CART細胞介紹優(yōu)質課件

CART細胞介紹CART細胞介紹1嵌合抗原受體（chimericantigenreceptor,CAR）T細胞技術；是過繼細胞免疫治療（adoptivecellularimmunotherapy，ACI)的一種；通過基因改造技術，讓患者T細胞表達嵌合抗原受體，使效應T細胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規(guī)應用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)；存在問題是脫靶效應、細胞因子風暴、插入突變；是一種特異性的免疫細胞抗腫瘤治療。什么是CAR-T細胞嵌合抗原受體（chimericantigenrecep2通過將識別腫瘤相關抗原(tumorassociatedantigen,TAA)的scFv和胞內信號域“免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs,ITAM,通常為CD3ζ或FcεRIγ)”在體外進行基因重組,生成重組質粒,再在體外通過轉染技術轉染到患者的T細胞,使患者T細胞表達腫瘤抗原受體,轉染后經過純化和大規(guī)模擴增后的T細胞,稱之為嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞）。CAR-T細胞在體內、外都具有對特定腫瘤抗原高度親和性及對抗原負載細胞高效殺傷特性（圖1）。在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膠質瘤等惡性腫瘤治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應。CAR-T細胞的設計思路通過將識別腫瘤相關抗原(tumorassociateda3CART細胞介紹優(yōu)質課件4CAR-T細胞的發(fā)展過程第一代CAR-T細胞發(fā)表時間：1989年；嵌合受體的形成方法：Eshhar研究小組將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復合物(ζ鏈)胞內結構域融合形成嵌合受體；激活方式：表達CAR的T細胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結合腫瘤抗原,啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應；CARs表達的穩(wěn)定性依賴于所用的胞內信號域；大多數(shù)試驗在細胞擴增、體內存活時間、細胞因子分泌等方面存在不足，治療效果不明顯。CAR-T細胞的發(fā)展過程第一代CAR-T細胞5CAR-T細胞的發(fā)展過程第二代CAR-T細胞發(fā)表時間：2010年；嵌合受體的形成方法：T細胞的完全活化有賴于雙信號*和細胞因子的作用。因此，依照T細胞活化的雙信號學說,第二和第三代CARs在嵌合受體上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatorymolecule,CM)，以提高T細胞的細胞毒性、增殖活性,維持T細胞應答,延長T細胞存活時間等（圖2）；CD28、CD134對提高初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的細胞因子分泌非常重要；在治療慢淋中觀察到：體內擴增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的時間也超過6個月,分泌的細胞因子如干擾素-γ、CXCL9等較治療前顯著增高。*第一信號為特異性信號,由TCR識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-MHC復合物所啟動;第二信號為協(xié)同刺激信號,通過CD28/B7等重要的共刺激分子,促進IL-2合成,并使T細胞充分活化及免于凋亡。CAR-T細胞的發(fā)展過程第二代CAR-T細胞*第一信號為特異6CART細胞介紹優(yōu)質課件7CAR-T細胞的發(fā)展過程第三代CAR-T細胞發(fā)表時間：2012年；嵌合受體的形成方法：以逆轉錄病毒為載體構建第三代CAR-T細胞(scFvCD20-CD28-CD137-CD3ζ）；患者輸注后4小時血液就檢測出有高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等細胞因子；效應細胞在體內存活的時間超過12個月；由于目前第三代CAR-T細胞臨床應用還比較少,故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代CAR-T細胞,以及選擇怎樣的共刺激分子組合,還需進一步觀察。CAR-T細胞的發(fā)展過程第三代CAR-T細胞8CAR-T細胞基因轉導的方法基因導入的載體主要分為病毒類和非病毒類;病毒載體的轉移效率高,培養(yǎng)T細胞到達臨床數(shù)量的時間相對較短,且不同病毒載體具有不同表達特點，故在基礎研究和臨床試驗中應用廣泛，是目前主要的基因治療載體。約70%的治療方案采用病毒載體。目前最常用的主要是逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒載體等；非病毒載體有裸DNA、脂質體、多聚物分子耦聯(lián)體等；近年來,，微環(huán)DNA被認為是最好的非病毒載體之一,在基因治療中已被廣為應用。CAR-T細胞基因轉導的方法基因導入的載體主要分為病毒類和非9CAR-T細胞臨床應用中的問題CAR-T細胞的脫靶效應(OFF-TARGETEFFECT)是細胞對設計之外的額外靶點的作用，導致針對正常組織的自身免疫病反應。原因：除了前列腺特異性膜抗原（PSMA），表皮生長因子受體Ⅲ（EGFRvⅢ等腫瘤特異性抗原外，大多數(shù)靶點是針對腫瘤相關抗原。這些抗原只是重要組織不表達或是損耗組織表達。CAR-T細胞的細胞因子風暴（CYTOKINESTORM）體液中多種細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量產生的現(xiàn)象，是引起急性呼吸窘迫綜合癥和多器官衰竭的重要原因。原因：CAR-T細胞更強的親和力和信號傳導功能使其結合相關抗原后，能大量釋放細胞因子，引起炎癥反應。CAR-T細胞的插入突變（

INSERTIONMUTATION)一個基因的DNA中如果插入一段外源DNA片段，那么其結構便被破壞而導致突變，稱為插入突變。原因：CAR-T技術是在T細胞中插入一段外源DNA片段，理論上說其結構已被破壞，存在一定的致瘤風險。CAR-T細胞臨床應用中的問題CAR-T細胞的脫靶效應(OF10CAR-T細胞存在問題的可能解決辦法首先,很多臨床試驗采用了劑量爬坡的治療方法。在同一代次的治療中,把細胞劑量由小到大分散到幾次回輸中,并不斷監(jiān)測細胞毒性;或是應用第一或者第二代CAR沒有觀察到毒性后,再開始下一代CAR-T細胞的治療,防止可能誘發(fā)大規(guī)模不良反應。其次,可以引入自殺基因的人工調控開關,通過自殺基因系統(tǒng)刪除識別靶抗原的剩余CAR-T細胞。第三,可以把CAR中信號結構域分裂到兩個不同CAR(信號一CAR和信號二CAR),只有當兩個CAR與腫瘤表面的靶抗原都結合以后,才能完全激活應答。第四,除了激活受體外,還可以引入抑制性CAR。最后,還可以根據(jù)靶抗原表達水平,微調CAR親和性。CAR-T細胞存在問題的可能解決辦法首先,很多臨床試驗采用11CAR-T細胞的發(fā)展方向嵌合抗原受體也不僅僅只是修飾T細胞,它還可以修飾CIK細胞、NK細胞以及γδT細胞等等。德國波恩大學的研究人員從結直腸癌患者外周血中采集和培養(yǎng)CIK細胞,并利用CEA+抗體特異性的CAR對CIK細胞進行改造,使CIK細胞獲得CAR的特性。將CAR-CIK細胞與CEA+腫瘤細胞共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)其分泌的IFN-γ,要高于與CEA-腫瘤細胞共培養(yǎng)情況;而用未改造的CIK細胞與CEA+/CEA–分別共培養(yǎng),卻未觀察到IFN-γ分泌增加,且CAR-CIK細胞的細胞毒效應也比未改造CIK細胞要高。CAR-T細胞的發(fā)展方向嵌合抗原受體也不僅僅只是修飾T細胞,12CAR-T細胞治療方法1：從癌癥病人身上分離免疫T細胞；2：利用基因工程技術給T細胞加入一個能識別腫瘤細胞，并且同時激活T細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體；3：體外培養(yǎng)，大量擴增CAR-T細胞，一般一個病人需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細胞（體型越大，需要細胞越多）；4：把擴增好的CAR-T細胞輸回病人體內；5：回輸之后的前幾天，嚴密監(jiān)護病人的身體反應，對癥處理。CAR-T細胞治療方法1：從癌癥病人身上分離免疫T細胞；13CAR-T細胞治療目前觀察到的臨床效果Till等用CAR-T細胞治療3例非霍奇金淋巴瘤。經PCR檢測,效應細胞在體內存活的時間超過12個月。臨床反應持續(xù)完全緩解2例,部分緩解1例。其中1例28歲利妥昔單抗難治性濾泡性淋巴瘤患者,CAR-T細胞治療3.5月后,頸部淋巴結在1~2周內迅速減小3cm。Brentjens等用CAR-T細胞治療5例急性B細胞白血病患者。通過治療,5例腫瘤迅速減小,且微小殘留病灶完全緩解。其中1例患者治療8天之后就很快得到完全緩解,3例患者緩解期已長達5月至24個月。Pule等用CAR-T治療兒童成神經細胞瘤。輸入6周后,仍然可以在病人血液內發(fā)現(xiàn)EBV特異性的CAR-T細胞,接受治療的11個患者中,6例患者在治療6周后出現(xiàn)腫瘤細胞壞死或腫瘤縮小。CAR-T細胞治療目前觀察到的臨床效果Till等用CAR-T14CART細胞介紹優(yōu)質課件15謝謝謝謝16CART細胞介紹CART細胞介紹17嵌合抗原受體（chimericantigenreceptor,CAR）T細胞技術；是過繼細胞免疫治療（adoptivecellularimmunotherapy，ACI)的一種；通過基因改造技術，讓患者T細胞表達嵌合抗原受體，使效應T細胞的靶向性、殺傷性和持久性均較常規(guī)應用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)；存在問題是脫靶效應、細胞因子風暴、插入突變；是一種特異性的免疫細胞抗腫瘤治療。什么是CAR-T細胞嵌合抗原受體（chimericantigenrecep18通過將識別腫瘤相關抗原(tumorassociatedantigen,TAA)的scFv和胞內信號域“免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs,ITAM,通常為CD3ζ或FcεRIγ)”在體外進行基因重組,生成重組質粒,再在體外通過轉染技術轉染到患者的T細胞,使患者T細胞表達腫瘤抗原受體,轉染后經過純化和大規(guī)模擴增后的T細胞,稱之為嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞）。CAR-T細胞在體內、外都具有對特定腫瘤抗原高度親和性及對抗原負載細胞高效殺傷特性（圖1）。在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膠質瘤等惡性腫瘤治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應。CAR-T細胞的設計思路通過將識別腫瘤相關抗原(tumorassociateda19CART細胞介紹優(yōu)質課件20CAR-T細胞的發(fā)展過程第一代CAR-T細胞發(fā)表時間：1989年；嵌合受體的形成方法：Eshhar研究小組將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復合物(ζ鏈)胞內結構域融合形成嵌合受體；激活方式：表達CAR的T細胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結合腫瘤抗原,啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應；CARs表達的穩(wěn)定性依賴于所用的胞內信號域；大多數(shù)試驗在細胞擴增、體內存活時間、細胞因子分泌等方面存在不足，治療效果不明顯。CAR-T細胞的發(fā)展過程第一代CAR-T細胞21CAR-T細胞的發(fā)展過程第二代CAR-T細胞發(fā)表時間：2010年；嵌合受體的形成方法：T細胞的完全活化有賴于雙信號*和細胞因子的作用。因此，依照T細胞活化的雙信號學說,第二和第三代CARs在嵌合受體上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatorymolecule,CM)，以提高T細胞的細胞毒性、增殖活性,維持T細胞應答,延長T細胞存活時間等（圖2）；CD28、CD134對提高初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的細胞因子分泌非常重要；在治療慢淋中觀察到：體內擴增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的時間也超過6個月,分泌的細胞因子如干擾素-γ、CXCL9等較治療前顯著增高。*第一信號為特異性信號,由TCR識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-MHC復合物所啟動;第二信號為協(xié)同刺激信號,通過CD28/B7等重要的共刺激分子,促進IL-2合成,并使T細胞充分活化及免于凋亡。CAR-T細胞的發(fā)展過程第二代CAR-T細胞*第一信號為特異22CART細胞介紹優(yōu)質課件23CAR-T細胞的發(fā)展過程第三代CAR-T細胞發(fā)表時間：2012年；嵌合受體的形成方法：以逆轉錄病毒為載體構建第三代CAR-T細胞(scFvCD20-CD28-CD137-CD3ζ）；患者輸注后4小時血液就檢測出有高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等細胞因子；效應細胞在體內存活的時間超過12個月；由于目前第三代CAR-T細胞臨床應用還比較少,故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代CAR-T細胞,以及選擇怎樣的共刺激分子組合,還需進一步觀察。CAR-T細胞的發(fā)展過程第三代CAR-T細胞24CAR-T細胞基因轉導的方法基因導入的載體主要分為病毒類和非病毒類;病毒載體的轉移效率高,培養(yǎng)T細胞到達臨床數(shù)量的時間相對較短,且不同病毒載體具有不同表達特點，故在基礎研究和臨床試驗中應用廣泛，是目前主要的基因治療載體。約70%的治療方案采用病毒載體。目前最常用的主要是逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒載體等；非病毒載體有裸DNA、脂質體、多聚物分子耦聯(lián)體等；近年來,，微環(huán)DNA被認為是最好的非病毒載體之一,在基因治療中已被廣為應用。CAR-T細胞基因轉導的方法基因導入的載體主要分為病毒類和非25CAR-T細胞臨床應用中的問題CAR-T細胞的脫靶效應(OFF-TARGETEFFECT)是細胞對設計之外的額外靶點的作用，導致針對正常組織的自身免疫病反應。原因：除了前列腺特異性膜抗原（PSMA），表皮生長因子受體Ⅲ（EGFRvⅢ等腫瘤特異性抗原外，大多數(shù)靶點是針對腫瘤相關抗原。這些抗原只是重要組織不表達或是損耗組織表達。CAR-T細胞的細胞因子風暴（CYTOKINESTORM）體液中多種細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量產生的現(xiàn)象，是引起急性呼吸窘迫綜合癥和多器官衰竭的重要原因。原因：CAR-T細胞更強的親和力和信號傳導功能使其結合相關抗原后，能大量釋放細胞因子，引起炎癥反應。CAR-T細胞的插入突變（

INSERTIONMUTATION)一個基因的DNA中如果插入一段外源DNA片段，那么其結構便被破壞而導致突變，稱為插入突變。原因：CAR-T技術是在T細胞中插入一段外源DNA片段，理論上說其結構已被破壞，存在一定的致瘤風險。CAR-T細胞臨床應用中的問題CAR-T細胞的脫靶效應(OF26CAR-T細胞存在問題的可能解決辦法首先,很多臨床試驗采用了劑量爬坡的治療方法。在同一代次的治療中,把細胞劑量由小到大分散到幾次回輸中,并不斷監(jiān)測細胞毒性;或是應用第一或者第二代CAR沒有觀察到毒性后,再開始下一代CAR-T細胞的治療,防止可能誘發(fā)大規(guī)模不良反應。其次,可以引入自殺基因的人工調控開關,通過自殺基因系統(tǒng)刪除識別靶抗原的剩余CAR-T細胞。第三,可以把CAR中信號結構域分裂到兩個不同CAR(信號一CAR和信號二CAR),只有當兩個CAR與腫瘤表面的靶抗原都結合以后,才能完全激活應答。第四,除了激活受體外,還可以引入抑制性CAR。最后,還可以根據(jù)靶抗原表達水平,微調CAR親和性。CAR-T細胞存在問題的可能解決辦法首先,很多臨床試驗采用27CAR-T細胞的發(fā)展方向嵌合抗原受體也不僅僅只是修飾T細胞,它還可以修飾CIK細胞、NK細胞以及γδT細胞等等。德國波恩大學的研究人員從結直腸癌患者外周血中采集和培養(yǎng)CIK細胞,并利用CEA+抗體特異性的CAR對CIK細胞進行改造,使CIK細胞獲得CAR的特性。將CAR-CIK細胞與CEA+腫瘤細胞共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)其分泌的IFN-γ,要高于與CEA-腫瘤細胞共培養(yǎng)情況;而用未改造的CIK細胞與CEA+/