動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別

山東大學實驗報告年月日姓名系年級組別同組者科目細胞生物學實驗題目動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別學號動物細胞培養(yǎng)與細胞生死狀態(tài)的鑒別【實驗目的】學習并掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。了解并掌握用組織塊貼壁培養(yǎng)法和消化細胞培養(yǎng)法進行動物細胞原代培養(yǎng)的實驗方法。了解動物細胞傳代培養(yǎng)的實驗方法。學習細胞生死狀態(tài)鑒別的原理及方法。熟悉和掌握各種鑒別細胞生死狀態(tài)方法的判定特征。掌握細胞計數(shù)方法，計算細胞存活率?！緦嶒炘怼浚ㄒ唬┘毎囵B(yǎng)細胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。動物細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。從供體獲得組織細胞，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化或機械分散等方法，將動物組織分散成單個細胞開始首次培養(yǎng)長出單層細胞的方法稱為細胞的原代培養(yǎng)。當培養(yǎng)的動物細胞生長增殖達到一定密度，形成致密的單層細胞時，用胰蛋白酶將細胞消化分散成單細胞，從一個容器中以1：2或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個容器中擴大培養(yǎng)的方法，稱為細胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計次數(shù)就是細胞的培養(yǎng)代數(shù)。高等生物是由多細胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內(nèi)的功能活動是十分困難的。但如果把活細胞拿到體外培養(yǎng)、增殖并進行觀察和研究，則要方便和簡單得多。被培養(yǎng)的動物細胞是非常好的實驗對象和實驗研究材料，對體外培養(yǎng)的活細胞進行研究可以幫助人類揭開生老病死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老和防治各種疾病的途徑和機制，也可以人為地誘導和改變細胞的遺傳性狀和特性，使其向有利于人類健康長壽的方向發(fā)展。因此動物細胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究細胞分子機制非常重要的實驗手段，被廣泛應用于醫(yī)學、生物技術(shù)、基因工程等研究領(lǐng)域。（二）細胞生死狀態(tài)的鑒別細胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學染色法和熒光染色法。活細胞和死亡細胞在生理技能和性質(zhì)上主要存在以下差異：=1\*GB3①細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性地通過；而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加?；诖耍l(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細胞著色，而活細胞不被著色。此外，應用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細胞的生死狀態(tài)?；罴毎脑|(zhì)具有選擇透過性，死細胞因其原生質(zhì)的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。=2\*GB3②代謝上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內(nèi)的酶具有較強的活性和還原能力。基于此，發(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸收進入，活細胞內(nèi)的酯酶具有較強的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能發(fā)熒光的熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞內(nèi)，熒光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光；而死亡細胞內(nèi)的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。活細胞因具有較強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型變成無色的還原型，故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色后顯示無色；死亡酵母細胞或代謝緩慢的衰老酵母細胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍色或淡藍色?！緦嶒灢牧稀科鞑模航馄始?、解剖鑷、培養(yǎng)皿、紗布塊、玻璃漏斗、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、L型注射器、離心管等。上述器材需徹底洗凈、烤干、包裝好，滅菌，備用。超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、普通光學顯微鏡、離心機、血球計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、解剖板、蓋玻片等。試劑：培養(yǎng)液、PBS液0.4%臺盼藍染液、0.15%伊紅染液材料：小白鼠【實驗步驟】取材取小白鼠一只，采用斷頭法處死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1—2次。轉(zhuǎn)入無菌玻璃培養(yǎng)皿，待用。分離脾細胞用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后將其沿脾長軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以利于細胞散開）。用針尖在脾臟上扎眼，并用“L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細胞，稍傾斜并靜置1—2分鐘。吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/分離1—2分鐘。培養(yǎng)脾細胞超凈工作臺中取塑料培養(yǎng)皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養(yǎng)液2ml，并在皿蓋上畫上標記，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內(nèi)開蓋棄去上清液，用“槍（200μl）”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ml加入棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，然后吸取200ml脾細胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。臺盼藍法鑒定細胞的生死狀態(tài)（1）試劑配制：用生理鹽水配置0.4%臺盼藍染液，備用。（2）細胞懸液制備：將生長有貼壁型細胞的培養(yǎng)瓶（皿）中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，靜置3-5min，待見到細胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中，用滴管輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。（3）染色制片：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合，2min后制成臨時裝片，鏡檢。（4）染色結(jié)果：死細胞染成藍色，活細胞不著色?；蛘撸?）染色計數(shù)：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少許染色后的細胞懸液于放有蓋片的血球計數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。在普通光鏡10′物鏡下計數(shù)四個大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。（4）根據(jù)染色結(jié)果計算活細胞率：依據(jù)死細胞染成藍色、活細胞不著色的原則計數(shù)死細胞數(shù)和細胞總數(shù)，以如下公式計算細胞存活率：細胞存活率附：血球計數(shù)板血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分割成兩半，每個半邊上面各有有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分九大格，其中間的一大格（又稱計數(shù)室）常被用作細胞的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格,而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，他們都有一個共同特點，即每個大方格都有400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,每個小方格的面積為1/400mm2,蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3，所以每個小方格的體積為1/400mm3若取四個大方格的細胞數(shù)，則：

每毫升液體中細胞的數(shù)=每個大方格中的細胞數(shù)量*10000*稀釋倍數(shù)【實驗結(jié)果】經(jīng)培養(yǎng)后，剛從培養(yǎng)箱中取出的細胞培養(yǎng)液呈微黃色。放置一段時間后，細胞培養(yǎng)液顏色恢復為粉紅，澄清透明。圖1培養(yǎng)液鏡檢結(jié)果取老師提供的細胞染色后置于顯微鏡下觀察時，可見視野中有很少的帶有淺藍色的細胞，而透明細胞較多。中方格的位置（相對于視野的位置）死細胞數(shù)活細胞數(shù)細胞總數(shù)左上05353左下15657右上35457右下06060細胞存活率=53+56+=9080000注：細胞計數(shù)及存活率的計算結(jié)果均對應于老師提供的細胞?！舅伎寂c討論】（一）實驗結(jié)果分析活細胞邊緣較明顯，而使細胞膜維持正常的選擇透過性，染料無法通過，所以呈現(xiàn)透明無色。死細胞由于細胞膜不再具有生物活性，染料從細胞膜通過，將細胞染色，且死細胞的邊緣不明顯。將培養(yǎng)基剛從培養(yǎng)箱拿出來時，培養(yǎng)基的顏色應呈現(xiàn)無色（由于細胞的代謝產(chǎn)物為酸性以及培養(yǎng)箱中的二氧化碳濃度較高），過一段時間后漸漸恢復粉紅色。用倒置顯微鏡觀察時，可以看到在黃色的背景下有一些透明的細胞。（二）注意事項在進行方格查數(shù)時要注意：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。實驗涉及的臺盼藍染料有致癌危險，因此滴加染液時要小心，防止濺到皮膚上。動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴格消毒或滅菌處理，才能在超凈工作臺中使用，整個實驗過程都要有無菌操作的概念，避免細胞被污染。在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈后，實驗操作應在火焰的附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼后要待其冷卻才能夾取組織，經(jīng)過培養(yǎng)液的用具不能長時間燒灼，以免燒焦形成碳膜。超凈工作臺內(nèi)吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互污染。在超凈工作臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能敞開暴露過久，以免溶液蒸發(fā)和pH變化。器皿、離心管培養(yǎng)瓶等在離開超凈工作臺前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細胞污染或溶液漏出。（三）反思與總結(jié)做實驗的時候由于顯微鏡的光線問題，死細胞的顏色有時不太明顯，在觀察的時候需要注意。將脾加入到培養(yǎng)基后，準備將其加入到培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，檢測一下培養(yǎng)基中是否有氣泡，若有氣泡的話，則應除去后再放置。用注射器的針頭對小白鼠的脾進行穿孔時要小心操作，既不能刺得太狠將脾弄破，也不能刺得太輕使得到的脾細胞過少。注意進行無菌實驗操作的規(guī)范，身體只有消過毒的部分才可進入超凈工作臺，防止身體的其他部分將細菌帶入。注意用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)基中細胞的正確方法。（四）思考題為什么要學習細胞生死狀態(tài)鑒別的方法？試說明其實際應用意義。答：在細胞培養(yǎng)的實驗室操作以及制造生物制劑時，有時需要確定某舟細胞的生存狀態(tài)，以便進行下一步操作，因此選擇恰當?shù)募毎罓顟B(tài)鑒別的方法是十分重要的。各種細胞生死狀態(tài)方法的原理和判定特征是什么？答：原理主要是基于細胞膜的選擇透過性和代謝上的差異。鑒別方法主要是化學染色法和熒光染色法。化學染色法：活細胞的細胞膜是一層選擇透過性膜，只允許物質(zhì)選擇性地通過，而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加。因此一些化學染料能使死亡細胞著色，而活細胞不著色。熒光染色法：活細胞中新陳代謝作用強，一些酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸入，活細胞的酶有較強的活性，將其分解成能發(fā)熒光的熒光素該物質(zhì)不能自由透過細胞膜，積累在細胞內(nèi)，顯微鏡下顯示有明顯的熒光；而死細胞內(nèi)的新陳代謝停止，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下不發(fā)光。除此之外，鑒別植物細胞的死活還可以采用其質(zhì)壁分離性質(zhì)，將植物細胞放入高滲溶液中，觀察其是否發(fā)生質(zhì)壁分離。若發(fā)生，則為活細胞；若不發(fā)生，則為死細胞。活細胞、壞死細胞和凋亡細胞的形態(tài)特征是什么？它們的主要區(qū)別有哪些？答：活細胞的外形較規(guī)則，細胞膜的邊緣明顯，細胞中能夠清晰地看到細胞核。壞死細胞的特點是：細胞質(zhì)膜和核被膜破裂，細胞骨架和核纖層解體。細胞質(zhì)溢出，影響到周圍細胞，發(fā)生炎癥反應。細胞凋亡的特點：細胞質(zhì)凝縮，細胞萎縮，細胞骨架解體，核纖層分解，核被膜破裂，核DNA分解成片段，出現(xiàn)梯形電泳圖。細胞壞死指的是細胞收到物理、化學因素的損傷，如機械損傷、毒物、微生物、輻射等，引起的細胞死亡。而凋亡是“細胞的程序性死亡”，是個體發(fā)育、存活必需的正常秩序的一部分。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。在動物細胞培養(yǎng)操作過程中，應如何加強無菌操作的觀念以避免細胞污染？答：動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴格消毒或除菌處理，才能進超凈工作臺中使用整個實驗過程都要有無菌操作概念，避免細胞被污染。組織塊貼壁培養(yǎng)時，為什么要將貼有組織塊的培養(yǎng)瓶先翻轉(zhuǎn)過來培養(yǎng)？翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶的時間不宜過長，為什么？答：為了使組織塊略干燥能牢固粘于瓶壁上。時間過長，則組織粘得太緊，不方便培養(yǎng)。皮膚組織塊培養(yǎng)時，要靜置培養(yǎng)并盡量減少晃動培養(yǎng)瓶，為什么？答：晃動培養(yǎng)瓶可能會影響細胞的生長，使剛生成的細胞膜破裂。加入培養(yǎng)液后，即可終止胰蛋白酶的消化作用，為什么？答：加入培養(yǎng)液后，細胞獲得了足夠的養(yǎng)分，也就解除了接觸抑制的狀態(tài)，因此胰蛋白酶的消化作用終止。在細胞傳代時，將原培養(yǎng)液倒去后用D-Hank’s工作液洗滌細胞2遍，再加胰蛋白酶，為什么？答：D-Hank’s是常見的平衡鹽溶液之一，它是組織基本用液之一、在細胞傳代時，要確保傳代細胞的細胞的滲透壓與培養(yǎng)液保持一致，因此需要用D-Hank’s工作液洗滌，起到過度作用?！咀鳂I(yè)】（一）抑制腫瘤細胞增殖藥物的篩選方法。1.MTT法（1）接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.（2）培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天（可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。（3）呈色：培養(yǎng)3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS<ph=7.4>配)20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。（4）比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。2.熒光染色法第一種方法是定量的確定熒光強度，然后來半定量的說明細胞活著的數(shù)目。第二種方法是取多視野拍攝熒光照片（細胞應該在培養(yǎng)皿上貼壁），然后用軟件ImageJ來數(shù)出細胞數(shù)量,這樣取平均數(shù)。3.WST-1法方法體外培養(yǎng)人鼻咽癌細胞至對數(shù)生長期．加入待檢抗癌藥物。繼續(xù)培養(yǎng)48h后每組各取6孔加入一定量的WST-1試劑，然后測定OD570值，計算細胞相對增殖度RGR1，每組再各取6孔，加入5g/L結(jié)晶紫羅蘭染色3min后，加入10g/L十二烷基磺酸鈉，測定OD588值。4.巢蛋白法（1）提供腫瘤的特定細胞株和培養(yǎng)條件（2）鑒定上述腫瘤細胞株表達巢蛋白的表達（3）加入待篩選的藥物（4）培養(yǎng)48小時或更長的時間，檢測巢蛋白的表達，檢測結(jié)果與b步驟的結(jié)果進行比較，如果出現(xiàn)巢蛋白表達下調(diào)的情形，該待選藥物成為抑制腫瘤增殖和/或促進細胞凋亡的先導藥物。（二）誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的藥物的篩選方法。方法：1.利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進入細胞，篩選穩(wěn)定表達E2F-1的細胞克隆，通過Northernblotting法和Westernblotting法鑒定陽性細胞克隆中E2F-1的表達水平以及相應PACl的表達水平；應用熒光素酶法檢測E2F-1蛋白對PAC1啟動子序列的轉(zhuǎn)錄激活水平，并借助體內(nèi)ChromatinIP法和體外EMSA法分析E2F-1轉(zhuǎn)錄因子與PAC1啟動子之間的特異性結(jié)合作用。2.分別應用Westernblotting法，臺盼藍染色法和TUNEL凋亡檢測法，鑒定高表達E2F-1的細胞經(jīng)藥物4-羥苯基維胺脂(4-HPR)處理后其ERK1/2MAPK激酶的水平變化，細胞的生存率變化和凋亡出現(xiàn)的情況；建立高表達PAC1的穩(wěn)定細胞克隆并檢測PAC1本身對ERK1/2MAPK激酶磷酸化水平的影響和對細胞生長的抑制現(xiàn)象；通過小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建表達PAC1-siRNA的穩(wěn)定細胞株，進一步檢測PAC1在E2F-1介導的腫瘤細胞凋亡反應中的作用。3.利用脂體瞬時轉(zhuǎn)染法構(gòu)建細胞Saos-2/siE2F1和Saos-2/siPAC1，應用Wresternblotting法比較細胞中經(jīng)4-HPR處理前后E2F-1和PAC1的表達水平以及ERK1/2的磷酸化水平，并用臺盼藍染色法檢測細胞在不同劑量的4-HPR處理下存活率的改變規(guī)律；在Saos-2細胞系統(tǒng)中，用Westernblotting法檢測E2F-1下游相關(guān)靶分子，包括p73、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的蛋白變化情況；選擇人成纖維細胞株NHF3作為研究對象，通過檢測細胞在不同劑量或不同時間的4-HPR處理下E2F．1、PAC1和p-ERK1/2的表達及細胞存活率的改變，探討藥物4-HPR對正常細胞的作用；應用其他幾種臨床常用的抗腫瘤藥物，如依托泊苷Etoposide(50μM)、5-氟尿嘧啶5-FU(30μM)、阿霉素Doxorubicin(1.7μM)和吲哚美辛Indomethacin(500μM)，與藥物4-HPR進行平行比較，檢測高表達E2F-和PAC1的細胞在不同藥物處理下的存活率。結(jié)果：1.在細胞MB435/E2F1-C2和MB435/E2F1-C3中有高水平的E2F-1轉(zhuǎn)錄和表達，同時PACI的mRNA水平和蛋白水平也隨著E2F-1相應升高；熒光素酶法結(jié)果顯示，與對照組的空白質(zhì)粒相比，共轉(zhuǎn)染E2F-1的表達質(zhì)粒和含正常PAC1啟動序列的熒光素酶報告質(zhì)?？梢允箼z測到的熒光素酶活性增加約15倍，E2F-1可以通過激活PAC1的啟動子實現(xiàn)對PAC1的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控；體內(nèi)ChromatinIP法和體外EMSA法的結(jié)果證實E2F-1轉(zhuǎn)錄因子與PAC1啟動子之問有特異性結(jié)合作用。2.在抗腫瘤藥物4-HPR作用下，高表達E2F-1可以抑制ERK1/2MAPK激酶的活化并誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡；利用高表達。PAC1的細胞進行一系列檢測，結(jié)果顯示PAC1本身也可以通過抑制ERK1/2MAPK激酶信號通路而誘導腫瘤細胞凋亡；進一步對PAC1-siRNA細胞克隆的檢測顯示當除去PAC1的作用以后，E2F-1就不能夠抑制ERK1/2激酶的活化，而且E2F-1也不能夠有效地介導4-HPR作用下的細胞凋亡反應，證明PACI是E2F-1凋亡通路中重要的介導者，在E2F-1誘導的腫瘤細胞凋亡反應中起重要作用。3.對細胞Saos．2/siE2F1和Saos-2/siPAC1的檢測結(jié)果顯示在降低了內(nèi)源性的E2F-1表達水平或PAC1表達水平后，其對ERK1/2激酶的抑制作用減弱，細胞對藥物4-HPR的敏感性降低；檢測其它一些與E2F-1凋亡功能相關(guān)的靶分子，結(jié)果顯示4-HPR處理后的Saos-2細胞中，并沒有看到這些分子被誘導表達的現(xiàn)象，證實E2F-1/PAC1途徑是一條特異性的傳遞凋亡信號的通路；將藥物4-HPR應用在人正常成纖維細胞NHF3中，結(jié)果證明正常細胞對該抗腫瘤藥物4-HPR并不敏感；應用了其他幾種常用的抗腫瘤藥物后，結(jié)果顯示藥物Etoposide、5-Fu和Doxorubicin并沒有引起高表達E2F-1和PAC1的細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，而藥物Indomethacin處理后可以引起高表達E2F-1和PAC1的細胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，這種表現(xiàn)與使用藥物4-HPR后類似。結(jié)論：1.PAC1是E2F-1的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶分子。2.E2F-1可以通過PAC1抑制ERK1/2激酶的活化并誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。3.E2F-1/PAC1/MAPKs通路是E2F-1介導下的一條特異性的凋亡信號通路，藥物4-HPR通過該通路對腫瘤細胞有特異性殺傷作用，對正常細胞的毒副作用較小，具有臨床應用價值。細胞凍存和復蘇的方法1.細胞凍存（1）概述目前，細胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內(nèi)容物丟失。如果細胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。（2）細胞凍存操作步驟①細胞：選對數(shù)生長期細胞，收集細胞24小時前換液一次。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。②制液：去上清液，加入含20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。③分裝：將上述細胞分裝于安瓿或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤?，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記(日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù))。④封口：用塑料瓶時擰緊瓶口即可；如用火焰封閉瓶口后，仔細檢查，定要封嚴，必要時可浸入藍色液中觀察，為安全起見，把瓶縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細胞名稱，凍存日期，以便日后查找。⑤凍存：置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時(此步可省略)，再吊入液氮容器頸