葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體測(cè)定方法

—■刷狀緣膜囊的制備：（方法參照Kessler（1978）,Shirazi-Beechey（1991和Bauer（2001b）修正）所有操作過(guò)程需在冰上或者4弋下進(jìn)行。將冷凍樣品進(jìn)行稱重，并在冷燒杯中用緩沖劑（100mM甘露醇，2mMHEPES/Tris緩沖劑，pH7.1）解凍。解凍后，在冷的有蓋培養(yǎng)皿中用剪刀和鑷子將組織樣剪為1cm小塊，將小塊組織樣重放入冷燒杯，然后將組織塊懸液振動(dòng)2次（設(shè)定為No.80），每次一分鐘。用布氏漏斗過(guò)濾振動(dòng)后溶液，溶液轉(zhuǎn)入250mL量筒，記錄濾液體積后轉(zhuǎn)移至400mL燒杯中。將燒杯放置冰上，攪拌溶液。制作多個(gè)平行樣以備進(jìn)一步分析，這些處理后樣品為勻漿液。已知濃度的氯化鎂溶液加入到勻漿液中以達(dá)到10mM的終濃度，溫和攪拌溶液20分鐘，然后進(jìn)行兩種離心：5min，3000*g；30min，30000*g。利用20-G型檢測(cè)針對(duì)剩余的顆粒進(jìn)行再懸浮，緩沖液為100mM甘露醇+20mMHEPES/Tris,pH7.5。懸浮顆粒在組織硏磨機(jī)（Potter-Elvehjam;Teflon/glass）中均勻攪拌十次后在30000*g離心30min。最終顆粒用23-G型檢測(cè)針在500pL緩沖液中（300mM甘露醇，0.1mM硫酸鎂，20mMHEPES/Tris，pH7.5）再次懸浮。懸浮顆粒（囊泡）由反復(fù)流過(guò)27-G型檢測(cè)針10次的溶液制備均勻，避免出現(xiàn)氣泡。將試樣等分入冷凍管后80°C保存。檢測(cè)利用BSA（牛血清白蛋白）作為勻漿蛋白濃度和囊泡濃度的標(biāo)準(zhǔn)。麥芽糖酶是刷狀緣膜富集度的標(biāo)記酶,Truner和Moran（1982）的方法測(cè)定麥芽糖酶活，使用25mM磷酸鹽緩沖液（pH6.3）和30mM麥芽糖。釋放的葡萄糖通過(guò)COBASFara口（全自動(dòng)生化儀）（Roche,Montclair,NJ）測(cè)定麥芽糖酶活表達(dá)為pmolproduct/min*mgofprotein。囊泡中麥芽糖酶活的富集（enrichment）表示為囊泡麥芽糖酶活/勻漿麥芽糖酶活。37C下將5pL（50pgofprotein）的小囊泡置于預(yù)熱的微量離心管中，預(yù)熱的培養(yǎng)基中包含100mM硫氰酸鈉或硫氰酸鉀、99.8mM甘露醇、20mMHEPES/Tris（pH7.5），再加入200pM葡萄糖（1.0pCi【U-1€】-D-glucose）。加入1mL冰凍終止溶液（150mL氯化鈉，250pM根皮苷）3s后葡萄糖吸收被終止。移取0.9mL上述溶液，迅速通過(guò)0.45pm圓形纖維素薄膜。整個(gè)薄膜用終止溶液（5*1mL）清洗。將薄膜置于20mL閃爍計(jì)數(shù)瓶中，瓶中加入12mLscintillationcocktail（ScintisafePlus50%LSCCocktail）。樣品通過(guò)Quantasmart軟件用于放射性測(cè)定（閃儀Tri-Carb2900TR/SL）o在Na+和K+存在的前提下，葡萄糖吸收的測(cè)定重復(fù)五次。鈉依賴性葡萄糖的吸收通過(guò)硫氰酸鈉孵化值減去硫氰酸鉀孵化值得到。免疫印跡

囊泡和勻漿液（40pg蛋白/道）在60°C下孵育，然后用7.5%的SDSPAGE分離。蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移至0.45pm的硝化纖維膜上，用固綠染色法（固綠染色液）使其顯現(xiàn)出來(lái)（FisherScientific,Pittsburgh,PA）。為了指示刷狀緣膜的純度，連續(xù)用探針檢測(cè)SGLT1，GLUT2和堿性磷酸酶。薄膜在封閉溶液中（2.3%康乃馨脫脂奶粉溶于30mMTris堿,300mMNaCI30mMTris堿,300mMNaCI,0.1%（vol/vol）吐溫20,pH7.5）封閉1.5h。將薄膜置于迷你轉(zhuǎn)跡機(jī)中，每個(gè)樣品道的封閉液中放置50pL抗-SGLT1抗體（兔抗兔；1:325稀釋度；100pg/pL初始濃度），然后在搖床中室溫雜交1h（搖床）。將薄膜浸在含有150pL封閉液迷你轉(zhuǎn)跡機(jī)中，再將薄膜從迷你轉(zhuǎn)跡機(jī)中取出，在封閉液中繼續(xù)浸泡5minSGLT1辣根過(guò)氧化物酶共軛二抗（驢抗兔免疫球蛋;1:5000稀釋度）作用于每個(gè)薄膜樣品各1h。將薄膜在封閉液中浸泡5次，每次5min，再在TBS/Tween20（30mMTrisbase，300mMNacl，0.1%【vol/vol】Tween20，pH7.5）中浸泡10分鐘。對(duì)薄膜輕輕點(diǎn)樣以除去多余水分，發(fā)光底物也通過(guò)blotted處理5分鐘。薄膜輕輕blotted，包在塑料包中，進(jìn)行曝光，洗照片。準(zhǔn)備下一個(gè)探針時(shí)，將薄膜在60C溶液中進(jìn)行水浴分帶（69mMSDS,62mMTrisBase,7.8pL/mL&巰基乙醇）。在探測(cè)GLUT2之前，需將樣品在封閉液中封閉2h（2.5%康乃馨脫脂牛奶混于30mMTrisBase,150mMNacl,pH7.5）。薄膜在含有50pLanti-GLUT2抗體（兔抗鼠anti-GLUT2抗體（兔抗鼠GLUT；1:165稀釋度；100pg/pL初始濃度）的樣品道中雜交1.5h。雜交完成后，每個(gè)薄膜浸泡于迷你轉(zhuǎn)跡機(jī)中的240mL封閉液中。從迷你轉(zhuǎn)跡機(jī)中取出后，薄膜在封閉液中浸泡3次，每次5分鐘。辣根過(guò)氧化物酶共軛二抗（驢抗兔免疫球蛋白；1:5000稀釋度）作用于每個(gè)樣品各1.2h。剩余的清洗液和化學(xué)發(fā)光顯影部分和SGLT1探測(cè)處理方法一樣。顯影后，將薄膜再次分條帶。小?？雇脡A探測(cè)堿性磷酸酶前將樣品在封閉液中（2.0%脫脂牛奶混于10mMTrisBase,200mMNacl,pH7.5）孵育1.5h。在不同管中薄膜與堿性磷酸酶抗體（ 小?？雇脡A性磷酸酉酶,calfantirabbit；1:10000；10mg/mL初始濃度）雜交1h。雜交后，將薄膜在封閉液中浸泡5次，每次5min。辣根過(guò)氧化物酶共軛二抗（驢抗兔免疫球蛋白；1:5000稀釋度）作用于每個(gè)樣品各1h。剩余的清洗液和化學(xué)發(fā)光顯影處理同SGLT1探測(cè)相同。性磷酸酉相關(guān)蛋白豐度及分子大小的測(cè)定:掃描放射自顯影的數(shù)字成像，并利用UN-SCANIT軟件程序?qū)饷芏冗M(jìn)行掃描和評(píng)估（方法參照Swanson，2000）。光密度值作為任意單位被報(bào)道，并用信號(hào)值減去放射自顯影照片的一個(gè)平均背景值作為實(shí)際值。用每段腸道的勻漿信號(hào)值減去囊泡信號(hào)值，就可以得到SGLT1，GLUT2和堿性磷酸酶的富集值。通過(guò)利用十二指腸的光密度值減去各個(gè)腸段的光密度值，把用于評(píng)估整個(gè)腸道SGLT1豐度的光密度值標(biāo)準(zhǔn)化至十二指腸樣品。SGLT1和GLUT2的表觀位移權(quán)重通過(guò)對(duì)移動(dòng)距離和已知Marker的位移進(jìn)行回歸得到，范圍為184.5-9.lkDa（用標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)預(yù)染的蛋白梯）。

數(shù)據(jù)分析囊泡和勻漿麥芽糖酶活性，麥芽糖酶豐度，SGLT1豐度，葡萄糖吸收值通過(guò)利用SAS的GLM程序進(jìn)行裂區(qū)設(shè)計(jì)得到。整體設(shè)計(jì)模型是block（嵌段）和treatment（處理），整個(gè)設(shè)計(jì)的誤差是blockxtreatment。裂區(qū)模型包括腸段和處理x腸段，用殘差平方和作為誤差。將腸道樣品位置的一次和二次效應(yīng)進(jìn)行對(duì)照。腸道長(zhǎng)度和重量通過(guò)嵌段和處理模型進(jìn)行分析，模型用殘差作為誤差值。SC-9117;SC-2317，wanghcang@126.com閃爍計(jì)數(shù)瓶：液體閃爍計(jì)數(shù)所用的閃爍體是液態(tài)，即將閃爍體溶解在適當(dāng)?shù)娜芤褐?，配制成為閃爍液，并將待測(cè)放射性物質(zhì)放在閃爍液中進(jìn)行測(cè)量。應(yīng)用液體閃爍計(jì)數(shù)可達(dá)到4n立體角的優(yōu)越幾何測(cè)量條件，而且源的自吸收也可以忽略，對(duì)于能量低，射程短、易被空氣和其它物質(zhì)吸收的a射線和低能P射線（如3H和14C），有較高的探測(cè)效率，液體閃爍計(jì)數(shù)器是a射線和低能P射線的首選測(cè)量?jī)x器。1?探測(cè)機(jī)理閃爍液產(chǎn)生光子的過(guò)程是，從放射源發(fā)出的射線能理，首先被溶劑分子吸收，使溶劑分子激發(fā)。這種激發(fā)能量在溶劑內(nèi)傳播時(shí)，即傳遞給閃爍體（溶質(zhì)），引起閃爍體分子的激發(fā)，當(dāng)閃爍體分子回到基態(tài)時(shí)就發(fā)射出光子，該光子透過(guò)透明的閃閃爍液及樣品的瓶壁，被光電倍增管的光陰極接收，繼而產(chǎn)生光電子并通過(guò)光電倍增管的倍增管的位增極放大，然后被陽(yáng)極接收形成電脈沖，完成了放射能T■光能T■電能的轉(zhuǎn)換。2?閃爍液液體閃爍計(jì)數(shù)系統(tǒng)作用的閃爍溶液，是指閃爍瓶中除放射性被測(cè)樣品之外的其它組分，主要是有機(jī)溶劑和溶質(zhì)（閃爍體），有時(shí)為了樣品的制備或提高計(jì)數(shù)效率的需要，還加入其它添加劑。⑴溶劑：從P源放射0射線到發(fā)射能被肖陰極接收的光婦的這一系列能量轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)中，能量轉(zhuǎn)移效率是很低的，只有少部分放射能量被利用來(lái)發(fā)射光子，其中放射源與溶劑之間，能量轉(zhuǎn)移效率大約為5一10%。對(duì)溶劑的選擇，主要視其對(duì)閃爍體的溶介度和將放射能轉(zhuǎn)移給閃爍體的效率而定。如果以一定濃度的閃爍體在甲苯溶液中產(chǎn)生的脈沖高度為100%，那么，凡能產(chǎn)生80%以上的脈沖高度的都定為溶劑，能使脈沖高度隨其濃度上升而逐漸減小的稱為稀釋液，而在濃度很低時(shí)就能引起脈沖高度顯著下降的叫淬滅劑。在液體閃爍計(jì)數(shù)系統(tǒng)中，一個(gè)好的溶劑應(yīng)滿足下列條件：①對(duì)閃爍體的溶介度高；②對(duì)放射源的轉(zhuǎn)移效率高；③對(duì)閃爍發(fā)射的光子透明度高；④在無(wú)論有無(wú)助溶劑的幫助下都可以溶介放射性樣品；⑤在計(jì)數(shù)器的工作

溫度下來(lái)結(jié)冰；⑥能夠形成均相的測(cè)量溶液。一般認(rèn)為，烷基苯是最好的溶劑，如甲苯，二甲苯。此外，苯甲醚也是比較好的溶劑。另外，對(duì)于含水量較多的樣品，采用1,4—二氧不作為溶劑，因?yàn)樵撚袡C(jī)化合物的極性較大，既能很好地溶介閃爍體又可溶介含水量較多的樣品，能改善計(jì)數(shù)效率，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，冰點(diǎn)高，久放后產(chǎn)生淬滅作用很強(qiáng)的過(guò)氧化物，必須經(jīng)純化才能使用，并應(yīng)加入0.001%的二乙基二硫代氨基甲酸鈉或丁基氫氧基甲苯（BHT），以抑制純化的二氧六環(huán)變質(zhì)。溶劑在閃爍溶液中約占99%，因此，它的純度對(duì)閃爍液的品質(zhì)是很大的影響因素。溶劑中不發(fā)光的雜質(zhì)、氧和水的含量多少，都關(guān)系到淬滅程度。原則上講，溶劑應(yīng)具有閃爍純，即不含或很少含有影響閃爍計(jì)數(shù)的淬滅成分。實(shí)際證明，“分析純”試劑可以不經(jīng)純化而直接使用。⑵閃爍液：在液體閃爍計(jì)數(shù)系統(tǒng)中，閃爍體又稱熒光體，是閃爍液的溶質(zhì)，它的很多，根據(jù)其熒光特性及作用，可分為兩類，即第一閃爍和第二閃爍體。第一閃爍體：（初級(jí)閃爍體）：常用的第一閃爍體：對(duì)聯(lián)三苯（TP）：化學(xué)結(jié)構(gòu)它是最早使用的閃爍體之一。它的計(jì)數(shù)率高，價(jià)格比較便宜，但是，在低溫或含水溶液介度不高。2,5—二苯惡唑（PPO）：化學(xué)結(jié)構(gòu)它是目前普遍使用的閃爍體，能很好地溶介在常用的溶劑中，在含水的情況下也是如此，在甲苯中的溶介度達(dá)200克/升以上。它的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格也較便宜。但是，它的最大缺點(diǎn)是有明顯的濃度淬滅（自身淬滅），即隨著PPO在溶劑中的濃度升高，計(jì)數(shù)效率下降。2-苯基一5—（4-二苯基）一1,3,4惡唑（PBD）:化學(xué)結(jié)構(gòu)為它是已知的最有效的閃爍體之一。比PPO能耐受濃度淬滅，但是，它的溶介度低，尤其是在低溫和含水樣品存在時(shí)，溶介度下降更快，而且用量比PPO多兩倍，價(jià)格昂貴。2-（4-t-丁基苯基）-5-（4-二苯基）一1,3,4,惡二唑（丁基一PBD）:化學(xué)結(jié)構(gòu)為它的溶介度比PBD高，其最大優(yōu)點(diǎn)對(duì)化學(xué)淬滅和顏色淬滅不敏感，因此，可以獲得較高的計(jì)數(shù)效率。②第二閃爍體（次級(jí)閃爍體）：第二閃爍體的主要功能是吸收第一閃爍體發(fā)射的光子后，再在較長(zhǎng)的波段上重新發(fā)射出熒光來(lái)，并能增加光子的產(chǎn)額。在高濃度下第二閃爍體起著一部分與第一閃爍體相同的作用（即接受激發(fā)溶劑分子的的退激能量，并發(fā)出熒光），此外，它還能與淬滅因子競(jìng)爭(zhēng)，從而減少了第一閃爍被淬滅的程度。在下列一種或一種以上的情況下，必須在閃爍液中加入第二閃爍體：a.樣品中含有直接淬滅第一閃爍體的化合物；b.第一閃爍體濃度太高而引起強(qiáng)烈的自身淬滅，且發(fā)射的光譜范圍與光電倍增管光陰及不匹配；c.計(jì)數(shù)器的光電倍增管光陰極對(duì)于較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光譜響應(yīng)比較好；d.測(cè)量的樣品在近紫外區(qū)有明顯的吸收。常用的第二閃爍體有：1,4,雙2（5苯基惡唑）苯（POPOP）它的溶介度小，在甲苯系統(tǒng)為1.2克/升，在二氧六環(huán)中為1.5克/升。溶介速度慢，通常需加熱促其溶介，它是目前普遍使用的第二閃爍體。1,4雙2（4—甲基一5—苯基惡唑基）-苯（DMPOPOP）:它的溶介度比POPOP大，在甲苯系列內(nèi)為

2.3克/升，在二氧六環(huán)內(nèi)是0.8克/升，溶介速度也快，但沒(méi)有POPOP的計(jì)數(shù)效率高，且需要較高的使用濃度。此外，還有對(duì)一雙（0-甲基苯乙稀基）苯，（雙一MSB）和2-（4'-二聯(lián)苯基）一6-苯基苯并惡唑（PBBO），幾種常用的初級(jí)閃爍體的熒光波長(zhǎng)在3460-3800埃之間，而Cs-sb型光陰極的最大光譜響應(yīng)波長(zhǎng)為4000埃左右。因此，對(duì)于Cs-Sb材料的光陰極，僅用初級(jí)閃爍體不能很好地進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，計(jì)數(shù)效率很低，加入次級(jí)閃爍體后發(fā)射光譜波長(zhǎng)增加到4180-4300埃，使其與Cs-Sb型光陰的光譜響應(yīng)得到改善，能量轉(zhuǎn)移較好，計(jì)數(shù)效率提高。Cs-K-Sb型是雙堿型光電倍增管，它的最大光譜響應(yīng)波長(zhǎng)比Cs-Sb型短。因此，不用次級(jí)閃爍體也可以有較好的計(jì)數(shù)效率。但是，考慮到次級(jí)體和其它功用，通常在實(shí)際工作中，往往都要使用次級(jí)閃爍體。閃爍液中除了溶劑，閃爍體之外，有時(shí)還添加一些其它成分。為了增加閃爍液對(duì)含水樣品的溶解能力，需加入助溶劑；為了改善計(jì)數(shù)效率，則加入抗淬滅劑。甲苯、二甲苯等有機(jī)溶劑極性很小，對(duì)水的溶介能力較差。當(dāng)樣品含水較多時(shí)，即使樣品體積不大，也很難和甲苯中二甲苯互溶為透明的均相學(xué)府。有時(shí)樣品的含水量雖然不大，但它的放射性水平很低，為了在較短的測(cè)量時(shí)間獲得符合統(tǒng)計(jì)誤差要求的計(jì)數(shù)往往需要增加樣品的體積，這就等于增加了含水量，這樣的樣品也不能很好地和甲苯或二甲苯互溶，為此，要加入一定量的極性較大的有機(jī)溶劑，如甲醇，乙醇，乙二醇乙醚等，這些溶劑在非極性溶劑和水分子之間起著橋梁作用，既能和甲苯、二甲苯互溶，又能和水互溶，達(dá)到增加含水樣品在閃爍液內(nèi)的溶解度的目的，所以稱之為助溶劑。\par助溶劑的淬滅作用較大要限制其用量，因而，可容納的含水量也是有限的。其中乙二醇乙醚的極性大且學(xué)淬滅作用小，是常用的助溶劑?？勾銣鐒┩ǔＳ迷趯?duì)含水量很大的樣品測(cè)量或采用二氧六環(huán)作溶劑時(shí)，因?yàn)檫@種閃爍液淬滅作用大，為改善計(jì)數(shù)效率，加入抗淬滅劑萘是十分重要的。萘也是一種熒光物質(zhì)，它可以抵消一部分淬滅作用，但是萘不能和對(duì)聯(lián)三苯合用，尤其是在甲苯、二甲苯溶劑中，否則計(jì)數(shù)效率很低。液體閃爍計(jì)數(shù)器中，閃爍液的最佳體積可以在一定范圍內(nèi)有所變化，吸要能獲得較高的計(jì)數(shù)效率，就應(yīng)該采用較少的體積，尤其對(duì)于3H樣品來(lái)說(shuō)，較小體積的閃爍液還可以減少本底計(jì)數(shù)（大約0.5cpm/ml閃爍液），減少樣品的自吸收。如果當(dāng)樣品中含有淬滅劑成分時(shí)，增加閃爍液的體積，可以經(jīng)稀釋作用來(lái)減少淬滅。3?探測(cè)裝置在液體閃爍計(jì)數(shù)中引用非常靈敏的光電倍增管，對(duì)于探測(cè)穿透力低的a射線和低能量的P射線（如3H，14C等）是極為重要的。使用一個(gè)光電倍增管的單光電倍增管液體閃爍計(jì)數(shù)器，由于電倍增管的熱噪聲及樣品受光照射后發(fā)出的磷光，會(huì)有較高的本底計(jì)數(shù)，探測(cè)效率也較低。使用兩個(gè)性能指標(biāo)大致相同的光電倍增管，并和符合電路相連接，做成雙管符合型液體閃爍計(jì)數(shù)器，符合電路只能通過(guò)由兩只倍增管同時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)，因而只有當(dāng)兩只光電倍增管在符合電路分辯時(shí)間內(nèi)同時(shí)觀察到的信號(hào)才被記錄下來(lái)，而由熱噪聲或磷光產(chǎn)生

的隨機(jī)脈沖則被扣除掉，有效地降低儀器本底，提高了探測(cè)效率，系統(tǒng)探測(cè)效率可在50%以上。在液體閃爍計(jì)數(shù)系統(tǒng)中，光電倍增管陽(yáng)極形成脈沖電壓的大小，與陽(yáng)極一次收集的電子數(shù)成線性關(guān)系。在光電倍增管放大倍數(shù)不變的情況下（取決于高壓的穩(wěn)定性），光陰極產(chǎn)生的光電子越多，最后到達(dá)陽(yáng)極的電子數(shù)也越多，而光電子數(shù)取決于光子數(shù)。在正常情況下，閃爍劑分子釋放的光子數(shù)與放射性同位素衰變時(shí)產(chǎn)生的P射線能量成正比關(guān)系。由于放射能在傳遞和能量轉(zhuǎn)換途中，或多或少地要發(fā)生能量消耗，因此，放射能和發(fā)射的光子數(shù)之間近似地成線性關(guān)系。這說(shuō)明液體閃爍計(jì)能夠作能譜研究，以分析不同能量的放射性同位素，達(dá)到定性目的。例如，3H、14C雙標(biāo)記樣品，可通過(guò)雙道液體閃爍計(jì)數(shù)器同時(shí)測(cè)定。陽(yáng)極在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生脈沖電壓的數(shù)量，與閃爍瓶?jī)?nèi)放射性同位素的多少以及同位素衰變率成線性關(guān)系，與樣品內(nèi)的放射性強(qiáng)度成正比，這是液體閃爍測(cè)量的定量基礎(chǔ)。例如，在知道液體閃爍計(jì)數(shù)器探測(cè)效率的前提下，通過(guò)對(duì)某種放射性樣品進(jìn)行測(cè)定，可以求得該樣品中的放射性強(qiáng)度為多少微居里或多少貝柯勒爾。4.雙標(biāo)記同位素測(cè)量的應(yīng)用液體閃爍計(jì)數(shù)器特點(diǎn)之一是能作雙同位素分析，配備兩個(gè)或三個(gè)以上獨(dú)立的脈沖高度分析器的多道裝置，并具有脈沖相加和線性門裝置，在每種同位素的最佳計(jì)數(shù)條件下同時(shí)測(cè)量它們，就能區(qū)分發(fā)射不同能量的同位素，假定有一個(gè)含有3H和14C的樣品，我們將儀器中脈沖高度分析器多道裝置中的道1調(diào)3H的平衡點(diǎn)（最佳工作條件），道2調(diào)在14c的平衡點(diǎn)。3H和14C標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解的在同樣的溶劑中，并采用與實(shí)驗(yàn)樣品相同的閃爍體，首先測(cè)量空白樣品，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。為了使雙標(biāo)記測(cè)量獲得成功，兩種放射性同位素的P譜必須要有足夠的差異來(lái)滿足脈沖高度分析所要求的分離。在兩種同位素能譜過(guò)于接近的情況下，例如14C和35S，必須首先對(duì)它們進(jìn)行同位素的化學(xué)分離，然后再分別計(jì)數(shù)。在雙標(biāo)記測(cè)量中，較常用的成對(duì)同位素有3H和14C、3H和35S、3H和32P及14C和32P等?？傊?，在雙同位素標(biāo)記的測(cè)量中，要滿足下述兩個(gè)條件：第一，較高能量的同位素盡量能夠在不受較低能量同位素干擾的條件下進(jìn)行計(jì)數(shù)；第二，選擇一個(gè)最佳條件，以對(duì)雙標(biāo)記樣品中較低能量的同位素能進(jìn)行計(jì)數(shù)。5?液體閃爍計(jì)數(shù)樣品的制備流體閃爍測(cè)量的櫚制備是很重要的操作，操作的成功與否，直接影響到計(jì)數(shù)效率。樣品制備方法的選擇要考慮以下四個(gè)因素：⑴所測(cè)樣品的物理和化學(xué)特性，決定所用閃爍液類型和決定是否需要將樣品轉(zhuǎn)化為更適于測(cè)量的形式；⑵樣品所含的同位素的種類，對(duì)于含3H的樣品要更加注意；⑶預(yù)計(jì)的放射性水平，在樣品的放射性強(qiáng)度低時(shí)，要求的制備方法比較嚴(yán)格；⑷制備過(guò)程

的經(jīng)濟(jì)和方便，尤其在樣品數(shù)量多的更為重要。其一般原則是必須使所制備的樣品的放射性，能在一個(gè)短的測(cè)量時(shí)間達(dá)到適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)準(zhǔn)度，最關(guān)鍵的是要求樣品制備過(guò)程中，盡可能地減少“淬滅”因素。⑴均相樣品的制備脂溶性樣品可直接加入甲苯、二甲苯系統(tǒng)的閃爍液，含水量小于3%的樣品，仍應(yīng)用甲苯、二甲苯系統(tǒng)的閃爍液，但需加入乙醇或甲醇或乙二醇乙醚等極性溶劑助溶，助溶劑與甲苯的比例通常為3:7。必需時(shí)加抵消部分淬滅作用，提高計(jì)數(shù)效率，含水量再大時(shí)，最好采用100毫升乙二醇乙醚。20毫升乙二醇，8克PPO,500毫克POPOP,150克萘，最后用二氧六環(huán)加到1升的閃爍液配方，此配方容納水量大，效率好相當(dāng)高，但需注意二氧六環(huán)易形成過(guò)氧化物，會(huì)導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光的進(jìn)行，所以應(yīng)在避光條件下貯存，或者在貯存期間加入鋅?；蚱渌寡趸瘎┮郧宄^(guò)氧化物。(2)非均相樣品的制備乳狀液計(jì)數(shù)：表面活化合物TritonX-100是廣泛應(yīng)用的乳化劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式：它的親水端吸引水和其它極性分子，疏水端吸引甲苯等非極性分子。乳狀液的物理性能隨著水分的增加而改變。當(dāng)甲苯閃爍液與TritonX-100按2:1(v/v)組成的配方時(shí)，樣品水分在15%以下的乳狀液是透明的；隨著水分的增加，就會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)不同的相，分相的乳狀液不穩(wěn)定，不能用于測(cè)量；水分繼續(xù)增加，就形成穩(wěn)定的乳狀液，此時(shí)液體是透明的或不透明的。乳狀液的分相與溫度有關(guān)，在溫度由17°C開(kāi)始下降時(shí)，計(jì)數(shù)效率線性地增加約10%，到4—0C之間為最大值，溫度再低，計(jì)數(shù)效率不再增加，通常把乳狀液首先加熱到40C，然后在無(wú)振蕩的情況下冷卻，在4C保持2—4小時(shí)。溶質(zhì)在有機(jī)相和水相之間的不同分布是決定乳狀測(cè)量計(jì)數(shù)效率的關(guān)鍵，乳狀液測(cè)量的效率有時(shí)會(huì)比均相測(cè)量更高，這是因?yàn)榇銣缥镔|(zhì)主要保留在水相中而不影響在有機(jī)相中發(fā)生的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。在均相溶液中，系統(tǒng)中所有的成人的成份都密切地相互接觸，所以任何一個(gè)淬滅作用都能表現(xiàn)出來(lái)。懸浮液測(cè)量：對(duì)于在甲苯等為基礎(chǔ)的閃爍液中溶解度極低的無(wú)機(jī)鹽等樣品，可采用凝膠技術(shù)成懸浮測(cè)量液。樣品經(jīng)初步處理后，制成相同大小的顆粒，然后在含有凝膠劑的系統(tǒng)中做成懸浮液。對(duì)于懸浮液測(cè)量，下列要求是必須的：①固體物質(zhì)要很好地粉碎，并要求是白色或無(wú)色的均勻粉狀顆粒，以避免光的吸收；②要求樣品確實(shí)不溶于閃爍液，否則溶解的與不溶解的部分有不同的計(jì)數(shù)效率，造成計(jì)數(shù)不穩(wěn)定，結(jié)果不易重復(fù)。懸浮液測(cè)量的優(yōu)點(diǎn)是樣品不溶解在溶劑中，所以樣品淬滅極小。在懸浮測(cè)量中作為聚膠劑的物質(zhì)有硬脂酸鋁、蓖麻油的衍生物(thixin)及二氧化硅的細(xì)顆粒(Cab-o-sil)。含3.5—4.0%Cab-o-sil的懸浮液，要以得到很高計(jì)數(shù)效率，Cab-o-sil還可以減少計(jì)數(shù)瓶壁對(duì)放射性吸附作用，一般

制樣時(shí)，往往先加Cab-o-sil,再加入放射性樣品，使放射性更多地吸附在懸浮顆粒上而提高計(jì)數(shù)效率。懸浮液測(cè)量法除應(yīng)用于固體無(wú)機(jī)鹽的測(cè)定外，也可用于水溶液和組織勻漿，還可用來(lái)測(cè)量薄層層析的放射性，應(yīng)用時(shí)只要將層析物粉碎，簡(jiǎn)單地與凝膠混合即可，如果待測(cè)物能部分地從層析支持物上被洗脫而溶于閃爍液，則此法不可使用。支持物測(cè)量：與懸浮液測(cè)量相似，凡不溶于閃爍液的樣品，可將它放置在支持物上再浸入閃爍液中進(jìn)行計(jì)數(shù)。支持物的種類很多，如紙條、濾紙、玻璃纖維濾紙及醋酸纖維素膜片等。支持物在計(jì)數(shù)瓶?jī)?nèi)的位置對(duì)計(jì)數(shù)有直接影響，通常都采用平放瓶底測(cè)量，且膜片不超出閃爍液面，保持支持物和測(cè)量杯的干燥，都能獲得較高的計(jì)數(shù)效率和測(cè)量重復(fù)性。支持物測(cè)量除淬滅作用小外，還有一個(gè)突出的優(yōu)越性，即一次測(cè)量可以黨綱較多的樣品。因在同一測(cè)量瓶?jī)?nèi)，隨膜片疊加數(shù)目的增加（10片之內(nèi)），計(jì)數(shù)率線性增加而計(jì)數(shù)效率保持不變，這對(duì)于放射性水平低的含水樣品測(cè)量非常適用。\par在上述幾種支持物中，以醋酸纖維素薄膜、玻璃纖維濾紙的效果優(yōu)于普通濾紙，因?yàn)槠胀V紙對(duì)光子傳播幾乎是不透明的，所以計(jì)數(shù)效率很低。6?液體閃爍計(jì)數(shù)中的淬滅作用放射能量在測(cè)量瓶?jī)?nèi)的傳遞和轉(zhuǎn)換過(guò)程越順利，測(cè)量效率越高。但事實(shí)上，影響能量傳遞過(guò)程順序進(jìn)行的因素很多，它的每一環(huán)節(jié)都存在著對(duì)能量的爭(zhēng)奪過(guò)程，使得放射能減少，甚至發(fā)生能量傳遞的中斷，導(dǎo)致測(cè)量效率下降，這種現(xiàn)象稱為液體閃爍計(jì)數(shù)的淬滅。造成淬滅的因素很多，按淬滅性質(zhì)歸納起來(lái)，有下列三