胞懸液1滴陽性紅細胞懸液1滴陰性紅細胞懸液1滴抗人球蛋白試劑1滴1滴1滴DAT操作表反應物檢測管陽性對照陰性對照被檢紅細胞懸14微柱卡Coombs試驗RBC可免洗滌因為RBC的密度遠大于血清中的球蛋白，當離心時，RBC的沉降速率遠大于球蛋白，故RBC首先和凝膠中的抗人球蛋白反應，而不受血清中的球蛋白干擾，從而可免除洗滌這一步驟。微柱卡Coombs試驗RBC可免洗滌因為RBC的密度遠大于血15結(jié)果判斷先觀察陰性和陽性對照管，陰性對照管無凝集，陽性對照管出現(xiàn)+++—++++凝集，說明檢測管結(jié)果可信。被檢測管凝集，直接抗球蛋白試驗陽性，不凝集者為陰性。如果實驗結(jié)果為陰性，要加陽性細胞檢測，結(jié)果為陽性，說明該陰性結(jié)果可靠。結(jié)果判斷先觀察陰性和陽性對照管，陰性對照管無凝集，陽性對照管16柱凝集判斷標準柱凝集判斷標準17間接Coombs試驗（IAT）間接Coombs試驗18原理用已知抗原的紅細胞檢測受檢者血清中相應的不完全抗體；或用已知的不完全抗體檢測紅細胞上相應的抗原。在37℃條件下，若被檢血清或紅細胞有對應的不完全抗體或抗原，則抗原抗體作用使紅細胞致敏再加抗人球蛋白試劑，與紅細胞上不完全抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見凝集。這種通過體外將紅細胞致敏后，再檢測紅細胞有無不完全抗體或抗原的試驗稱為間接抗人球蛋白試驗。原理用已知抗原的紅細胞檢測受檢者血清中相應的不完全抗體；或用19間接Coombs試驗抗人免疫球蛋白同種異型抗體間接Coombs試驗抗人免疫球蛋白同種異型抗體20手工法操作取被檢血清200ul于試管中，加入等量5%已知抗原紅懸液（或被檢5%紅懸液加入等量已知抗體血清），置37℃水浴1小時。如血清與紅細胞存在相應特異性抗原抗體，則會使紅細胞致敏。取出試管，用生理鹽水洗滌后，參照直接Coombs試驗方法操作。實驗結(jié)果為陽性，說明受檢者血清中有與已知紅細胞抗原相對應的不完全抗體（或被檢者紅細胞上有與已知抗體相對應的抗原手工法操作取被檢血清200ul于試管中，加入等量5%已知抗21柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好標記（患者、陽性、陰性）。2、在患者孔中加入被檢血清和1%已知抗原紅懸液各50ul（或加入已知抗體血清和1%待檢抗原紅懸液各50ul）3、在陽性、陰性孔中加入相應1%紅懸液50ul4、同時放入專用孵育器孵育5、取出用專用離心機離心。6、實驗結(jié)果同手工法柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好22Coombs’試驗臨床意義正常人Coombs試驗直接與間接試驗均為陰性本試驗是診斷自身免疫性溶血性貧血(AIHA)的重要依據(jù)，特別是IgG型引起的溶血性貧血，直接反應常呈強陽性，間接反應大多陰性，但亦可陽性新生兒同種免疫溶血病：因Rh血型不合所致溶血病，直接及間接反應均強陽性，持續(xù)數(shù)周、換血輸血后數(shù)天內(nèi)可變?yōu)殛幮裕捎凇癆BO”血型不合引起的溶血病，直接常為陰性或弱陽性，間接反應為陽性Coombs’試驗臨床意義正常人Coombs試驗直接與間接試23藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血①α-甲基多巴型：直接及間接反應均陽性。②青霉素型：直接反應陽性，間接反應陰性③福阿亭型：（奎寧等藥物）抗體通常為IgM，偶有IgG型者，直接反應為陽性，間接反應陰性冷凝集素綜合征：直接反應陽性，間接反應陰性（37℃）。由于本病紅細胞膜附著的是補體C4和C3而不是IgG或IgM，如果用抗IgG或抗IgM抗血清做試驗時則結(jié)果陰性，如以抗補體的抗血清做試驗則直接反應陽性。藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血24紅細胞血型不合引起的輸血反應ABO或Rh血型不合輸血，供者的紅細胞被受者的血型抗體致敏，在供者被致敏的紅細胞完全破壞以前，直接反應陽性Rh陰性者如過去不曾接受過Rh陽性者的血或曾沒有妊娠Rh陽性胎兒者，間接反應陽性，第一次輸血后（Rh陽性的血），數(shù)天之內(nèi)間接反應也會變?yōu)殛栃约t細胞血型不合引起的輸血反應25其它：在傳染性單核細胞增多癥、SLE、惡性淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、癌腫、鉛中毒、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、EVan氏綜合征等，病人直接反應亦可陽性陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿癥患者中，急性發(fā)作后用抗補體血清做試驗直接反應常為陽性。其它：26注意事項標本采取后應立即進行試驗，延遲試驗或中途停止可使抗體從細胞中丟失?？骨虻鞍自噭凑f明書最適稀釋度使用，否則可產(chǎn)生帶現(xiàn)象而誤認結(jié)果。本試驗必須設陽性對照、陰性對照。如陽性對照管不凝集，說明抗D血清失效或抗人球蛋白血清失效，應更換血清，重作試驗；若陰性對照出現(xiàn)凝集，可能由于抗人球蛋白血清中含有殘余種屬抗體，或被細菌污染；本實驗均失去意義，不能判斷結(jié)果。注意事項標本采取后應立即進行試驗，延遲試驗或中途停止可使抗體27如血清與相應紅細胞在37℃水浴中致敏1小時，則血清中75%的抗體吸附于紅細胞上，如致敏2小時，則抗體吸附達95%，如以低離子溶液代替生理鹽水配制5%紅細胞懸液，則致敏時間可減少至15～30分鐘紅細胞洗滌應迅速，徹底、不應中途停止。受檢紅細胞一定要用鹽水洗滌3次以上，洗滌時鹽水要足量并用力沖入管底，使壓積于管底的紅細胞松離，以除去紅細胞懸液中混雜的血清蛋白，要防止手上的蛋白污染。1滴1：4000稀釋的血清可中和抗球蛋白血清1滴，導致假陰性結(jié)果。如血清與相應紅細胞在37℃水浴中致敏1小時，則血清中75%的28全凝集或冷凝集血液標本及含有Wharton膠的臍血標本，若洗滌不充分，血液標本中有很多網(wǎng)織紅細胞，且抗球蛋白試劑中含有抗運鐵蛋白時，均可使紅細胞發(fā)生凝集如結(jié)果為陰性，最好對陰性結(jié)果進行核實，即在該試管中再加一滴lgG致敏紅細胞，如結(jié)果為陽性，則表示試管內(nèi)的抗球蛋白試劑未被消耗，陰性結(jié)果可靠。全凝集或冷凝集血液標本及含有Wharton膠的臍血標本，若洗29Coombs試驗是利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細胞凝集?？谷饲蚍ㄊ菣z測不完全抗體的經(jīng)典方法，其方法有兩類。直接Coombs試驗：是檢查被檢紅細胞上有無不完全抗體。間接Coombs試驗：是檢查血清中游離的不完全抗體Coombs試驗是利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細胞30天然抗體與免疫血型抗體比較天然抗體免疫血型抗體性質(zhì)完全抗體不完全抗體IgIgMIgG抗原刺激沒有可察覺的抗原刺激經(jīng)抗原刺激后才產(chǎn)生免疫發(fā)生的時間早期晚期分子量90萬15萬分子長度950250沉淀系數(shù)19S7S電泳分析IgM球蛋白IgG球蛋白對HDN的意義＊小大通過胎盤能力＊不能能反應溫度＊4℃比37℃強（冷抗體）37℃（溫抗體）對血型物質(zhì)＊能被血型物質(zhì)中和不被中和天然抗體與免疫血型抗體比較天然抗體免疫血型抗體性質(zhì)完全抗體31

IgM抗體

免疫球蛋白中8%-10%是由IgM組成IgM抗體分子量大，約為90萬，有十個抗原結(jié)合位點，可直接致敏和凝集紅細胞，它的平均壽命為10天，IgM抗原抗體反應中常激活補體，從而引起溶血反應。IgM抗體32IgM抗體在鹽水介質(zhì)中凝集紅細胞示意圖IgM抗體在鹽水介質(zhì)中凝集紅細胞示意圖33

IgG抗體IgG是體液免疫應答產(chǎn)生的主要抗體，在血清中含量最高。約占免疫球蛋白的75%。IgG是唯一的能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)的免疫球蛋白，同種IgG血型抗體通過胎盤，可引起新生兒溶血病。最常見的是ABO與Rh血型系統(tǒng)。IgG抗體34IgG凝集紅細胞示意圖

IgG在鹽水介質(zhì)中一般不產(chǎn)生凝集IgG凝集紅細胞示意圖IgG在鹽水介質(zhì)中一般不產(chǎn)生35抗球蛋白試驗抗球蛋白抗球蛋白試驗抗球蛋白36試劑及器材1、多特異性抗球蛋白試劑（lgG、C3d）；2、柱凝集抗人球卡；3、陽性對照細胞（取3份正常人O型Rh（D）陽性紅細胞等量混勻，經(jīng)生理鹽水洗滌后取少量壓積紅細胞，加抗D血清，置37℃水浴致敏1小時，取出后用生理鹽水洗滌3次，配成5%紅細胞懸液）；4、陰性對照細胞（取3份正常人O型紅細胞等量混勻，經(jīng)生理鹽水洗滌后，配成5%紅細胞懸液；或直接取Rh（D）陰性紅細胞）；5、受檢者5%（1%）紅細胞懸液；6、0.9%生理鹽水；7、柱凝集卡式配血系統(tǒng)8、滴管（加樣槍）、蠟筆或記號筆、試管、顯微鏡、37℃水浴箱、細胞洗滌離心機等。試劑及器材1、多特異性抗球蛋白試劑（lgG、C3d）；37直接抗球蛋白試驗（DAT）直接抗球蛋白試驗38原理患者體內(nèi)若有與紅細胞抗原不相合的不完全抗體存在，可與紅細胞結(jié)合形成抗原抗體復合物。但因不完全抗體分子量小，不能有效地連接抗原抗體復合物，僅使紅細胞處于致敏狀態(tài)。加入抗球蛋白血清，與紅細胞上吸咐的不完全抗體結(jié)合，在致敏紅細胞之間搭橋，出現(xiàn)肉眼可見的凝集。這種直接檢測體內(nèi)被抗體或（和）補體致敏紅細胞的試驗稱之為直接抗球蛋白試驗。原理患者體內(nèi)若有與紅細胞抗原不相合的不完全抗體存在，可與紅細39直接Coombs試驗抗人球蛋白自身抗體致敏RBC可見凝集直接Coombs試驗抗人球蛋白自身抗體致敏RBC可見凝集40手工法操作1、取患者抗凝全血適量于試管中，加生理鹽水洗滌3次，最后一次洗滌離心后，棄上清液，用生理鹽水配成5%紅細胞懸液；2、取3支試管，作好標記（患者、陽性、陰性）；3、取患者5%紅懸液1滴于試管中，加生理鹽水洗滌一次；盡可能棄凈上清液；4、在陽、陰性試管中分別加入陽性和陰性對照紅懸液1滴；5、在各管中滴加多特異性抗球蛋白試劑1滴，混勻；6、同時以1000r/min離心1分鐘，輕輕搖動，先用肉眼觀察管底紅細胞的凝集，再用低倍鏡觀察手工法操作1、取患者抗凝全血適量于試管中，加生理鹽水洗滌341柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好標記（患者、陽性、陰性）。2、分別加入1%被檢紅懸、陽性紅懸、陰性紅懸各50ul。3、不孵育，將卡放入專用離心機離心。4、取出凝集Coombs卡，觀察試驗結(jié)果。柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好42DAT操作表反應物檢測管陽性對照陰性對照被檢紅細胞懸液1滴陽性紅細胞懸液1滴陰性紅細胞懸液1滴抗人球蛋白試劑1滴1滴1滴DAT操作表反應物檢測管陽性對照陰性對照被檢紅細胞懸43微柱卡Coombs試驗RBC可免洗滌因為RBC的密度遠大于血清中的球蛋白，當離心時，RBC的沉降速率遠大于球蛋白，故RBC首先和凝膠中的抗人球蛋白反應，而不受血清中的球蛋白干擾，從而可免除洗滌這一步驟。微柱卡Coombs試驗RBC可免洗滌因為RBC的密度遠大于血44結(jié)果判斷先觀察陰性和陽性對照管，陰性對照管無凝集，陽性對照管出現(xiàn)+++—++++凝集，說明檢測管結(jié)果可信。被檢測管凝集，直接抗球蛋白試驗陽性，不凝集者為陰性。如果實驗結(jié)果為陰性，要加陽性細胞檢測，結(jié)果為陽性，說明該陰性結(jié)果可靠。結(jié)果判斷先觀察陰性和陽性對照管，陰性對照管無凝集，陽性對照管45柱凝集判斷標準柱凝集判斷標準46間接Coombs試驗（IAT）間接Coombs試驗47原理用已知抗原的紅細胞檢測受檢者血清中相應的不完全抗體；或用已知的不完全抗體檢測紅細胞上相應的抗原。在37℃條件下，若被檢血清或紅細胞有對應的不完全抗體或抗原，則抗原抗體作用使紅細胞致敏再加抗人球蛋白試劑，與紅細胞上不完全抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見凝集。這種通過體外將紅細胞致敏后，再檢測紅細胞有無不完全抗體或抗原的試驗稱為間接抗人球蛋白試驗。原理用已知抗原的紅細胞檢測受檢者血清中相應的不完全抗體；或用48間接Coombs試驗抗人免疫球蛋白同種異型抗體間接Coombs試驗抗人免疫球蛋白同種異型抗體49手工法操作取被檢血清200ul于試管中，加入等量5%已知抗原紅懸液（或被檢5%紅懸液加入等量已知抗體血清），置37℃水浴1小時。如血清與紅細胞存在相應特異性抗原抗體，則會使紅細胞致敏。取出試管，用生理鹽水洗滌后，參照直接Coombs試驗方法操作。實驗結(jié)果為陽性，說明受檢者血清中有與已知紅細胞抗原相對應的不完全抗體（或被檢者紅細胞上有與已知抗體相對應的抗原手工法操作取被檢血清200ul于試管中，加入等量5%已知抗50柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好標記（患者、陽性、陰性）。2、在患者孔中加入被檢血清和1%已知抗原紅懸液各50ul（或加入已知抗體血清和1%待檢抗原紅懸液各50ul）3、在陽性、陰性孔中加入相應1%紅懸液50ul4、同時放入專用孵育器孵育5、取出用專用離心機離心。6、實驗結(jié)果同手工法柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室溫平衡并做好51Coombs’試驗臨床意義正常人Coombs試驗直接與間接試驗均為陰性本試驗是診斷自身免疫性溶血性貧血(AIHA)的重要依據(jù)，特別是IgG型引起的溶血性貧血，直接反應常呈強陽性，間接反應大多陰性，但亦可陽性新生兒同種免疫溶血?。阂騌h血型不合所致溶血病，直接及間接反應均強陽性，持續(xù)數(shù)周、換血輸血后數(shù)天內(nèi)可變?yōu)殛幮?，由于“ABO”血型不合引起的溶血病，直接常為陰性或弱陽性，間接反應為陽性Coombs’試驗臨床意義正常人Coombs試驗直接與間接試52藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血①α-甲基多巴型：直接及間接反應均陽性。②青霉素型：直接反應陽性，間接反應陰性③福阿亭型：（奎寧等藥物）抗體通常為IgM，偶有IgG型者，直接反應為陽性，間接反應陰性冷凝集素綜合征：直接反應陽性，間接反應陰性（37℃）。由于本病紅細胞膜附著的是補體C4和C3而不是IgG或IgM，如果用抗IgG或抗IgM抗血清做試驗時則結(jié)果陰性，如以抗補體的抗血清做試驗則直接反應陽性。藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血53紅細胞血型不合引起的輸血反應ABO或Rh血型不合輸血，供者的紅細胞被受者的血型抗體致敏，在供