2013分子生物學(xué)-3 -3 .質(zhì)粒及基因工程

病毒基因組核基因組原核生物基因組真核生物基因組線粒體DNA核外遺傳物質(zhì)葉粒體DNA質(zhì)粒DNA非獨(dú)立的基因組：轉(zhuǎn)位因子—能在基因組DNA中移動(dòng)的DNA序列，不能獨(dú)立存在，需插入核或核外DNA中。DNAdetective探針1.RFLP2.SSR/STR3.SNP應(yīng)用：正常樣本的差異鑒定病理樣本的變化DNA條形碼（DNAbarcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。2003年，加拿大動(dòng)物學(xué)家PaulHebert最早提出對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。及物種間親緣關(guān)系，修改已有的分類學(xué)結(jié)論等。CO1基因位于細(xì)胞線粒體中，只能從母體中遺傳，線粒體DNA積聚突變的速度比核DNA快10倍。DNAbarcodingPotentialefficacyofmitochondrialgenesforanimalDNAbarcoding:acasestudyusingeutherianmammals.LuoA,etal.BMCGenomics.2011Jan28;12:84.植物條形碼rbcL+matK+ITSComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatinternaltranscribedspacer(ITS)shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.LiDZ,etal.PNAS.2011Dec6;108(49):19641-6.Dr.&Prof.De-ZhuLi(李德銖)Dr.&Prof.PaulHebert核外遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能

多數(shù)質(zhì)粒是雙鏈超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀cccDNA，（covalentlyclosedandcircular）質(zhì)粒DNAPlasmid

1.存在于原核生物、真菌和少數(shù)植物細(xì)胞中，是一種核外遺傳物質(zhì)，但不是細(xì)胞生存所必需的；2.質(zhì)粒DNA含有少量編碼蛋白的基因，這些基因?qū)λ拗骷?xì)胞的生存影響不大，但能改變細(xì)胞的某些性狀，如抗性、降解有機(jī)物的酶等3.有自己的復(fù)制起始序列，獨(dú)立于核DNA進(jìn)行復(fù)制；（有獨(dú)立的復(fù)制系統(tǒng)）質(zhì)粒是分子生物學(xué)中最常見的克隆載體Vector,Vehicle

質(zhì)粒的特性1.質(zhì)粒具有可轉(zhuǎn)移性，如F質(zhì)粒；2.可整合性；（整合、重組DNA的交換）3.拷貝數(shù)；嚴(yán)緊型（一個(gè)或幾個(gè)）據(jù)細(xì)胞中質(zhì)粒的多少松弛型（十~幾十）4.質(zhì)粒DNA的不相容性patibility在同一個(gè)宿主細(xì)胞中，不能同時(shí)存在兩種同一不相容群的質(zhì)粒（同一類型、同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能同時(shí)存在于同一細(xì)胞中，但兩種不同類型的質(zhì)?？纱嬖谟谕患?xì)胞中。）復(fù)制時(shí)間/效率

幾種常見的質(zhì)粒1.細(xì)菌質(zhì)粒F—質(zhì)粒（又稱F-因子或性質(zhì)粒sexplasmid）高頻重組質(zhì)粒，具可轉(zhuǎn)移性和整合性，拷貝數(shù)低；R—質(zhì)?？剐再|(zhì)粒，含抗藥、分解有毒物質(zhì)等的基因；Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）含有編碼控制大腸桿菌素合成的基因，（一種可以使不帶Col質(zhì)粒的細(xì)菌菌株致死的蛋白）F質(zhì)粒（1）F+菌株（2）F-菌株（3）Hfr菌株（4）F’菌株Rplasmid

2.酵母質(zhì)粒2u質(zhì)粒雙鏈環(huán)狀DNA，周長(zhǎng)2um，6318bp3u質(zhì)粒環(huán)狀DNA，周長(zhǎng)3um線狀殺傷質(zhì)粒RNA質(zhì)粒，線狀，能分泌一種殺傷因子，對(duì)其他酵母有殺傷作用，以保護(hù)自身。3.真菌質(zhì)粒有線狀，也有環(huán)狀，有的能整合到線粒體中，有的與菌絲的衰老有關(guān)。4.植物中的質(zhì)粒類似于真菌，有線狀，也有環(huán)狀，有的能整合到線粒體中。載體和受體的選擇l-DNA

幾種載體的最大裝載量質(zhì)?？妓官|(zhì)粒15kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb質(zhì)粒DNA在分子生物學(xué)中的應(yīng)用基因克?。╣ene；酶；受體；載體）,DNA擴(kuò)增（松弛型質(zhì)粒）測(cè)序、表達(dá)RestrictionenzymerestrictionendonucleaseenzymethatcutsDNAstrandsatspecificsitesII型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)回文詩靜思伊久阻歸期，久阻歸期憶別離；憶別離時(shí)聞漏轉(zhuǎn)，時(shí)聞漏轉(zhuǎn)靜思伊。采蓮人在綠楊津，在綠楊津一闋新；一闋新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮人。賞花歸去馬如飛，去馬如飛酒力微；酒力微醒時(shí)已暮，醒時(shí)已暮賞花歸。

《思妻詩》宋李禺枯眼望遙山隔水，往來曾見幾心知？壺空怕酌一杯酒，筆下難成和韻詩。途路陽人離別久，訊音無雁寄回遲。孤燈夜守長(zhǎng)寥寂，

夫憶妻兮父憶兒。《思夫詩》

兒憶父兮妻憶夫，

寂寥長(zhǎng)守夜燈孤。遲回寄雁無音訊，久別離人陽路途。詩韻和成難下筆，酒杯一酌怕空壺。知心幾見曾往來，水隔山遙望眼枯。5’3’LigaseenzymeusedtojointwopiecesofDNA轉(zhuǎn)化方法磷酸鈣共沉淀法電擊轉(zhuǎn)化法脂質(zhì)體介導(dǎo)法顯微注射法病毒轉(zhuǎn)染法基因克隆clone在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細(xì)胞。在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。

Expressiontheappearanceofatraitdirectedbyagenetraitacharacteristicresultingfromgeneexpression基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）

特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）

從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）

存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）

基因組DNA文庫構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€(gè)序列至少有一個(gè)代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫?；蛭膸鞓?gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類不同,因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定.很顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的制備

基因組DNA的切割超聲波處理限制性內(nèi)切酶部分酶切shotgunmarriageashotgunmarriage（或ashotgunwedding）這個(gè)表達(dá)源于二、三百年前的美國。Ashotgunmarriage的定義是：oneorbothpartiesareforcedintomarriageduetoanunplannedpregnancy（奉子成婚）。圖5-13用Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的過程圖示。

染色體走讀法（chromosomewalking）排序走讀的起點(diǎn)克隆片段真核生物基因組DNA龐大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關(guān)基因。cDNA文庫的構(gòu)建細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡(jiǎn)圖。RNA的濃度和純度可以通過測(cè)定其OD260和OD280來判斷。OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染，則OD260/OD280的比值將明顯低于1.8。由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴(kuò)增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我復(fù)制的載體中。cDNA文庫的構(gòu)建cDNA的長(zhǎng)度一般在0.5-8kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體類載體都能滿足要求。cDNA文庫常用Uni-zapXR（一種λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)利用藍(lán)白斑篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過體內(nèi)剪切反應(yīng)（InVivoExcision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進(jìn)行篩選、克隆和序列分析。

基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。1、核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫篩選中最常用的一種方法，用放射性標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當(dāng)溫育。同時(shí)保留原來的菌落平板作對(duì)照。取出已經(jīng)長(zhǎng)有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì)，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自顯影