生物學(xué)第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件

四固定化酶的性質(zhì)固定化常常是一種化學(xué)修飾，酶本身的結(jié)構(gòu)受影響。酶固定化后．其催化作用由均相移到異相，由此帶來(lái)的擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間障礙、載體性質(zhì)造成的分配效應(yīng)等因素必然對(duì)酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響。四固定化酶的性質(zhì)固定化常常是一種化學(xué)修飾，酶本身的結(jié)構(gòu)受影空間障礙空間障礙擴(kuò)散限制濃度梯度擴(kuò)散限制濃度梯度分配效應(yīng)分配定律描述溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的液相中的分配的定律。在一定溫度和壓力下，如果一種物質(zhì)溶解在兩個(gè)同時(shí)存在的互不混溶的液體中，達(dá)到平衡后，該物質(zhì)在兩相中的濃度比等于常數(shù)：分配效應(yīng)分配定律(一)固定化后酶活力的變化多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變。

例如，用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對(duì)高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％，而對(duì)低分子底物苯酞精氨酸－對(duì)硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。(一)固定化后酶活力的變化多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能酶活低的可能原因酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過(guò)膜與酶接近。酶活低的可能原因酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚酶活反而高的原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾．或固定化過(guò)程提高了酶的穩(wěn)定性。酶活反而高的原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾．或固定化過(guò)程(二)固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響穩(wěn)定性實(shí)際應(yīng)用大多數(shù)情況下酶經(jīng)過(guò)固定化后其穩(wěn)定性都有所增加。Merlose選擇50種固定化酶測(cè)試穩(wěn)定性

(二)固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響穩(wěn)定性實(shí)際應(yīng)用穩(wěn)定性提高方面:熱穩(wěn)定性提高保存穩(wěn)定性好對(duì)蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解對(duì)變性劑的耐受性提高,可耐受尿素、有機(jī)溶劑和鹽酸胍等蛋白質(zhì)性劑的作用。對(duì)不同pH穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高方面:熱穩(wěn)定性提高A熱穩(wěn)定性A熱穩(wěn)定性B有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，使本來(lái)不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。固定化酶在有機(jī)合成中應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。B有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的CpH穩(wěn)定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫16h測(cè)定酶活力固定化酶在pH5.5-10.3活力穩(wěn)定；游離酶則僅在pH7.0-9.0穩(wěn)定。固定化酶的pH穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。CpH穩(wěn)定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫固定化后酶穩(wěn)定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接．可防止酶分子伸展變形。酶活力的緩慢釋放。抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合，由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解。固定化后酶穩(wěn)定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接．(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。固定化后，酶熱穩(wěn)定性提高，最適溫度隨之提高。例如，湯亞杰等以交聯(lián)法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80℃，比固定化前提高了30℃。固定化后也可能降低固定化的最適溫度受固定化方法和固定化載體的影響。(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、pH穩(wěn)定性增強(qiáng)(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、p最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環(huán)境

最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環(huán)境

[生物學(xué)]第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件[生物學(xué)]第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件結(jié)果帶負(fù)電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏高。使用帶正電荷的載體其最適pH向酸性偏移。結(jié)果帶負(fù)電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較產(chǎn)物對(duì)最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴(kuò)散障礙，使反應(yīng)產(chǎn)物向外擴(kuò)散受到一定限制。++++催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性（H+），則最適pH比游離酶高（需OH-中和）反之則偏低，中性則不變。產(chǎn)物對(duì)最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴(kuò)散障礙，使（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的底物，只對(duì)小分子量底物有效。

例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白質(zhì)，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纖維素上后，對(duì)二肽或多肽作用保持不變，但對(duì)酪蛋白的作用僅為游離酶的3%左右。（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的酶及載體材料的性質(zhì)。五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的[生物學(xué)]第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件

酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化;載體的影響.由于在固定化酶的周圍，形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層以及靜電的相互作用等引起的變化。酶固定化后發(fā)生的性質(zhì)變化.上述幾種影響因素綜合作用的結(jié)果。載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié)構(gòu)、封閉酶活性部位等。酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷六酶固定化載體材料研究新進(jìn)展1磁性高分子微球

磁性高分子微球是指內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳及其氧化物)的超細(xì)粉末,而具有磁響應(yīng)性的高分子微球.六酶固定化載體材料研究新進(jìn)展1磁性高分子微球

磁性高分子微球作為載體的優(yōu)點(diǎn)(1)固定化酶從反應(yīng)體系中分離和回收簡(jiǎn)便。對(duì)于雙酶體系,當(dāng)一種酶失活時(shí),可以用磁性材料再固載另一種酶,回收后反復(fù)使用。(2)磁性載體固定化酶放入磁場(chǎng)穩(wěn)定的流動(dòng)床反應(yīng)器中,可以減少反應(yīng)體系中的操作,適合大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)。(3)利用外部磁場(chǎng)可以控制磁性材料固定酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向,替代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌,提高固定化酶的催化效率。作為載體的優(yōu)點(diǎn)(1)固定化酶從反應(yīng)體系中分離和回收簡(jiǎn)便。對(duì)合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體存在下進(jìn)行聚合反應(yīng),均可得到納米級(jí)的磁性微球合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體2其它新型載體導(dǎo)電聚合物作為酶固定化載體時(shí)可用于酶電極類生物傳感器的制備。光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價(jià)固定化酶時(shí),條件溫和,可獲得酶活力較高的固定化酶。N-異丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到溫敏性水凝膠載體,用于固定嗜熱菌蛋白酶時(shí)可實(shí)現(xiàn)均相催化和異相分離的統(tǒng)一2其它新型載體導(dǎo)電聚合物作為酶固定化載體時(shí)可用于酶電極類生4.3固定化細(xì)胞

固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。這是在酶固定化基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。4.3固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，固定化細(xì)胞比固定化酶優(yōu)越點(diǎn)固定化細(xì)胞保持胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，這對(duì)于多步催化轉(zhuǎn)換，如合成干擾素等，其優(yōu)勢(shì)更加明顯，而且無(wú)需輔酶再生。還可固定化增殖細(xì)胞.固定化細(xì)胞比固定化酶優(yōu)越點(diǎn)固定化細(xì)胞保持胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與固定化增殖細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度密集而體積縮小的工程菌集合體，不需要微生物菌體的多次培養(yǎng)、擴(kuò)大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周期，可提高生產(chǎn)能力；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用，有希望將發(fā)酵罐改變?yōu)榉磻?yīng)柱進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)；發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等。固定化增殖細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度固定化細(xì)胞的缺點(diǎn)利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物；細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用;載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性固定化細(xì)胞的缺點(diǎn)利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形一、固定化細(xì)胞分類分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)死細(xì)胞完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器活細(xì)胞增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、饑餓細(xì)胞一、固定化細(xì)胞分類分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物細(xì)胞植物細(xì)固定化死細(xì)胞固定化死細(xì)胞一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法的處理，如加熱、勻漿、干燥、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加細(xì)胞膜的滲透性或抑制副反應(yīng)，所以比較適于單酶催化的反應(yīng)。固定化死細(xì)胞固定化死細(xì)胞一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或固定化活細(xì)胞

固定化靜止細(xì)胞和饑俄細(xì)胞在固定化之后細(xì)胞是活的，但是由于采用控制措施，細(xì)胞并不生長(zhǎng)繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。固定化生長(zhǎng)細(xì)胞又稱固定化增殖細(xì)胞．是將活細(xì)胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中保持旺盛的生長(zhǎng)、繁殖能力的一種固定化方法。更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)。固定化活細(xì)胞固定化靜止細(xì)胞和饑俄細(xì)胞在固定化之后細(xì)胞是活的二、固定化細(xì)胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細(xì)胞的固定化?？刹捎梦⑸镒陨淼男跄芰?lái)制備無(wú)載體固定化細(xì)胞。要求保持高的活力保留和具有操作穩(wěn)定性。二、固定化細(xì)胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細(xì)胞的固幾種方法的特點(diǎn)

化學(xué)法(共價(jià)交聯(lián))涉及菌或細(xì)胞的化學(xué)修飾。由于所用化學(xué)藥品的毒性，可引起細(xì)胞破壞。因此，反應(yīng)耍在盡可能溫和的條件下進(jìn)行。在使用中細(xì)胞間、細(xì)胞和載體間的鍵不易被底物或鹽所破壞，操作穩(wěn)定性高。

吸附螯合法條件溫和、方法簡(jiǎn)便，但載體和細(xì)胞間吸附力弱，操作時(shí)細(xì)胞易從載體脫落，特別是底物分子量高，介質(zhì)的離子強(qiáng)度和pH變化情況下更是如此，所以操作穩(wěn)定性差，但優(yōu)點(diǎn)是可再生。包埋法從理論上來(lái)說(shuō)細(xì)胞和載體間沒(méi)有束縛，固定化后應(yīng)保持高活力，然而實(shí)際上限制酶活力的因素較多，且這類方法只適于小分子底物。要固定活細(xì)胞、增殖細(xì)胞，顯然包埋法占優(yōu)勢(shì)，尤其采用卡拉膠、海藻酸鈣等材料更好。交聯(lián)法沒(méi)有良好機(jī)械強(qiáng)度．所以不適于實(shí)際應(yīng)用。但可得到高細(xì)胞濃度，大多數(shù)情況難于再生。幾種方法的特點(diǎn)化學(xué)法(共價(jià)交聯(lián))涉及菌或細(xì)胞的化學(xué)修飾。由三、固定化細(xì)胞的重要發(fā)展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶工程相結(jié)合，有可能使大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中重組菌的穩(wěn)定性問(wèn)題得到較好解決。固定化工程菌和游離工程菌相比較，固定化細(xì)胞具有高細(xì)胞濃度、克隆產(chǎn)物高效表達(dá)、穩(wěn)定性好等特性。三、固定化細(xì)胞的重要發(fā)展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶4.4固定化原生質(zhì)體固定化細(xì)胞缺點(diǎn):只能用于生產(chǎn)胞外產(chǎn)物由于載體的影響產(chǎn)物和底物的擴(kuò)散受到影響.

溶解氧的傳遞和輸送受到影響.去除細(xì)胞壁障礙就可得到許多胞內(nèi)產(chǎn)物,減少障礙.原生質(zhì)體:去除細(xì)胞壁后的植物或其它生物細(xì)胞.原生質(zhì)體缺點(diǎn)就是更脆弱,但用載體固定化后就具有高的穩(wěn)定性,又比正常細(xì)胞少了胞壁障礙.4.4固定化原生質(zhì)體固定化細(xì)胞缺點(diǎn):4.5固定化酶和固定化細(xì)胞的表征一、評(píng)價(jià)固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)固定化酶(細(xì)胞)的活力偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定固定化酶(細(xì)胞)的半衰期4.5固定化酶和固定化細(xì)胞的表征一、評(píng)價(jià)固定化酶(細(xì)胞)的指1固定化酶(細(xì)胞)的活力固定化酶(細(xì)胞)的活力即是固定化酶(細(xì)胞)催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來(lái)表示。固定化酶(細(xì)胞)的單位可定義為每毫克干重固定化酶(細(xì)胞)每分鐘轉(zhuǎn)化底物(或生產(chǎn)產(chǎn)物)的量，表示為μmol·min-1mg-1。如是酶膜、酶管、酶板．則以單位面積的反應(yīng)初速度來(lái)表示．即μmol·min-1cm2。表示固定化酶的活力一般要注明下列測(cè)定條件：溫度、攪拌速度、固定化酶的于燥條件、固定化的原酶含量或蛋白質(zhì)含量及用于固定化酶的原酶的比活力。1固定化酶(細(xì)胞)的活力固定化酶(細(xì)胞)的活力即是固定化酶(測(cè)定方法活力可在兩種基本系統(tǒng)——填充床或均勻懸浮在保溫介質(zhì)中進(jìn)行測(cè)定。①間歇測(cè)定

在攪拌或振蕩反應(yīng)器中，在與溶液酶同樣測(cè)定條件下(如均勻懸浮于保溫的介質(zhì)中)進(jìn)行，然后間隔一定時(shí)間取樣，過(guò)濾后按常規(guī)進(jìn)行測(cè)定。如攪拌速度過(guò)快．會(huì)由于固定化酶破碎而造成活力上升。測(cè)定方法活力可在兩種基本系統(tǒng)——填充床或均勻懸浮在保溫介質(zhì)中②連續(xù)測(cè)定固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過(guò)底物，測(cè)定酶柱流出液。根據(jù)流速和反應(yīng)速度之間關(guān)系，算出酶活力(酶的形狀可能影響反應(yīng)速度)。在實(shí)際應(yīng)用中，固定化菌不一定在底物飽和條件下反應(yīng)，故測(cè)定條件要盡可能與實(shí)際工藝相同，這樣才能利于比較和評(píng)價(jià)整個(gè)工藝。②連續(xù)測(cè)定2偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定用于表征影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)及固定化期間引起的酶失活.

固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶(或細(xì)胞)所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶(細(xì)胞)總活力的百分?jǐn)?shù)。2偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定用于表征影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％偶聯(lián)率＝(加入蛋白活力-上清液蛋白活力)／加入蛋白活力x100％相對(duì)活力＝固定化酶總活力／(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)x100％活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％活力回收活力回收也可稱為有效系數(shù)、活力保留百分?jǐn)?shù)、偶聯(lián)效率，它表示影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)。靜態(tài)有效系數(shù)(η)是在起始速度條什下測(cè)得的活力回收。操作有效系數(shù)(η’)是在生產(chǎn)設(shè)備所要求的條件下測(cè)量的，是固定化酶制劑實(shí)用性的最有效數(shù)據(jù)之一?；盍厥栈盍厥找部煞Q為有效系數(shù)、活力保留百分?jǐn)?shù)、偶聯(lián)效率，η(或η’)＝1表示反應(yīng)控制良好，固定化或擴(kuò)散引起的酶活力損失不明顯(這種可能性不大)。

η(或η’)＜1表示固定時(shí)有損失，擴(kuò)散限制有影響。

η(或η’)＞1可能發(fā)生在個(gè)別情況。原因可能是固定化活細(xì)胞的增殖或抑制因素的排除。η(或η’)＝1表示反應(yīng)控制良好，固定化或擴(kuò)散引起的酶活力3固定化酶(細(xì)胞)的半衰期固定化酶(細(xì)胞)的半衰期是指在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表示。固定化酶(細(xì)胞)的操作穩(wěn)定性是影響實(shí)用的關(guān)鍵因素，半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。在沒(méi)有擴(kuò)散限制時(shí)，固定化酶(細(xì)胞)活力隨時(shí)間成指數(shù)關(guān)系，半衰期t1/2

＝0.693／KD

式中KD

＝-2.303／tXlg(E／E0)稱為衰減常數(shù)，其中E／E0是時(shí)間t后酶活力殘留的百分?jǐn)?shù)。3固定化酶(細(xì)胞)的半衰期固定化酶(細(xì)胞)的半衰期是指在連續(xù)二、載體活化程度和固定化配基密度的測(cè)定用不同的方法活化不同的載體材料后，載體表面活化基團(tuán)的密度可能有很大差別。因而能偶聯(lián)配基的量也不同。活化水平從每個(gè)聚苯乙烯微球偶聯(lián)幾個(gè)微摩爾的基團(tuán)到每毫升交聯(lián)瓊脂糖偶聯(lián)幾百個(gè)微摩爾基團(tuán)。配基分子密度太低，作用有限；相反，配基密度過(guò)高可能產(chǎn)生非持異結(jié)合作用或者造成靶分子的洗脫困難。二、載體活化程度和固定化配基密度的測(cè)定用不同的方法活化不同的4.6固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用可用于生物大分子的固相合成和序列分析、親和分離、同相免疫分析、載體藥物及試劑、生物反應(yīng)器及生物傳感器等領(lǐng)域。4.6固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用可用于生物大分子的固相合成和序列主要的工業(yè)產(chǎn)品主要的工業(yè)產(chǎn)品固定化葡萄糖異構(gòu)酶放線菌－－固定化酶60－65℃15min固定化葡萄糖異構(gòu)酶放線菌－－固定化酶60－65℃15mi一、生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究固定化酶進(jìn)行反應(yīng)可操作性強(qiáng)，可用于酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究、多亞基酶及多酶體系組裝方式的研究及凝血及血栓溶解的生化過(guò)程研究等。利用固定化酶相界面催化反應(yīng)的特點(diǎn)，還可用它來(lái)復(fù)制酶膜的模型。將多酶系統(tǒng)包埋于微囊內(nèi)，可用于酶系統(tǒng)的組裝、定位及代謝的研究等。一、生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究固定化酶進(jìn)行反應(yīng)可操作性強(qiáng)，一)酶的結(jié)構(gòu)與功能研究酶亞基性質(zhì)的研究醛縮酶有4個(gè)亞基，亞基不易分離，但可控制條件使酶分子只有一個(gè)亞基通過(guò)共價(jià)鍵與CNBr活化的瓊脂糖凝膠結(jié)合。當(dāng)用濃度為8mol兒的尿素使蛋白變性后．未固定的亞基被透析除去，只有固定化的亞基保留，這樣就可對(duì)單亞基進(jìn)行研究.一)酶的結(jié)構(gòu)與功能研究酶亞基性質(zhì)的研究醛縮酶有4個(gè)亞基，亞基實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該亞基具活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該亞基具活力二、工業(yè)應(yīng)用1拆分氨基酸氨基酸的光學(xué)拆分例如，將合成法制得的DL—型氨基酸的N—?；苌铮冒被狨；高M(jìn)行不對(duì)稱水解，然后再利用生成的L—氨基酸與N—酰化—D氨基酸的溶解度之差分離出來(lái)。用這種方法可制得光學(xué)純度好、收率高的L—氨基酸．二、工業(yè)應(yīng)用1拆分氨基酸固定化方法選擇固定化方法選擇將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、穩(wěn)定性等比較高。具體做法：將DEAE交聯(lián)葡聚糖A-25(0H型)加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，37℃下攪拌5h，酶吸附在DEAE-Sephadex上，洗去未結(jié)合酶，即可得到固定化氨基?；福畬⒚腹潭ㄔ贒EAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、固定化氨基酰化酶柱非常穩(wěn)定。在50℃條件下可連續(xù)使用30天，保持60％一70％活力。當(dāng)酶柱活性下降時(shí)，可補(bǔ)加相應(yīng)數(shù)量酶液進(jìn)行簡(jiǎn)單再生對(duì)提高酶的經(jīng)濟(jì)效果非常有利。且DEAE交聯(lián)葡聚糖載體也非常穩(wěn)定，使用期達(dá)5年，酶的吸附力、形狀、壓力損失等不發(fā)生變化。固定化氨基?；钢浅７€(wěn)定。在50℃條件下可連續(xù)使用30天，2.生物轉(zhuǎn)化葡萄糖果糖丹麥NovoZymes公司生產(chǎn)的固定化葡萄糖異構(gòu)酶“Sweetzyme?

”有多種型號(hào)，它是由凝結(jié)芽抱桿菌的完整細(xì)胞經(jīng)過(guò)凝聚、戊二醛交聯(lián)、干燥、過(guò)篩等步驟制得，其最適溫度為80℃，最適pH為8.0-8.2，在61℃使用時(shí)，其半衰期1650h。生產(chǎn)能力為2000一3000kg干糖漿／1kg固定化酶。2.生物轉(zhuǎn)化葡萄糖果糖最新一代SweetzymeIT產(chǎn)品是由篩選的鏈霉素菌種產(chǎn)生的。新的SweetzymeIT的主要優(yōu)勢(shì)在于：在適宜的工業(yè)條件下，每公斤酶可產(chǎn)出約18,000kg的糖漿以干物料計(jì)，并增加活力及降低糖漿副產(chǎn)物的形成。最新一代SweetzymeIT產(chǎn)品是由篩選的鏈霉素菌種產(chǎn)生鏈霉菌屬葡萄糖異構(gòu)酶SweetzymeIT的固定化過(guò)程基本上和凝結(jié)芽子包桿菌屬葡萄糖異構(gòu)酶SweetzymeQ一樣。布氏增基離心細(xì)胞濃集物質(zhì)，而細(xì)胞會(huì)因使用Manton-Ganlin均化器中的單一均化閥抽干濃集物而崩裂,壓力下降到300-350kg/cm細(xì)胞與戊二醛鍵結(jié)用陽(yáng)離子絮凝劑稀釋和凝聚以給出清晰的水相過(guò)濾軸式擠壓機(jī)進(jìn)行擠壓顆料在液相干燥器中干燥并過(guò)濾.在300-1000微米大小以用于固定化器操作中。鏈霉菌屬葡萄糖異構(gòu)酶SweetzymeIT的固定化過(guò)程基本三、醫(yī)療方面的應(yīng)用酶制劑已在臨床上取得有效應(yīng)用，并逐漸發(fā)展用酶治病的酶療法。酶本身是一種蛋白質(zhì)，進(jìn)入人體后產(chǎn)生抗體，能引起患者過(guò)敏性休克。酶不穩(wěn)定，易失活，進(jìn)入人體后在蛋白酶作用下易被水解而失去治療作用。制成固定化酶，穩(wěn)定性增加，不被蛋白酶水解，又不與機(jī)體直接接觸，可避免產(chǎn)生抗體，因而為酶治療開(kāi)辟了前景。三、醫(yī)療方面的應(yīng)用酶制劑已在臨床上取得有效應(yīng)用，并逐漸發(fā)展用將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合物內(nèi)，即可制得微小膠事囊型固定化酶。膠囊型酶使囊外蛋白酶、抗體等不能進(jìn)入囊內(nèi)部接觸，所以在利用其來(lái)治病時(shí)，不會(huì)在患者體內(nèi)產(chǎn)生抗體，避免過(guò)敏性反應(yīng)。將酶包埋在半透膜性質(zhì)的聚合物內(nèi)，即可制得微小膠事囊型固定化酶L天門冬酰氨酶是第一種用于治療癌癥的酶類藥物但天然的L—門冬酰胺酶進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生抗體，出現(xiàn)休克如制成固定化酶可避兔上述抗體反應(yīng)。將尼龍薄膜制成微囊型固定化酶，或用硝酸纖細(xì)素微囊化再與戊二醛交聯(lián)用于治療小白鼠白血病，與對(duì)照組相比，療效明顯。L天門冬酰氨酶是第一種用于治療癌癥的酶類藥物四、診斷、分析方面的應(yīng)用酶的專一性可以便酶在一個(gè)復(fù)雜體系中，不受其他物質(zhì)千擾，準(zhǔn)確地測(cè)出某一物質(zhì)含量。目前國(guó)外已普遍將酶學(xué)分析法應(yīng)用于化學(xué)分析和臨床診斷等方面。實(shí)踐證明酶學(xué)分析法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。近來(lái)已發(fā)展成為快速、準(zhǔn)確、靈敏、自動(dòng)化的分析方法。四、診斷、分析方面的應(yīng)用酶的專一性可以便酶在一個(gè)復(fù)雜體系中，1．酶試紙的應(yīng)用將酶固定于紙片上，制成能測(cè)定某些物質(zhì)的含量的試紙，用于診斷，非常簡(jiǎn)便、迅速。尿糖試紙(葡萄糖氧化酶，過(guò)氧化氫酶）2．酶柱固定化酶裝入柱內(nèi)，讓樣品通過(guò)酶柱后，用光化學(xué)或電化學(xué)方法測(cè)定流出液中底物的減少、產(chǎn)物的增加或輔助因子的變化1．酶試紙的應(yīng)用2．酶柱3．酶管將酶直接共價(jià)結(jié)合于內(nèi)徑1mm、長(zhǎng)3m的尼龍管或聚苯乙烯管內(nèi)壁，當(dāng)待測(cè)溶液通過(guò)酶管后，生成的產(chǎn)物可以在自動(dòng)分析系統(tǒng)中連續(xù)測(cè)定。目前已制成脲酶、葡萄糖氧化酶等酶管。國(guó)外已制成多種酶管自動(dòng)分析儀，作為商品出售。其優(yōu)點(diǎn)在于可連續(xù)、快速、自動(dòng)地測(cè)定微量樣品。3．酶管4．酶電極酶電極可能是固定化酶當(dāng)前研究和應(yīng)用最活躍的領(lǐng)域之一，它使酶分析進(jìn)展到高度簡(jiǎn)便化、自動(dòng)化、微型化和連續(xù)化。目前常用的幾種酶電極有：脲酶電極測(cè)定尿素、葡萄糖氧化酶電極測(cè)定葡萄糖、乳酸脫氫酶電極測(cè)定乳酸、青霉素酶電極測(cè)定青霉素等。4．酶電極五、環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用1．環(huán)境監(jiān)則根據(jù)固定化酶用于化學(xué)分析的原理，固定化酶(細(xì)胞)也可以用于測(cè)定有毒物質(zhì)含量以進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。2。處理工業(yè)廢水以往人們利用活性污泥來(lái)處理污水?，F(xiàn)在人們嘗試從活性污泥中分離出微生物，然再后將其固定，由此組成快速、高效，能連續(xù)處理工業(yè)污水的系統(tǒng)。五、環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用1．環(huán)境監(jiān)則四固定化酶的性質(zhì)固定化常常是一種化學(xué)修飾，酶本身的結(jié)構(gòu)受影響。酶固定化后．其催化作用由均相移到異相，由此帶來(lái)的擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間障礙、載體性質(zhì)造成的分配效應(yīng)等因素必然對(duì)酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響。四固定化酶的性質(zhì)固定化常常是一種化學(xué)修飾，酶本身的結(jié)構(gòu)受影空間障礙空間障礙擴(kuò)散限制濃度梯度擴(kuò)散限制濃度梯度分配效應(yīng)分配定律描述溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的液相中的分配的定律。在一定溫度和壓力下，如果一種物質(zhì)溶解在兩個(gè)同時(shí)存在的互不混溶的液體中，達(dá)到平衡后，該物質(zhì)在兩相中的濃度比等于常數(shù)：分配效應(yīng)分配定律(一)固定化后酶活力的變化多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變。

例如，用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對(duì)高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％，而對(duì)低分子底物苯酞精氨酸－對(duì)硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。(一)固定化后酶活力的變化多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能酶活低的可能原因酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過(guò)膜與酶接近。酶活低的可能原因酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚酶活反而高的原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾．或固定化過(guò)程提高了酶的穩(wěn)定性。酶活反而高的原因可能是偶聯(lián)過(guò)程中酶得到化學(xué)修飾．或固定化過(guò)程(二)固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響穩(wěn)定性實(shí)際應(yīng)用大多數(shù)情況下酶經(jīng)過(guò)固定化后其穩(wěn)定性都有所增加。Merlose選擇50種固定化酶測(cè)試穩(wěn)定性

(二)固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響穩(wěn)定性實(shí)際應(yīng)用穩(wěn)定性提高方面:熱穩(wěn)定性提高保存穩(wěn)定性好對(duì)蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解對(duì)變性劑的耐受性提高,可耐受尿素、有機(jī)溶劑和鹽酸胍等蛋白質(zhì)性劑的作用。對(duì)不同pH穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高方面:熱穩(wěn)定性提高A熱穩(wěn)定性A熱穩(wěn)定性B有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，使本來(lái)不能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶反應(yīng)成為可能。固定化酶在有機(jī)合成中應(yīng)用會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。B有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高提高固定化酶對(duì)各種有機(jī)溶劑的CpH穩(wěn)定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫16h測(cè)定酶活力固定化酶在pH5.5-10.3活力穩(wěn)定；游離酶則僅在pH7.0-9.0穩(wěn)定。固定化酶的pH穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。CpH穩(wěn)定性青霉素?；冈诓煌琾H的緩沖液中．于37℃保溫固定化后酶穩(wěn)定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接．可防止酶分子伸展變形。酶活力的緩慢釋放。抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合，由于酶失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解。固定化后酶穩(wěn)定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接．(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。固定化后，酶熱穩(wěn)定性提高，最適溫度隨之提高。例如，湯亞杰等以交聯(lián)法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80℃，比固定化前提高了30℃。固定化后也可能降低固定化的最適溫度受固定化方法和固定化載體的影響。(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、pH穩(wěn)定性增強(qiáng)(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、p最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環(huán)境

最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環(huán)境

[生物學(xué)]第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件[生物學(xué)]第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件結(jié)果帶負(fù)電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏高。使用帶正電荷的載體其最適pH向酸性偏移。結(jié)果帶負(fù)電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較產(chǎn)物對(duì)最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴(kuò)散障礙，使反應(yīng)產(chǎn)物向外擴(kuò)散受到一定限制。++++催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性（H+），則最適pH比游離酶高（需OH-中和）反之則偏低，中性則不變。產(chǎn)物對(duì)最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴(kuò)散障礙，使（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的底物，只對(duì)小分子量底物有效。

例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白質(zhì)，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纖維素上后，對(duì)二肽或多肽作用保持不變，但對(duì)酪蛋白的作用僅為游離酶的3%左右。（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的酶及載體材料的性質(zhì)。五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質(zhì)取決于所用的[生物學(xué)]第4章四-固定化酶的性質(zhì)課件

酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化;載體的影響.由于在固定化酶的周圍，形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層以及靜電的相互作用等引起的變化。酶固定化后發(fā)生的性質(zhì)變化.上述幾種影響因素綜合作用的結(jié)果。載體與酶的直接作用可能表現(xiàn)為活力喪失、破壞酶結(jié)構(gòu)、封閉酶活性部位等。酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷六酶固定化載體材料研究新進(jìn)展1磁性高分子微球

磁性高分子微球是指內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳及其氧化物)的超細(xì)粉末,而具有磁響應(yīng)性的高分子微球.六酶固定化載體材料研究新進(jìn)展1磁性高分子微球

磁性高分子微球作為載體的優(yōu)點(diǎn)(1)固定化酶從反應(yīng)體系中分離和回收簡(jiǎn)便。對(duì)于雙酶體系,當(dāng)一種酶失活時(shí),可以用磁性材料再固載另一種酶,回收后反復(fù)使用。(2)磁性載體固定化酶放入磁場(chǎng)穩(wěn)定的流動(dòng)床反應(yīng)器中,可以減少反應(yīng)體系中的操作,適合大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)。(3)利用外部磁場(chǎng)可以控制磁性材料固定酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向,替代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌,提高固定化酶的催化效率。作為載體的優(yōu)點(diǎn)(1)固定化酶從反應(yīng)體系中分離和回收簡(jiǎn)便。對(duì)合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體存在下進(jìn)行聚合反應(yīng),均可得到納米級(jí)的磁性微球合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體2其它新型載體導(dǎo)電聚合物作為酶固定化載體時(shí)可用于酶電極類生物傳感器的制備。光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價(jià)固定化酶時(shí),條件溫和,可獲得酶活力較高的固定化酶。N-異丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到溫敏性水凝膠載體,用于固定嗜熱菌蛋白酶時(shí)可實(shí)現(xiàn)均相催化和異相分離的統(tǒng)一2其它新型載體導(dǎo)電聚合物作為酶固定化載體時(shí)可用于酶電極類生4.3固定化細(xì)胞

固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。這是在酶固定化基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。4.3固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，固定化細(xì)胞比固定化酶優(yōu)越點(diǎn)固定化細(xì)胞保持胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，這對(duì)于多步催化轉(zhuǎn)換，如合成干擾素等，其優(yōu)勢(shì)更加明顯，而且無(wú)需輔酶再生。還可固定化增殖細(xì)胞.固定化細(xì)胞比固定化酶優(yōu)越點(diǎn)固定化細(xì)胞保持胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與固定化增殖細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度密集而體積縮小的工程菌集合體，不需要微生物菌體的多次培養(yǎng)、擴(kuò)大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周期，可提高生產(chǎn)能力；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用，有希望將發(fā)酵罐改變?yōu)榉磻?yīng)柱進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)；發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等。固定化增殖細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度固定化細(xì)胞的缺點(diǎn)利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物；細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用;載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性固定化細(xì)胞的缺點(diǎn)利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形一、固定化細(xì)胞分類分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)死細(xì)胞完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器活細(xì)胞增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、饑餓細(xì)胞一、固定化細(xì)胞分類分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物細(xì)胞植物細(xì)固定化死細(xì)胞固定化死細(xì)胞一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法的處理，如加熱、勻漿、干燥、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加細(xì)胞膜的滲透性或抑制副反應(yīng)，所以比較適于單酶催化的反應(yīng)。固定化死細(xì)胞固定化死細(xì)胞一般在固定化之前或之后細(xì)胞經(jīng)過(guò)物理或固定化活細(xì)胞

固定化靜止細(xì)胞和饑俄細(xì)胞在固定化之后細(xì)胞是活的，但是由于采用控制措施，細(xì)胞并不生長(zhǎng)繁殖，而是處于休眠狀態(tài)或饑餓狀態(tài)。固定化生長(zhǎng)細(xì)胞又稱固定化增殖細(xì)胞．是將活細(xì)胞固定在載體上并使其在連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中保持旺盛的生長(zhǎng)、繁殖能力的一種固定化方法。更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng)。固定化活細(xì)胞固定化靜止細(xì)胞和饑俄細(xì)胞在固定化之后細(xì)胞是活的二、固定化細(xì)胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細(xì)胞的固定化?？刹捎梦⑸镒陨淼男跄芰?lái)制備無(wú)載體固定化細(xì)胞。要求保持高的活力保留和具有操作穩(wěn)定性。二、固定化細(xì)胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細(xì)胞的固幾種方法的特點(diǎn)

化學(xué)法(共價(jià)交聯(lián))涉及菌或細(xì)胞的化學(xué)修飾。由于所用化學(xué)藥品的毒性，可引起細(xì)胞破壞。因此，反應(yīng)耍在盡可能溫和的條件下進(jìn)行。在使用中細(xì)胞間、細(xì)胞和載體間的鍵不易被底物或鹽所破壞，操作穩(wěn)定性高。

吸附螯合法條件溫和、方法簡(jiǎn)便，但載體和細(xì)胞間吸附力弱，操作時(shí)細(xì)胞易從載體脫落，特別是底物分子量高，介質(zhì)的離子強(qiáng)度和pH變化情況下更是如此，所以操作穩(wěn)定性差，但優(yōu)點(diǎn)是可再生。包埋法從理論上來(lái)說(shuō)細(xì)胞和載體間沒(méi)有束縛，固定化后應(yīng)保持高活力，然而實(shí)際上限制酶活力的因素較多，且這類方法只適于小分子底物。要固定活細(xì)胞、增殖細(xì)胞，顯然包埋法占優(yōu)勢(shì)，尤其采用卡拉膠、海藻酸鈣等材料更好。交聯(lián)法沒(méi)有良好機(jī)械強(qiáng)度．所以不適于實(shí)際應(yīng)用。但可得到高細(xì)胞濃度，大多數(shù)情況難于再生。幾種方法的特點(diǎn)化學(xué)法(共價(jià)交聯(lián))涉及菌或細(xì)胞的化學(xué)修飾。由三、固定化細(xì)胞的重要發(fā)展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶工程相結(jié)合，有可能使大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中重組菌的穩(wěn)定性問(wèn)題得到較好解決。固定化工程菌和游離工程菌相比較，固定化細(xì)胞具有高細(xì)胞濃度、克隆產(chǎn)物高效表達(dá)、穩(wěn)定性好等特性。三、固定化細(xì)胞的重要發(fā)展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶4.4固定化原生質(zhì)體固定化細(xì)胞缺點(diǎn):只能用于生產(chǎn)胞外產(chǎn)物由于載體的影響產(chǎn)物和底物的擴(kuò)散受到影響.

溶解氧的傳遞和輸送受到影響.去除細(xì)胞壁障礙就可得到許多胞內(nèi)產(chǎn)物,減少障礙.原生質(zhì)體:去除細(xì)胞壁后的植物或其它生物細(xì)胞.原生質(zhì)體缺點(diǎn)就是更脆弱,但用載體固定化后就具有高的穩(wěn)定性,又比正常細(xì)胞少了胞壁障礙.4.4固定化原生質(zhì)體固定化細(xì)胞缺點(diǎn):4.5固定化酶和固定化細(xì)胞的表征一、評(píng)價(jià)固定化酶(細(xì)胞)的指標(biāo)固定化酶(細(xì)胞)的活力偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定固定化酶(細(xì)胞)的半衰期4.5固定化酶和固定化細(xì)胞的表征一、評(píng)價(jià)固定化酶(細(xì)胞)的指1固定化酶(細(xì)胞)的活力固定化酶(細(xì)胞)的活力即是固定化酶(細(xì)胞)催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來(lái)表示。固定化酶(細(xì)胞)的單位可定義為每毫克干重固定化酶(細(xì)胞)每分鐘轉(zhuǎn)化底物(或生產(chǎn)產(chǎn)物)的量，表示為μmol·min-1mg-1。如是酶膜、酶管、酶板．則以單位面積的反應(yīng)初速度來(lái)表示．即μmol·min-1cm2。表示固定化酶的活力一般要注明下列測(cè)定條件：溫度、攪拌速度、固定化酶的于燥條件、固定化的原酶含量或蛋白質(zhì)含量及用于固定化酶的原酶的比活力。1固定化酶(細(xì)胞)的活力固定化酶(細(xì)胞)的活力即是固定化酶(測(cè)定方法活力可在兩種基本系統(tǒng)——填充床或均勻懸浮在保溫介質(zhì)中進(jìn)行測(cè)定。①間歇測(cè)定

在攪拌或振蕩反應(yīng)器中，在與溶液酶同樣測(cè)定條件下(如均勻懸浮于保溫的介質(zhì)中)進(jìn)行，然后間隔一定時(shí)間取樣，過(guò)濾后按常規(guī)進(jìn)行測(cè)定。如攪拌速度過(guò)快．會(huì)由于固定化酶破碎而造成活力上升。測(cè)定方法活力可在兩種基本系統(tǒng)——填充床或均勻懸浮在保溫介質(zhì)中②連續(xù)測(cè)定固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過(guò)底物，測(cè)定酶柱流出液。根據(jù)流速和反應(yīng)速度之間關(guān)系，算出酶活力(酶的形狀可能影響反應(yīng)速度)。在實(shí)際應(yīng)用中，固定化菌不一定在底物飽和條件下反應(yīng)，故測(cè)定條件要盡可能與實(shí)際工藝相同，這樣才能利于比較和評(píng)價(jià)整個(gè)工藝。②連續(xù)測(cè)定2偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定用于表征影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)及固定化期間引起的酶失活.

固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶(或細(xì)胞)所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶(細(xì)胞)總活力的百分?jǐn)?shù)。2偶聯(lián)率及相對(duì)活力的測(cè)定用于表征影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％偶聯(lián)率＝(加入蛋白活力-上清液蛋白活力)／加入蛋白活力x100％相對(duì)活力＝固定化酶總活力／(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)x100％活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％活力回收活力回收也可稱為有效系數(shù)、活力保留百分?jǐn)?shù)、偶聯(lián)效率，它表示影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)。靜態(tài)有效系數(shù)(η)是在起始速度條什下測(cè)得的活力回收。操作有效系數(shù)(η’)是在生產(chǎn)設(shè)備所要求的條件下測(cè)量的，是固定化酶制劑實(shí)用性的最有效數(shù)據(jù)之一?；盍厥栈盍厥找部煞Q為有效系數(shù)、活力保留百分?jǐn)?shù)、偶聯(lián)效率，η(或η’)＝1表示反應(yīng)控制良好，固定化或擴(kuò)散引起的酶活力損失不明顯(這種可能性不大)。

η(或η’)＜1表示固定時(shí)有損失，擴(kuò)散限制有影響。

η(或η’)＞1可能發(fā)生在個(gè)別情況。原因可能是固定化活細(xì)胞的增殖或抑制因素的排除。η(或η’)＝1表示反應(yīng)控制良好，固定化或擴(kuò)散引起的酶活力3固定化酶(細(xì)胞)的半衰期固定化酶(細(xì)胞)的半衰期是指在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表示。固定化酶(細(xì)胞)的操作穩(wěn)定性是影響實(shí)用的關(guān)鍵因素，半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。在沒(méi)有擴(kuò)散限制時(shí)，固定化酶(細(xì)胞)活力隨時(shí)間成指數(shù)關(guān)系，半衰期t1/2

＝0.693／KD

式中KD

＝-2.303／tXlg(E／E0)稱為衰減常數(shù)，其中E／E0是時(shí)間t后酶活力殘留的百分?jǐn)?shù)。3固定化酶(細(xì)胞)的半衰期固定化酶(細(xì)胞)的半衰期是指在連續(xù)二、載體活化程度和固定化配基密度的測(cè)定用不同的方法活化不同的載體材料后，載體表面活化基團(tuán)的密度可能有很大差別。因而能偶聯(lián)配基的量也不同。活化水平從每個(gè)聚苯乙烯微球偶聯(lián)幾個(gè)微摩爾的基團(tuán)到每毫升交聯(lián)瓊脂糖偶聯(lián)幾百個(gè)微摩爾基團(tuán)。配基分子密度太低，作用有限；相反，配基密度過(guò)高可能產(chǎn)生非持異結(jié)合作用或者造成靶分子的洗脫困難。二、載體活化程度和固定化配基密度的測(cè)定用不同的方法活化不同的4.6固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用可用于生物大分子的固相合成和序列分析、親和分離、同相免疫分析、載體藥物及試劑、生物反應(yīng)器及生物傳感器等領(lǐng)域。4.6固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用可用于生物大分子的固相合成和序列主要的工業(yè)產(chǎn)品主要的工業(yè)產(chǎn)品固定化葡萄糖異構(gòu)酶放線菌－－固定化酶60－65℃15min固定化葡萄糖異構(gòu)酶放線菌－－固定化酶60－65℃15mi一、生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究固定化酶進(jìn)行反應(yīng)可操作性強(qiáng)，可用于酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究、多亞基酶及多酶體系組裝方式的研究及凝血及血栓溶解的生化過(guò)程研究等。利用固定化酶相界面催化反應(yīng)的特點(diǎn)，還可用它來(lái)復(fù)制酶膜的模型。將多酶系統(tǒng)包埋于微囊內(nèi)，可用于酶系統(tǒng)的組裝、定位及代謝的研究等。一、生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究固定化酶進(jìn)行反應(yīng)可操作性強(qiáng)，一)酶的結(jié)構(gòu)與功能研究酶亞基性質(zhì)的研究醛縮酶有4個(gè)亞基，亞基不易分離，但可控制條件使酶分子只有一個(gè)亞基通過(guò)共價(jià)鍵與CNBr活化的瓊脂糖凝膠結(jié)合。當(dāng)用濃度為8mol兒的尿素使蛋白變性后．未固定的亞基被透析除去，只有固定化的亞基保留，這樣就可對(duì)單亞基進(jìn)行研究.一)酶的結(jié)構(gòu)與功能研究酶亞基性質(zhì)的研究醛縮酶有4個(gè)亞基，亞基實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該亞基具活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該亞基具活力二、工業(yè)應(yīng)用1拆分氨基酸氨基酸的光學(xué)拆分例如，將合成法制得的DL—型氨基酸的N—酰化衍生物，用氨基酸?；高M(jìn)行不對(duì)稱水解，然后再利用生成的L—氨基酸與N—酰化—D氨基酸的溶解度之差分離出來(lái)。用這種方法可制得光學(xué)純度好、收率高的L—氨基酸．二、工業(yè)應(yīng)用1拆分氨基酸固定化方法選擇固定化方法選擇將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、穩(wěn)定性等比較高。具體做法：將DEAE交聯(lián)葡聚糖A-25(0H型)加至含有氨基?；傅?.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，37℃下攪拌5h，酶吸附在DEAE-Sephadex上，洗去未結(jié)合酶，即可得到固定化氨基酰化酶．將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、固定化氨基?；钢浅７€(wěn)定。在50℃條件下可連續(xù)使用30天，保持60％一70％活力。當(dāng)酶柱活性下降時(shí)，可補(bǔ)加相應(yīng)數(shù)量酶液進(jìn)行簡(jiǎn)單再生對(duì)提高酶的經(jīng)濟(jì)效果非常有利