第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件

第七章基因的定點誘變第七章基因的定點誘變1第七章基因的定點誘變第七章基因的定點誘變2突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。經(jīng)典的方法是根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)的方法鑒定相應(yīng)的基因。突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。3傳統(tǒng)的誘變方式利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體射線（紫外線、X射線、γ射線等）化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等）傳統(tǒng)的誘變方式利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生4不足生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)不足5Directedevolution

（定向進化或直接進化）

對目的基因人為制造大量突變，然后按照特定的需要和目的，給予選擇壓力，反復(fù)誘變，循環(huán)篩選，將滿足要求的、適合特定目的的分子篩選出來，獲得滿足需要的性能改良的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)在試管中分子水平的模擬進化。Directedevolution

（定向進化6基因直接進化的步驟突變基因突變庫的建立篩選

基因突變庫的活體或離體篩選基因直接進化的步驟突變7KeystepsofatypicaldirectedenzymeevolutionexperimentKeystepsofatypicaldirecte8局限性突變體子代頻率低二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem重疊部分在5’末端，與待融合的DNA片段序列互補。外切核酸酶III的消化利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列4.在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。DNaseI的消化目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因經(jīng)典的方法是根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)的方法鑒定相應(yīng)的基因。把該庫的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能在擴增目的基因的過程中，通過改變PCR反應(yīng)的條件（如改變4種dNTP的比例、改變Mg2+的濃度等），在PCR過程中引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因的隨機突變體外誘變是對克隆化的DNA進行誘變處理，改變其核苷酸序列，獲得突變基因。研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，獲得所需功能的突變體蛋白質(zhì)主要方法有隨機誘變，DNA體外重組，寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變，嵌套缺失局限性突變體子代頻率低體外誘變是對克隆化的DNA進行誘變處理9第一節(jié)隨機誘變隨機的在克隆化DNA中引入堿基置換突變，引入位置和性質(zhì)均為隨機性的。包括1.錯誤摻入誘變（易錯PCR)2.盒式誘變3.增變菌株的誘變作用4.化學(xué)誘變第一節(jié)隨機誘變隨機的在克隆化DNA中引入堿基置換突變，引入10隨機突變的策略1.易錯PCR（errorpronePCR）

在擴增目的基因的過程中，通過改變PCR反應(yīng)的條件（如改變4種dNTP的比例、改變Mg2+的濃度等），在PCR過程中引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因的隨機突變隨機突變的策略1.易錯PCR（errorpronePCR11第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件122.盒式誘變

Cassettemutagenesis利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列

包括兩種方式盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變2.盒式誘變

Cassettemutagenes13簡單盒式取代誘變簡單盒式取代誘變14混合寡核苷酸誘變用于取代的是含有隨機突變的混合雙聯(lián)寡核苷酸，可引入大量的隨機突變。在合成寡核苷酸片段時，需要帶限制性內(nèi)切酶位點，以便介導(dǎo)它們互為引物混合寡核苷酸誘變用于取代的是含有隨機突變的混合雙聯(lián)寡核苷酸，15利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體還是一個內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上可用于將兩個DNA片段在所期望的位點進行連接InserttargetDNAdut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵Mg2+:獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因?qū)τ趦蓚€具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過變性和復(fù)性后，兩個DNA片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等）DigestDNA(primarydigestion)dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置ssDNA制備載體利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體DNaseI酶切將基因隨機切割成約50～100bp左右的小片段Splicingbyoverlapextension3增變菌株的誘變作用因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。與校正和修復(fù)有關(guān)的基因突變后細胞內(nèi)基因突變頻率大大增加，這樣的菌株叫突變菌株。利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體3增變菌株16流程把攜帶待突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入增變菌株擴增，隨機突變體庫。把該庫的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。流程174化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亞硝基胍等）處理DNA片段，產(chǎn)生隨機突變體庫。4化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS（甲基磺酸乙酯）18DNA體外重組依賴序列同源性的DNA體外重組，包括DNA洗牌(DNAshuffing)，交錯延伸（StEP)，隨機引發(fā)重組（RPR).DNA體外重組依賴序列同源性的DNA體外重組，包括DNA洗牌192.DNAshuffling

（DNA重排或改組）

DNAshuffling

是指DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上進行有性重組。通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能2.DNAshuffling20基本步驟:目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因DNaseI酶切將基因隨機切割成約50～100bp左右的小片段不加引物的PCR在Taq酶的作用下將切割后的DNA重疊小片段重新連接起來，在這個過程中可能發(fā)生許多突變和重組加引物的PCR加入目的基因片段兩端的引物,使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變。基本步驟:目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片21基因家族的改組基因家族的改組22交錯延伸重組圖105以兩個以上的有一定同源性的DNA片段為模板進行PCR反應(yīng)，通過交換模板機制實現(xiàn)DNA序列的重新組裝。不需要DNaseI切割DNA，簡化了程序。交錯延伸重組圖105以兩個以上的有一定同源性的DNA片段為23隨機引發(fā)重組圖106用一套隨機引物與模板配對延伸，產(chǎn)生不同位點的短DNA片段混合物（含有少量點突變），以這些短DNA片段為引物重新組裝成全長基因。隨機引發(fā)重組圖106用一套隨機引物與模板配對延伸，產(chǎn)生不同24寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變

①基本原理使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作為引物，啟動單鏈DNA分子進行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為了新合成DNA子鏈的一個組成部分，因此所產(chǎn)生出來的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變25第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件26作為誘變劑的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補錯配堿基的位置應(yīng)設(shè)計在寡核苷酸分子的中央部位，每側(cè)至少1015個堿基通常采用化學(xué)合成無回文，重復(fù)和自身互補序列作為誘變劑的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除27②基本步驟將待突變的目的基因插入M13噬菌體載體，制備單鏈DNA將合成的寡核苷酸片段與單鏈模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互補的雙鏈DNA將雙鏈DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得突變基因突變體的篩選寡核苷酸探針雜交篩選法②基本步驟282.外切核酸酶III的消化作為誘變劑的寡核苷酸序列加引物的PCR加入目的基因片段兩端的引物,使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變。依賴鈣離子EGTA可抑制活性在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)DigestDNA(primarydigestion)coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。細胞內(nèi)甲基介導(dǎo)的錯配修復(fù)機制會修復(fù)新合成鏈中的錯配堿基在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補ssDNA制備載體dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置Mg2+:獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機（DNA重排或改組）利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵Splicingbyoverlapextension利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體TransformE.2.29局限性突變體子代頻率低退火時，有些單鏈模板DNA未與寡核苷酸配對細胞內(nèi)甲基介導(dǎo)的錯配修復(fù)機制會修復(fù)新合成鏈中的錯配堿基局限性突變體子代頻率低30

dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel法或稱“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基1．背景知識dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把31E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmidE.coli(dut-/ung-)E.coliCJ32ssDNA制備載體ssDNA制備載體33ssDNA制備載體單鏈噬菌體載體phagemid載體ssDNA制備載體單鏈噬菌體載體34UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突變鏈能復(fù)制轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵圖10-7UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttar35二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem位點選擇定點誘變法

二、AlteredSites?IIinvitro36第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件37三、TransformerSite-Directedmutagenesis轉(zhuǎn)化子誘變法

三、TransformerSite-Directedmu38SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNASynthesizesecondstrandDigest39DNAshufflingAdigestionDNaseI酶切將基因隨機切割成約50～100bp左右的小片段生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難突變體的篩選寡核苷酸探針雜交篩選法加引物的PCR加入目的基因片段兩端的引物,使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變。人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補將合成的寡核苷酸片段與單鏈模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互補的雙鏈DNATransformE.（DNA重排或改組）即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上四、PCR定點誘變DigestDNA(primarydigestion)Synthesizesecondstrand把該庫的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。依賴鈣離子EGTA可抑制活性設(shè)計一個寡聚體引物，其序列包含兩個部分，“引發(fā)”和“重疊”部分，引發(fā)部分在3‘末端，起引物作用；利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列DNAshuffling40四、PCR定點誘變1.大引物PCR誘變圖10-10四、PCR定點誘變1.大引物PCR誘變412.重疊延伸Overlapextension對于兩個具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過變性和復(fù)性后，兩個DNA片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈2.重疊延伸Overlapextension對于兩個423、SOE重疊延伸剪接術(shù)

Splicingbyoverlapextension可用于將兩個DNA片段在所期望的位點進行連接設(shè)計一個寡聚體引物，其序列包含兩個部分，“引發(fā)”和“重疊”部分，引發(fā)部分在3‘末端，起引物作用；重疊部分在5’末端，與待融合的DNA片段序列互補。設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補3、SOE重疊延伸剪接術(shù)可用于將兩個DNA片段在所期望的43ATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重疊延伸PCRABATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIA44第二節(jié)嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化ExonucleaseIII5‘3‘5‘3‘5‘3‘第二節(jié)嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化Exonuc45第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件462.BAL31的消化主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴鈣離子

EGTA可抑制活性2.BAL31的消化主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線47AABAdigestionvectorinsertBAL31BdigestionDeletedinsertsclonedtoplasmidvectorAABAdigestionvectorinsertBAL483.DNaseI的消化內(nèi)切酶，可優(yōu)先嘧啶核苷酸水解dsorssDNAMg2+:獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA

產(chǎn)生平端或1-2個核苷酸突出3.DNaseI的消化內(nèi)切酶，可優(yōu)先嘧啶核苷酸水解d49第七章基因的定點誘變第七章基因的定點誘變50第七章基因的定點誘變第七章基因的定點誘變51突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。經(jīng)典的方法是根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)的方法鑒定相應(yīng)的基因。突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。52傳統(tǒng)的誘變方式利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體射線（紫外線、X射線、γ射線等）化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等）傳統(tǒng)的誘變方式利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生53不足生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)不足54Directedevolution

（定向進化或直接進化）

對目的基因人為制造大量突變，然后按照特定的需要和目的，給予選擇壓力，反復(fù)誘變，循環(huán)篩選，將滿足要求的、適合特定目的的分子篩選出來，獲得滿足需要的性能改良的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)在試管中分子水平的模擬進化。Directedevolution

（定向進化55基因直接進化的步驟突變基因突變庫的建立篩選

基因突變庫的活體或離體篩選基因直接進化的步驟突變56KeystepsofatypicaldirectedenzymeevolutionexperimentKeystepsofatypicaldirecte57局限性突變體子代頻率低二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem重疊部分在5’末端，與待融合的DNA片段序列互補。外切核酸酶III的消化利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列4.在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。DNaseI的消化目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因經(jīng)典的方法是根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)的方法鑒定相應(yīng)的基因。把該庫的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能在擴增目的基因的過程中，通過改變PCR反應(yīng)的條件（如改變4種dNTP的比例、改變Mg2+的濃度等），在PCR過程中引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因的隨機突變體外誘變是對克隆化的DNA進行誘變處理，改變其核苷酸序列，獲得突變基因。研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，獲得所需功能的突變體蛋白質(zhì)主要方法有隨機誘變，DNA體外重組，寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變，嵌套缺失局限性突變體子代頻率低體外誘變是對克隆化的DNA進行誘變處理58第一節(jié)隨機誘變隨機的在克隆化DNA中引入堿基置換突變，引入位置和性質(zhì)均為隨機性的。包括1.錯誤摻入誘變（易錯PCR)2.盒式誘變3.增變菌株的誘變作用4.化學(xué)誘變第一節(jié)隨機誘變隨機的在克隆化DNA中引入堿基置換突變，引入59隨機突變的策略1.易錯PCR（errorpronePCR）

在擴增目的基因的過程中，通過改變PCR反應(yīng)的條件（如改變4種dNTP的比例、改變Mg2+的濃度等），在PCR過程中引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因的隨機突變隨機突變的策略1.易錯PCR（errorpronePCR60第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件612.盒式誘變

Cassettemutagenesis利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列

包括兩種方式盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變2.盒式誘變

Cassettemutagenes62簡單盒式取代誘變簡單盒式取代誘變63混合寡核苷酸誘變用于取代的是含有隨機突變的混合雙聯(lián)寡核苷酸，可引入大量的隨機突變。在合成寡核苷酸片段時，需要帶限制性內(nèi)切酶位點，以便介導(dǎo)它們互為引物混合寡核苷酸誘變用于取代的是含有隨機突變的混合雙聯(lián)寡核苷酸，64利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體還是一個內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上可用于將兩個DNA片段在所期望的位點進行連接InserttargetDNAdut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵Mg2+:獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因?qū)τ趦蓚€具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過變性和復(fù)性后，兩個DNA片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等）DigestDNA(primarydigestion)dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置ssDNA制備載體利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體DNaseI酶切將基因隨機切割成約50～100bp左右的小片段Splicingbyoverlapextension3增變菌株的誘變作用因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。與校正和修復(fù)有關(guān)的基因突變后細胞內(nèi)基因突變頻率大大增加，這樣的菌株叫突變菌株。利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體3增變菌株65流程把攜帶待突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入增變菌株擴增，隨機突變體庫。把該庫的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。流程664化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亞硝基胍等）處理DNA片段，產(chǎn)生隨機突變體庫。4化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS（甲基磺酸乙酯）67DNA體外重組依賴序列同源性的DNA體外重組，包括DNA洗牌(DNAshuffing)，交錯延伸（StEP)，隨機引發(fā)重組（RPR).DNA體外重組依賴序列同源性的DNA體外重組，包括DNA洗牌682.DNAshuffling

（DNA重排或改組）

DNAshuffling

是指DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上進行有性重組。通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能2.DNAshuffling69基本步驟:目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因DNaseI酶切將基因隨機切割成約50～100bp左右的小片段不加引物的PCR在Taq酶的作用下將切割后的DNA重疊小片段重新連接起來，在這個過程中可能發(fā)生許多突變和重組加引物的PCR加入目的基因片段兩端的引物,使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變?；静襟E:目的基因片段的準備根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片70基因家族的改組基因家族的改組71交錯延伸重組圖105以兩個以上的有一定同源性的DNA片段為模板進行PCR反應(yīng)，通過交換模板機制實現(xiàn)DNA序列的重新組裝。不需要DNaseI切割DNA，簡化了程序。交錯延伸重組圖105以兩個以上的有一定同源性的DNA片段為72隨機引發(fā)重組圖106用一套隨機引物與模板配對延伸，產(chǎn)生不同位點的短DNA片段混合物（含有少量點突變），以這些短DNA片段為引物重新組裝成全長基因。隨機引發(fā)重組圖106用一套隨機引物與模板配對延伸，產(chǎn)生不同73寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變

①基本原理使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作為引物，啟動單鏈DNA分子進行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為了新合成DNA子鏈的一個組成部分，因此所產(chǎn)生出來的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變74第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件75作為誘變劑的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補錯配堿基的位置應(yīng)設(shè)計在寡核苷酸分子的中央部位，每側(cè)至少1015個堿基通常采用化學(xué)合成無回文，重復(fù)和自身互補序列作為誘變劑的寡核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除76②基本步驟將待突變的目的基因插入M13噬菌體載體，制備單鏈DNA將合成的寡核苷酸片段與單鏈模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互補的雙鏈DNA將雙鏈DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得突變基因突變體的篩選寡核苷酸探針雜交篩選法②基本步驟772.外切核酸酶III的消化作為誘變劑的寡核苷酸序列加引物的PCR加入目的基因片段兩端的引物,使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變。依賴鈣離子EGTA可抑制活性在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)DigestDNA(primarydigestion)coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。細胞內(nèi)甲基介導(dǎo)的錯配修復(fù)機制會修復(fù)新合成鏈中的錯配堿基在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補ssDNA制備載體dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置Mg2+:獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機（DNA重排或改組）利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵Splicingbyoverlapextension利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體TransformE.2.78局限性突變體子代頻率低退火時，有些單鏈模板DNA未與寡核苷酸配對細胞內(nèi)甲基介導(dǎo)的錯配修復(fù)機制會修復(fù)新合成鏈中的錯配堿基局限性突變體子代頻率低79

dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel法或稱“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基1．背景知識dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把80E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmidE.coli(dut-/ung-)E.coliCJ81ssDNA制備載體ssDNA制備載體82ssDNA制備載體單鏈噬菌體載體phagemid載體ssDNA制備載體單鏈噬菌體載體83UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突變鏈能復(fù)制轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵圖10-7UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttar84二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem位點選擇定點誘變法

二、AlteredSites?IIinvitro85第七章基因的定點誘變優(yōu)質(zhì)課件86三、TransformerSite-Directedmutagenesis轉(zhuǎn)化子誘變法

三、TransformerSite-Directedmu87SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNASynthesizesecondstrandDigest88DNAshufflingAdigestionDNaseI酶切將基因隨機切割成約50～100bp左右的