植物抗病基因研究進展

植物抗病基因研究進展摘要：植物抗病基因的研究是目前植物病理學(xué)科的熱點及難點之一。近年來，通過基因工程技術(shù)培育抗病毒植物已經(jīng)成為抵抗植物病毒的有效手段。本文簡要討論了近年來植物抗病毒基因工程的方法策略，并對植物抗病基因工程的研究取得的成績、存在的問題及展望進行了簡介。關(guān)鍵詞植物病毒、抗病基因、基因工程、前景一、植物抗病基因工程原理植物抗病基因工程指的是用基因工程（遺傳轉(zhuǎn)化）的手段提高植物的抗病能力，以此獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相關(guān)基因的分離和克隆、與合適的載體及標(biāo)記基因構(gòu)成適于轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒、用不同的轉(zhuǎn)化方法向受體植物導(dǎo)入重組質(zhì)粒、篩選轉(zhuǎn)化因子并鑒定轉(zhuǎn)基因植株。止匕外，還有一種可以獲得抗病轉(zhuǎn)基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA直接導(dǎo)入受體植物，從后代中篩選具有抗病能力的個體，經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因抗病植株。植物病毒每年給世界各地的農(nóng)作物生產(chǎn)造成嚴重損失，每年全世界的農(nóng)作物因病毒侵害的損失數(shù)百億美元，傳統(tǒng)的防治方法已遠遠無法滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)要求。病毒侵染之所以復(fù)雜，在于一方面病毒的高突變率所致的植物抗病品種抗性喪失速度遠高于常規(guī)植物抗病育種速度；另一方面病毒在隱癥野生植物中的儲存；第三，無親緣關(guān)系的病毒復(fù)合侵染以及病毒侵染的持久性，特別是以線蟲和真菌傳播的植物病毒能在土壤中存活許多年。因此，在適宜病毒介體生長的溫度條件下，大面積連作缺乏抗病基因的植物，造成的經(jīng)濟損失會更高。Hamilton[1]于20世紀80年代初首先提出了基因工程保護的設(shè)想，在轉(zhuǎn)基因植物中表達病毒基因組序列可能是防御病毒侵染的途徑之一。近20多年來，基因工程的發(fā)展，為防治病毒病開辟了新途徑。二、利用非病毒來源的基因策略.植物自身基因介導(dǎo)的病毒抗性一些植物在病毒侵染的時會啟動主動防御機制，最普遍最常見的主動防御機制就是通常所說的過敏反應(yīng)，也就是那些最初被病原侵染點周圍的細胞發(fā)生程序性死亡最終在病原最初侵染點周圍形成壞死斑。如番茄中的Tm-1或Tm-2和Tm-22基因，馬鈴薯的Rx,Ry,煙草中的N基因等等⑵。這類基因通常稱為R基因。根據(jù)其抗性水平的不同還分為：真實免疫指病毒復(fù)制完全不能發(fā)生、閾下侵染指病毒的復(fù)制僅局限于受侵染的細胞。不管R基因是在模式植物還是在不同的作物品種中，所有的R基因編碼的蛋白質(zhì)分別具有富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)或絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)［3］。這些植物基因如何識別病原物或病原物的基因產(chǎn)物，以及因此而產(chǎn)生抗性的機理仍不清楚。姜國勇冏研究小組通過對Tm-22基因轉(zhuǎn)化體在不同啟動子的調(diào)控下，對ToMV-2a毒株感染所表現(xiàn)的癥狀不同，說明啟動子在Tm-22基因的抗病反應(yīng)中具有非常重要作用。只有當(dāng)攜帶無毒基因的病原攜抗性基因的寄主互作是，二者才表現(xiàn)不親和性，既寄主表現(xiàn)抗??；其他情況下，二者均表現(xiàn)親和，即寄主感病?；?qū)虻挠^點已在包括真菌、細菌、病毒和線蟲等植物病害的研究中得到廣泛證明。利用植物自身編碼的抗病毒基因策略，通過基因工程技術(shù)培育抗病品種能克服常規(guī)育種周期長的特點。但由于在自然條件下許多植物不存在抗性基因或者目的基因的分離和鑒定存在一定的難度，更重要的是自然界中病毒的繁殖突變速度是相當(dāng)驚人的，只要其某個氨基酸發(fā)生了變異就能使病毒克服植物抗病毒基因的抗性。所以由于其復(fù)雜性利用植物自身的抗病毒基因的策略在植物抗病毒基因工程的研究中還不是主要的。.PR蛋白基因病程相關(guān)基因介導(dǎo)的抗性這是一類當(dāng)植物受病原物侵染或其他因子的刺激、脅迫產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)。PR蛋白根據(jù)分子生物學(xué)特性和血清學(xué)關(guān)系可分為5組,(PR1-PR5),其中PR-1與病毒抗性關(guān)系密切，其抗病機理可能是它們參與植物細胞壁抗侵染的作用，還有的認為這組PR蛋白可能是靠協(xié)調(diào)作用才能抵抗病毒。但至今，轉(zhuǎn)PR蛋白基因的植物其抗性水平并不理想。.潛在自殺基因?qū)⒅参飦碓吹亩舅氐鞍?如抗病毒蛋白等)基因克隆到某種病毒的啟動子下游，再將這一重組體以反義形式克隆到植物表達載體中并轉(zhuǎn)化植物。植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出包含病毒啟動子與該病毒蛋白在內(nèi)的復(fù)合物，但不會翻譯表達有功能的活性毒素蛋白。然而，一旦該種病毒侵染植物，其體內(nèi)已經(jīng)轉(zhuǎn)錄出的反義RNA會利用病毒酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄出正義鏈的mRNA,mRNA!翻譯表達則產(chǎn)生有功能的活性毒素蛋白，結(jié)果,病毒侵染了的細胞死亡而鄰近的細胞不受影響。.%、B干擾素基因它是一種小分子量蛋白，是脊椎動物在受病毒感染后分泌的一種蛋白，能結(jié)合在細胞膜上，形成抗病毒結(jié)構(gòu)，它具有廣譜抗性。三、利用病毒起源的基因介導(dǎo)的抗性策略.利用病毒外殼蛋白基因介導(dǎo)病毒抗性外殼蛋白基因介導(dǎo)的病毒抗性是研究最早也是目前比較成功的抗病毒手段，該策略主要是將病毒的外殼蛋白基因進行體外克隆體外重組及構(gòu)建表達載體然后將重組的基因轉(zhuǎn)化到植物細胞內(nèi)并得以表達從而使轉(zhuǎn)基因植物獲得抗病毒的能力。自從1986年美國華盛頓大學(xué)R.Beachy⑸研究小組通過植物基因工程技術(shù)，首次將煙草花葉病毒（TMV）的CP基因?qū)霟煵荩嘤瞿芊€(wěn)定遺傳的抗TMV煙草植株，開創(chuàng)了植物抗病育種的新領(lǐng)域。迄今為止，科學(xué)者們已經(jīng)克隆了至少15個病毒組中30種病毒的CP基因并成功轉(zhuǎn)化了20多種植物有些株系已進入田間試驗并顯示了與實驗室一致的抗病效果[6]。目前關(guān)于CP基因介導(dǎo)的抗性機理主要有以下幾種觀點：a、CP的表達抑制了病毒的脫殼轉(zhuǎn)基因植物細胞內(nèi)大量游離的衣殼蛋白亞基的存在使病毒基因組的5'端難以釋放阻礙了病毒的脫殼。b、CP干擾病毒RNA的復(fù)制，當(dāng)入侵病毒的裸露核酸進入植物細胞后，它們立即被植物細胞中的自由CP所重新包裹，阻止了核酸的復(fù)制。c、CP限制了病毒粒子的擴展和轉(zhuǎn)運：Wisniewski[7]等人證明在轉(zhuǎn)TMV-CP基因的植株中，在接種TMV后，不僅阻礙了TMV在接種葉上的擴展速率，而且也降低了TMV從接種到上部葉的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運。d、抗性的產(chǎn)生是由于CP基因表達的mRNAW病毒RNA之間相互作用的結(jié)果。.復(fù)制酶介導(dǎo)的保護作用復(fù)制酶是指由病毒編碼的能特異合成病毒正負鏈RNA的RNA聚合酶其核心功能是合成全長的病毒基因組RNA該策略就是通過在植物中表達完整的復(fù)制酶、復(fù)制酶亞基基因后者是突變或缺失的復(fù)制酶基因序列從而使轉(zhuǎn)基因植物獲得病毒抗性。關(guān)于復(fù)制酶的抗性機制目前還沒有準(zhǔn)確的定論，大家推測，其介導(dǎo)的抗性既可以在蛋白質(zhì)水平上也可以在RNA水平上。在RNA水平上，Lomonosslf網(wǎng)等認為轉(zhuǎn)入的mRNA與病毒的復(fù)制酶進行無效結(jié)合抑制了復(fù)制酶的正常功能，或者是mRNA誘導(dǎo)了植物的自然抗病性。在蛋白質(zhì)水平上，Suzuki網(wǎng)等認為復(fù)制酶基因在蛋白質(zhì)水平上介導(dǎo)的抗性包含兩種作用模型：模型1:轉(zhuǎn)基因植物表達的完整復(fù)制酶蛋白在病毒的自然侵染過程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮正常的功能，從而打破了病毒正鏈和負鏈復(fù)制的平衡，或者擾亂了控制復(fù)制酶活性的反饋抑制途徑。模型2:轉(zhuǎn)基因植物表達的突變型或缺損型的復(fù)制酶蛋白，在復(fù)制酶復(fù)合體的裝配過程中，與野生型復(fù)制酶競爭由寄主或病毒編碼的復(fù)制酶復(fù)合體的其它成分，或者競爭其它寄主因子或底物，從而使野生型復(fù)制酶不能正常行使其功能，干擾病毒的復(fù)制。復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性還涉及到其它機制，顯示了抗性機理的復(fù)雜性。3,利用病毒運動蛋白基因介導(dǎo)的病毒抗性植物病毒侵染宿主植物后在體內(nèi)的運轉(zhuǎn)方式主要有兩種，一是通過植物維管組織進行的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，二是通過胞間連絲在細胞之間的移動。病毒在細胞間的移動是一主動的過程，需要病毒編碼的蛋白參與，這種蛋白稱移動蛋白。移動蛋白基因介導(dǎo)的抗性機理：主要是利用編碼失去活性的病毒移動蛋白的基因干擾病毒的擴散和移動。.利用衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性病毒衛(wèi)星RNA是一類依賴于輔助病毒才能復(fù)制的低分子量RNA它不能編碼外殼蛋白，只裝配于輔助病毒的外殼蛋白中，其復(fù)制必須依靠輔助病毒進行。衛(wèi)星RNA的抗性機理現(xiàn)在一般認為是衛(wèi)星RNA與病毒基因組RNA爭奪病毒復(fù)制酶位置，最終以數(shù)量優(yōu)勢抑制了病毒基因組的復(fù)制。衛(wèi)星RNA介導(dǎo)抗性具有以下的優(yōu)點和不足，一方面衛(wèi)星RNA只需很低的表達，就能使植株獲得高抗，而且這種抗性并不產(chǎn)生特異蛋白，這樣提高了轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性。另一方面，對轉(zhuǎn)化植株起保護作用的衛(wèi)星RNA一旦被病毒包裝傳播到其他植物，可能會引起嚴重的癥狀。還有衛(wèi)星RNA有可能變成毒性衛(wèi)星RNA,從而失去對病毒的防治作用，加重病毒癥狀。.利用核酶基因介導(dǎo)的抗性策略核酶是一類具有特殊二級結(jié)構(gòu)，能特異性催化切割自身以及其它RNA分子的小分子RNA,其結(jié)構(gòu)可以分為錘頭型和發(fā)夾型兩類。錘頭型核酶較為普遍，其專一切割靶RNA內(nèi)緊鄰該切割位點下游的磷酸二酯鍵。任何生物的RNA都可以作為核酶的底物，而且核酶對底物作用位點的堿基序列要求不嚴格。根據(jù)這一特性，人們可以設(shè)計成用來切割已知序列的病原性RNA的人工核酶。王蘇燕等人利用核酶等策略在轉(zhuǎn)基因油菜中產(chǎn)生了對花椰菜花葉病毒CaMV的高度抗性[10]。另一方面因為任何生物的RNA都可以作為核酶的底物所以我們也要注意其可能將生物體內(nèi)有用的RNA作為靶進行切割，破壞正常細胞的生理功能。四、植物抗病基因工程的前景展望植物基因工程是細胞水平和分子水平上的遺傳操作，其最大優(yōu)點是能地利用人們所感興趣的外源基因使工作更具目的性，給植物抗病育種提供了一條有用的途徑。但是抗病基因所介導(dǎo)的抗病性具有高度?；?，只針對一種病害的一個或幾個小種，抗病譜范圍比較窄；而導(dǎo)入防衛(wèi)反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)基因植株大多表現(xiàn)出部分抗性。因此，多數(shù)轉(zhuǎn)單基因的抗病植物，抗病機制單一，抗多病害或抗多小種的能力低，一旦病原菌群體發(fā)生變化，抗病性就可能被克服。因此植物抗病基因工程的趨勢是創(chuàng)建持久、廣譜的抗病性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新的抗病毒策略不斷涌現(xiàn)，如利用病毒弱毒株的全長cDNA植物的自殺基因等.目前，為進一步提高工程植株的抗病性，人們多采用復(fù)合基因策略，即轉(zhuǎn)多種抗性基因控制一種病毒，可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性強度和抗病的持久性；轉(zhuǎn)多種抗性基因控制病毒的復(fù)合侵染，可以提高轉(zhuǎn)基因植物抗病的廣譜性，這是轉(zhuǎn)基因抗病毒育種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的趨勢.因為一種植物在自然條件下常受多種病毒的侵染，只有抗多種病毒的轉(zhuǎn)基因植物，才能達到控制病毒病害的目的。綜上所述，植物抗病基因工程要獲得深入發(fā)展，加強相應(yīng)的基礎(chǔ)研究是十分重要的。病原菌致病手段多種多樣，植物的防衛(wèi)機制也是多方面的，隨著植物抗病機制的深入研究，抗菌基因工程的策略和手段也會得到不斷拓寬，必將在植物病害防治中發(fā)揮更大的作用。參考文獻Hamilton,RI.Defensetriggeredbypreviousinvaders:Viruses.In:HorsefallJG,cowlingEB.PlantDisease:AnAdvancedTreatise5.NewYork:AcademicPress,1980:279-303.BakerB,ZambryskiP,StaskawiczB,etal.SingalinginplantMicrobeInteractions.Science,1997,276:726-733.DanglJL.Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection..Nature,2001,411:826-833.[4]姜國勇，楊仁崔.番茄Tm-22基因在煙草中的表達及其對番茄花葉病毒(ToMV)的特異抗性[J].病毒學(xué)報，2003,19(4):365-370.[5]PowellAbelP,NelsonRS,DeB,etal.Delayofdiseasedevelopmentintransgenicplantsthatexpressthetobaccomosaicviruscoatproteingene[J].Science,1986,232:738-743.[6]張海燕，陳正華.獲得病毒抗性的植物基因工程策略及其抗病機理研究進展[J].武漢植物學(xué)研究,1997,17(增刊):15-24.WisniewskiLA,PowellPA.Localandsystemicspreadoftobaccomosaicvirusintransgenictobaccoplant.ThePlantCell,1990,(2):559-567.Lom