生物技術(shù)藥物制劑課件

生物技術(shù)藥物制劑藥劑教研室張娜1生物技術(shù)藥物制劑藥劑教研室1本章學(xué)習(xí)要求：掌握生物技術(shù)的概念和生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)和理化性質(zhì)。掌握蛋白質(zhì)類藥物的處方與工藝。熟悉掌握蛋白質(zhì)類藥物新型給藥系統(tǒng)和評(píng)價(jià)方法。2本章學(xué)習(xí)要求：掌握生物技術(shù)的概念和生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)和理化性主要內(nèi)容第一節(jié)概述蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法第二節(jié)多肽、蛋白質(zhì)類藥物的注射給藥第三節(jié)多肽、蛋白質(zhì)類藥物的非注射制劑

第四節(jié)基因傳遞系統(tǒng)3主要內(nèi)容第一節(jié)概述3第一節(jié)概述

生物技術(shù)或稱生物工程（biotechnology),是應(yīng)用生物體（包括微生物，動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞）或其組成部分（細(xì)胞器和酶），在最適條件下，生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)物或進(jìn)行有益過程的技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要包括基因工程，細(xì)胞工程與酶工程。此外還有發(fā)酵工程（微生物工程）與生化工程。4第一節(jié)概述生物技術(shù)或稱生物工程（biotechnolo二、生物技術(shù)藥物產(chǎn)品生物技術(shù)藥物產(chǎn)品，目前國(guó)內(nèi)外已批準(zhǔn)上市的約40多種，正在研究的數(shù)百種之多，這些藥物均屬肽類與蛋白質(zhì)類藥物。1、定義系指由重組產(chǎn)品、天然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物藥物的總稱。5二、生物技術(shù)藥物產(chǎn)品52、現(xiàn)代生物藥物的分類(1)基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑(即重組DNA技術(shù))；(2)基因藥物(基因治療劑、基因疫苗、反義藥物和核酸)；(3)天然生物藥物(動(dòng)物、植物、微生物和海洋生物藥物)；(4)合成和部分合成生物藥物。62、現(xiàn)代生物藥物的分類63、生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

多數(shù)受胃酸及消化酶的降解破壞其生物半衰期亦較短，需頻繁注射給藥即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也較低長(zhǎng)期注射易造成患者心理和生理的痛苦另外，多數(shù)多肽和蛋白質(zhì)類藥物不易被親脂性膜所攝取，很難通過生物屏障。73、生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

多數(shù)受胃酸及消化酶的降解破壞7三、生物技術(shù)藥物及其制劑的發(fā)展前景1、發(fā)展概況自1982年第一個(gè)重組藥物：人工胰島素上市以來，第二代生物技術(shù)藥物正在取代第一代多肽、蛋白質(zhì)類替代治療劑。第一代重組藥物是一級(jí)結(jié)構(gòu)與天然產(chǎn)物完全一致的藥物；第二代生物技術(shù)藥物是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造的自然界不存在的新的重組藥物。8三、生物技術(shù)藥物及其制劑的發(fā)展前景8生物技術(shù)藥物的發(fā)展到1998年為止,全球已有65個(gè)生物技術(shù)藥物問市,另有2600多個(gè)生物技術(shù)藥物正處于臨床前的研究階段,700多個(gè)生物技術(shù)藥物正進(jìn)行臨床評(píng)價(jià),其中200多種已進(jìn)入四期臨床或最后審批階段,估計(jì)2000年全球生物技術(shù)藥物的銷售額會(huì)超過200億美元,而近年內(nèi)生物技術(shù)藥品將占新藥總數(shù)的20%以上。生物技術(shù)藥物有著廣闊的發(fā)展前景。9生物技術(shù)藥物的發(fā)展到1998年為止,全球已有65生物技術(shù)藥物的發(fā)展美國(guó)一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首，已上市116個(gè)藥物，治療數(shù)百種疾病，2000年產(chǎn)值超過200億美元；已有723種生物技術(shù)藥物正在通過FDA審批。德國(guó)已超過日本，到2001年底已有68種藥物上市，正在臨床試驗(yàn)的有100多個(gè)。日本多數(shù)藥物是與美國(guó)合作的產(chǎn)物，已上市的有50個(gè)藥物。我國(guó)已批準(zhǔn)上市的品種有21種，主要通過跟蹤研究與創(chuàng)仿相結(jié)合的方法，目前已步入自主創(chuàng)新階段，并以“新型生物技術(shù)藥物和疫苗”作為發(fā)展重點(diǎn)。10生物技術(shù)藥物的發(fā)展美國(guó)一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首，已上市生物技術(shù)藥物的發(fā)展目前以生物技術(shù)，微電子，新材料，新能源，海洋工程和空間技術(shù)等為主要內(nèi)容的新技術(shù)革命浪潮正以萬鈞之勢(shì)迅猛發(fā)展。在新技術(shù)革命中，生物技術(shù)又是各國(guó)優(yōu)先發(fā)展的領(lǐng)域。傳統(tǒng)的經(jīng)典制藥工業(yè)由于基因工程，細(xì)胞融合，酶工程，結(jié)構(gòu)修飾等現(xiàn)代生物技術(shù)的滲入，使醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)期。盡管這類產(chǎn)品目前還不太多，但它代表了醫(yī)藥產(chǎn)品發(fā)展的方向。11生物技術(shù)藥物的發(fā)展目前以生物技術(shù)，微電子，新材料，新能源，海隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，肽和蛋白質(zhì)藥物制劑的研究與開發(fā)，已成為醫(yī)藥工業(yè)中一個(gè)重要的領(lǐng)域，同時(shí)給藥物制劑帶來新的挑戰(zhàn)，由于生物技術(shù)產(chǎn)品多為多肽和蛋白質(zhì)類，性能很不穩(wěn)定，極易變質(zhì)，因此如何將這類藥物制成穩(wěn)定，安全，有效的制劑，就是擺在我們面前的一大難題。運(yùn)用制劑手段將注射用藥制成口服或其他途徑給藥，亦即研究新的給藥系統(tǒng)，也是一項(xiàng)十分艱巨的任務(wù)。由于這類藥物及其制劑療效獨(dú)特應(yīng)用日益廣泛，因而具有進(jìn)一步研究的價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。生物技術(shù)藥物的發(fā)展12隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，肽和蛋白質(zhì)藥物制劑的研究與開發(fā)，已成表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物13表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物13表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物14表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物14蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)

一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(一)蛋白質(zhì)的組成和一般結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定排列順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈。蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)包括氨基酸組成，肽鏈數(shù)目，末端組成，氨基酸排列順序和二硫鍵的位置等。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種。連接氨基酸之間的鍵稱為酰胺鍵，又稱肽鍵，是蛋白質(zhì)中氨基酸之間連接最基本的共價(jià)鍵。15蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)15蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)為初級(jí)結(jié)構(gòu)，指蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸排列順序，包括肽鏈數(shù)目和二硫鍵位置。二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)為高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和二硫鍵與蛋白質(zhì)的生物活性有重要關(guān)系。16蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)：16(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)包括二級(jí)，三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈骨架的折疊方式，即肽鏈主鏈有規(guī)律的空間排布，一般有α螺旋結(jié)構(gòu)與β折疊形式。17(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)包括二級(jí)，三級(jí)與四α螺旋與β折疊18α螺旋與β折疊18(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條螺旋肽鏈，即已折疊的肽鏈在分子中的空間構(gòu)型，即分子中的三維空間排列或組合的方式，系一條多肽鏈中所有原子的空間排部。四級(jí)結(jié)構(gòu)是指具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的各亞基聚合而成的大分子蛋白質(zhì)。19(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條螺旋肽鏈，即已折疊的肽蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖20蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖20蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素的四級(jí)結(jié)構(gòu)可以由兩個(gè)以上的分子量為6000或12000的小亞基聚合而成。所謂亞基就是含有二條或多條多肽鏈的蛋白質(zhì)，這些多肽鏈彼此以非共價(jià)鏈相連，每一條多肽鏈都有自己的三級(jí)結(jié)構(gòu)，此多肽鏈就是該蛋白質(zhì)分子的亞單位（亞基）。21蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素的四級(jí)結(jié)構(gòu)可以由兩個(gè)以上的分子量為60二條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)22二條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)22六條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)23六條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)23蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象又叫空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、三維構(gòu)象等，它是指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間中的排布。這種空間排布的變化，僅涉及到氫鍵等次級(jí)鍵的生成與斷裂，但不涉及共價(jià)鍵的生成與斷裂。24蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象又叫空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)豐富多彩的蛋白質(zhì)世界25豐富多彩的蛋白質(zhì)世界25蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)與生物活性蛋白質(zhì)分子只有在其立體結(jié)構(gòu)呈特定的構(gòu)象（conformation)時(shí)才有生物活性，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力有氫鍵、疏水作用力（hydrophobicforce)、離子鍵、范德華力、二硫鍵與配位鍵。除二硫鍵為共價(jià)鍵外，其余都是非共價(jià)鍵，維持蛋白質(zhì)構(gòu)象是弱作用力。26蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)與生物活性蛋白質(zhì)分子只有在其立體結(jié)構(gòu)呈特維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力蛋白質(zhì)分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋、β折疊的形成依靠氫鍵，可以說蛋白質(zhì)分子內(nèi)部布滿了氫鍵。疏水作用力也稱疏水鍵，系兩個(gè)疏水基為了避開水相而群集在一起的作用力，在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。27維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力蛋白質(zhì)分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋、β折疊的維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力范德華力對(duì)穩(wěn)定和維持三級(jí)，四級(jí)結(jié)構(gòu)十分重要。離子鍵對(duì)于維持蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)是不可缺少的。不少蛋白質(zhì)含有金屬離子，而金屬離子是通過配位鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，故結(jié)合蛋白質(zhì)是由氨基酸成分與非氨基酸通過配位組成。28維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力范德華力對(duì)穩(wěn)定和維持三級(jí)，四級(jí)結(jié)構(gòu)十分金屬離子配位鍵29金屬離子配位鍵29二、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)1、旋光性蛋白質(zhì)分子總體旋光性由構(gòu)成氨基酸各個(gè)旋光度的總和決定，通常是右旋，它由螺旋結(jié)構(gòu)引起。蛋白質(zhì)變性，螺旋結(jié)構(gòu)松開，則其左旋性增大。30二、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)30(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

2、紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶苯丙氨酸，酪氨酸與色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm顯示強(qiáng)吸收。31(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

2、紫外吸收31(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

3、蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)除了肽鏈N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的側(cè)鏈上還有很多解離基團(tuán)，這些解離基團(tuán)在一定pH條件下都能發(fā)生解離而帶電。因此蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下蛋白質(zhì)會(huì)成為陽離子，陰離子或二性離子。32(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

3、蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)(二)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的原因1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性

共價(jià)鍵改變引起蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的化學(xué)反應(yīng)有水解，氧化和消旋化，此外還有蛋白質(zhì)的特有反應(yīng)，即二硫鍵的斷裂與交換。有時(shí)幾種反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行33(二)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的原因1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)（IP）時(shí)一般最穩(wěn)定，溶解也最少。在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相應(yīng)的pH所有離子的凈電荷為零，因而減少了電荷排斥和蛋白質(zhì)伸展的趨勢(shì)。341、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)（I1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)可被酸，堿和蛋白酶催化水解，使蛋白質(zhì)分子斷裂，分子量逐步變小，成為分子量大小不等的肽段和氨基酸。水解分完全水解與不完全水解。351、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)水解31、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的氧化蛋白質(zhì)中具有芳香側(cè)鏈的氨基酸可以在一些氧化劑作用下氧化。常用氧化劑有分子氧、過氧化氫、過甲酸、氧自由基等。361、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的氧化1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(3)外消旋作用(racemization)某些旋光性物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)過程中，由于不對(duì)稱碳原子上的基團(tuán)在空間位置上發(fā)生轉(zhuǎn)移，使D-或L-型化合物轉(zhuǎn)變?yōu)镈-型和L-型各50%的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，這種現(xiàn)象稱為外消旋作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)用堿水解時(shí)往往會(huì)使某些氨基酸產(chǎn)生消旋作用。371、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(3)外消旋作用(r1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(4)二硫鍵及其交換二硫鍵（-S-S-）又叫二硫橋或硫硫橋，是很強(qiáng)的化學(xué)鍵。它是由兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈上的疏基（-SH）脫氫相連而成。二硫鍵把同一肽鏈或不同肽鏈（肽鏈間）的不同部分連接起來，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象起重要作用。381、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(4)二硫鍵及其交1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的數(shù)目愈多，則結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗拒外界因素的能力也愈強(qiáng)。蛋白質(zhì)分子中二硫鍵斷裂接著重排能夠改變蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此影響其生物活性。391、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性引起蛋白質(zhì)不可逆失活作用的三種主要類型聚集（aggregation)，宏觀沉淀，和表面吸附與蛋白質(zhì)變性，這些都是由于與空間構(gòu)象有關(guān)的非共價(jià)鍵引起。非共價(jià)的靜電力，氫鍵，疏水的相互作用以及蛋白質(zhì)的水化，可以因溫度于pH而發(fā)生改變。402、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性402、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的不可逆失活，一般以自然狀態(tài)開始可逆的伸展，隨著溫度的增加，溶液中的蛋白質(zhì)分子在熔融溫度(Tm)從天然的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)。溶液pH可以影響靜電的相互作用。Tm為50%分子伸展時(shí)的溫度。412、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的不可逆失活，一般以自然2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)的聚集與沉淀蛋白質(zhì)聚集(凝集，aggregation)是蛋白質(zhì)分子結(jié)合的微觀過程。蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)指可見蛋白質(zhì)顆粒的生成。不可逆的聚集往往是由于蛋白質(zhì)伸展所致。422、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)的聚集與沉淀422、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)溶液振搖可以導(dǎo)致聚集與沉淀，這是由于空氣氧化，界面變性，吸附于容器或機(jī)械應(yīng)力所致。432、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)溶液振搖可以導(dǎo)致聚集與沉2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的吸附蛋白質(zhì)和多肽吸附于容器、濾器或輸液系統(tǒng)材料的表面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液濃度較低時(shí)，由于吸附藥物損失相對(duì)就較高。

442、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的吸附442、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(3)蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)在受到一些物理因素或化學(xué)試劑影響會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化，破壞蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)有關(guān)氫鍵及其他弱鍵(二級(jí)結(jié)構(gòu)以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性的喪失(抗原性改變，生物功能喪失)同時(shí)還伴隨一些物化常數(shù)的變化。如發(fā)生溶解度的降低、旋光值改變、光吸收系數(shù)的增大、粘度改變、聚集，沉淀等。但蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)即肽鍵沒有被破壞,這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。452、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(3)蛋白質(zhì)的變性破壞蛋白質(zhì)2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的變性也可以說是從肽鏈的折疊（refolding)狀態(tài)變到伸展（unfolding)狀態(tài)。

天然蛋白質(zhì)在體內(nèi)條件下，具有呈現(xiàn)全部生物功能所需要的精確的構(gòu)象。變性作用是天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的松解，即由原來有規(guī)則，緊密結(jié)構(gòu)變成無規(guī)則，松散結(jié)構(gòu)。462、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的變性也可以說是從肽鏈的2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性變性可以分可逆變性和不可逆變性。除去變性因素，蛋白質(zhì)構(gòu)象可以恢復(fù)原狀的，叫可逆變性。鹽析472、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性變性可以分可逆變性和不可逆變性影響蛋白質(zhì)變性的因素①溫度的影響：蛋白質(zhì)在50~60°C的溶液中，經(jīng)過一定時(shí)間，往往發(fā)生變性。有些蛋白質(zhì)熱變性是可逆的，有些是不可逆的。不可逆熱變性往往發(fā)生沉淀和聚集現(xiàn)象。一般來說，熱變性僅涉及非共價(jià)鍵的變化。48影響蛋白質(zhì)變性的因素48影響蛋白質(zhì)變性的因素②pH對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：大多數(shù)蛋白質(zhì)，僅在pH4-10的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，超過這個(gè)范圍，就發(fā)生變性，也有些蛋白質(zhì)只有當(dāng)pH<2時(shí)，才發(fā)生變性。49影響蛋白質(zhì)變性的因素②pH對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：49影響蛋白質(zhì)變性的因素③有機(jī)溶劑的影響：大多數(shù)蛋白質(zhì)水溶液在加入一定量的有機(jī)溶劑后蛋白質(zhì)就開始析出沉淀。脫水50影響蛋白質(zhì)變性的因素③有機(jī)溶劑的影響：脫水50影響蛋白質(zhì)變性的因素④鹽的影響：鹽對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的影響是很復(fù)雜的。蛋白質(zhì)水溶液中加入少量無機(jī)鹽會(huì)增加蛋白質(zhì)表面負(fù)荷，增強(qiáng)蛋與水的作用從而使蛋白質(zhì)在水中溶液度增大，這種現(xiàn)象稱為鹽溶（saltingin)。在高鹽濃度情況下，本來與蛋白質(zhì)結(jié)合的自由水與鹽解離產(chǎn)生的離子進(jìn)形配位，蛋白質(zhì)表面水層被破壞，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的相互作用增加而發(fā)生聚集，這種現(xiàn)象叫鹽析（saltingout)。51影響蛋白質(zhì)變性的因素④鹽的影響：鹽對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的影響是影響蛋白質(zhì)變性的因素⑤表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：長(zhǎng)鏈的脂肪酸（如月桂酸）或相應(yīng)的表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉）很容易與蛋白質(zhì)反應(yīng)，常常引起蛋白質(zhì)解離，在很低的濃度下，就能引起蛋白質(zhì)變化。52影響蛋白質(zhì)變性的因素⑤表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：52蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法

一、液相色譜法液相色譜法是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的純度與穩(wěn)定性有力的工具。在蛋白質(zhì)分析中通常采用反相高壓液相色譜法RP-HPLC、離子交換色譜IEC與分子排阻色譜SEC。反相色譜是以非極性固定相與含水的極性流動(dòng)相為基礎(chǔ)的分析方法。應(yīng)用反相HPLC，由于有機(jī)溶劑，疏水的相互作用及分離時(shí)所用低pH值，會(huì)使蛋白質(zhì)變性。然而該方法對(duì)幾種蛋白質(zhì)特別有用，并被廣泛地用于胰島素制劑的質(zhì)量分析。53蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法一、液相色譜法535454蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法二、光譜法通過對(duì)蛋白質(zhì)吸收、輻射、散射光的定量分析可以提供有價(jià)值的信息，了解蛋白質(zhì)的量、構(gòu)象和聚集傾向。用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)藥物的光譜方法有紫外可見吸收光譜UV、旋光色散ORD、圓二色譜CD、熒光、紅外IR和拉曼Raman光譜。紫外吸收常用于測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。光散射可用測(cè)定制劑中蛋白質(zhì)的聚集數(shù)量，散射強(qiáng)度是單位體積散射中心數(shù)的函數(shù)。55蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法二、光譜法55蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法三、電泳電泳技術(shù)是根據(jù)在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)在載體凝膠上產(chǎn)生特征性遷移，遷移率是所帶凈電荷和它的大小函數(shù)，以此來分離混合蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)的分析中廣泛使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳（SDS），等電點(diǎn)聚焦(isoclectricfocusing，IEF)和毛細(xì)管電泳（EC）法。SDS電泳用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞單位組成和分子量。EC優(yōu)點(diǎn)是：分辨率高、靈敏度高、分析時(shí)間短、易于自動(dòng)化。56蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法三、電泳56蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法四、生物活性測(cè)定與免疫測(cè)定生理活性檢測(cè)是利用體內(nèi)模型或體外組織或細(xì)胞對(duì)活性蛋白質(zhì)多肽的特異生物學(xué)反應(yīng)，通過劑量(或濃度)效應(yīng)曲線進(jìn)行定量（絕對(duì)量或比活性單位）。用理化方法代替生物活性測(cè)定時(shí)，需建立兩種方法之間的相關(guān)性。免疫測(cè)定優(yōu)點(diǎn)是可用于定量化學(xué)分析不能檢測(cè)的情況。57蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法四、生物活性測(cè)定與免疫測(cè)定57蛋白質(zhì)類藥物制劑的評(píng)價(jià)

1、制劑中藥物的含量測(cè)定；2、制劑中藥物的活性測(cè)定；3、制劑中藥物的體外釋藥速率測(cè)定；4、制劑的穩(wěn)定性研究（物理和化學(xué)穩(wěn)定性）；5、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究；6、刺激性和生物相容性研究。58蛋白質(zhì)類藥物制劑的評(píng)價(jià)1、制劑中藥物的含量測(cè)定；58生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

1．蛋白質(zhì)或多肽類藥物大多為內(nèi)源性物質(zhì)，臨床使用劑量小，藥理活性高，副作用小，很少有過敏反應(yīng)；2．蛋白質(zhì)或多肽類藥物穩(wěn)定性差，在酸堿環(huán)境或體內(nèi)酶存在下極易失活；3．蛋白質(zhì)或多肽類藥物分子量大，還時(shí)常以多聚體形式存在，很難透過胃腸道粘膜的上皮細(xì)胞層，故吸收很少，不能口服給藥，一般只有注射給藥一種途徑；4．蛋白質(zhì)或多肽類藥物體內(nèi)生物半衰期較短，從血中消除較快，因此在體內(nèi)的作用時(shí)間較短，往往不能充分發(fā)揮其作用。59生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

1．蛋白質(zhì)或多肽類藥物大多為內(nèi)源性物質(zhì)，生物技術(shù)藥物給藥系統(tǒng)的研究開發(fā)（1）對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽類藥物的普通注射劑，關(guān)鍵是提高其穩(wěn)定性；（2）對(duì)于體內(nèi)生物半衰期較短的蛋白質(zhì)或多肽類藥物，需要研究其長(zhǎng)效制劑，以延長(zhǎng)作用時(shí)間；（3）對(duì)于需要長(zhǎng)期給藥的蛋白質(zhì)或多肽類藥物，要研究可減少給藥次數(shù)的新劑型；（4）研究開發(fā)生物技術(shù)藥物的非注射給藥新劑型，如鼻腔給藥系統(tǒng)、肺部給藥系統(tǒng)及口服給藥系統(tǒng)等。（5）基因傳遞系統(tǒng)需要解決安全性、靶向性等問題。60生物技術(shù)藥物給藥系統(tǒng)的研究開發(fā)（1）對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽類藥物的第二節(jié)多肽、蛋白質(zhì)藥物的注射給藥

一、蛋白質(zhì)類藥物的一般處方組成目前臨床上應(yīng)用的蛋白質(zhì)類藥物注射劑，一為溶液型注射劑，另一種是冷凍干燥型注射劑。溶液型使用方便，但需在低溫（2~8°C）下保存。冷凍干燥型比較穩(wěn)定，但工藝較為復(fù)雜。61第二節(jié)多肽、蛋白質(zhì)藥物的注射給藥

一、蛋白質(zhì)類藥物的1.溶液型注射劑

在設(shè)計(jì)多肽、蛋白質(zhì)藥物的溶液型注射劑時(shí)，一般要考慮加入緩沖劑和穩(wěn)定劑;

有時(shí)還可加入防腐劑。多肽、蛋白質(zhì)藥物溶液型注射劑一般要求在2～8℃下保存，不能冷凍或振搖，取出后在室溫下一般要求在6～12h內(nèi)使用。在多肽、蛋白質(zhì)藥物的溶液型注射劑中常用的穩(wěn)定劑包括緩沖劑、鹽類、表面活性劑類、及糖類、氨基酸和人血清白蛋白(HSA)等。621.溶液型注射劑

在設(shè)計(jì)多肽、蛋白質(zhì)藥物的溶液型注射劑時(shí)溶液型蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定化方法（1）緩沖劑一般說來pH值和離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及溶解度都有很大影響，通常在蛋白質(zhì)藥物溶液配制中采用適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)是很必要的。（2）鹽類鹽類除了影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性外，其濃度對(duì)蛋白質(zhì)的溶液度與聚集均有很大影響。63溶液型蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定化方法（1）緩沖劑63（2）鹽類

在低濃度下可能以鹽溶為主,而高濃度下則可能發(fā)生鹽析。在適當(dāng)?shù)碾x子和濃度下,無機(jī)鹽可增加蛋白質(zhì)的表面電荷,促進(jìn)了蛋白質(zhì)與水的作用,從而增加其溶解度；相反,無機(jī)鹽可通過與水的更強(qiáng)的作用,破壞蛋白質(zhì)的表面水層,促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間的相互作用而使其產(chǎn)生聚集等。在多肽、蛋白質(zhì)藥物的溶液型注射劑中常用的鹽類有NaCl和KCl等。64（2）鹽類

在低濃度下可能以鹽溶為主,而高濃度下則可能（3）表面活性劑

離子型表面活性劑常會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。少量的非離子型的表面活性劑(主要是聚山梨酯類)具有防止蛋白質(zhì)聚集的作用?？赡艿臋C(jī)理是表面活性劑傾向性地分布于氣/液或液/液界面,防止蛋白質(zhì)在界面的變性等。聚山梨酯類可用于單抗制劑和球蛋白制劑等。65（3）表面活性劑

離子型表面活性劑常會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。65（4）糖類糖類與多元醇等可增加蛋白質(zhì)藥物在水中的穩(wěn)定性,這可能與糖類促進(jìn)蛋白質(zhì)的優(yōu)先水化有關(guān)。常用的糖類包括庶糖、葡萄糖、海藻糖和麥芽糖；常用的多元醇有甘油、甘露醇、山梨醇、PEG和肌醇等。66（4）糖類糖類與多元醇等可增加蛋白質(zhì)藥物在水中的穩(wěn)定性,（5）血清蛋白血清蛋白可以穩(wěn)定多肽、蛋白質(zhì)藥物人血清蛋白（HAS）可用于人體,在一些市售的生物技術(shù)藥物制劑中已被用作穩(wěn)定劑,用量為0.1%～0.2%。HAS易被吸附,可減少蛋白質(zhì)藥物的損失；可部分降低產(chǎn)品中痕量蛋白質(zhì)酶等對(duì)蛋白類藥物的破壞；可保護(hù)蛋白質(zhì)的構(gòu)象；也可作為凍干保護(hù)劑,如在白介素－2、干擾素和組織纖溶酶原激活素(t-PA)等制劑中。67（5）血清蛋白血清蛋白可以穩(wěn)定多肽、蛋白質(zhì)藥物HAS易（5）血清蛋白HAS易干擾多肽、蛋白質(zhì)藥物的分析,對(duì)產(chǎn)品純度的影響應(yīng)予以注意。干擾素類白介素-2EPO尿激酶單抗制劑、組織纖維酶原激活劑腫瘤壞死因子球蛋白制劑乙肝疫苗HAS可穩(wěn)定68（5）血清蛋白HAS易干擾多肽、蛋白質(zhì)藥物的分析,對(duì)產(chǎn)品純（6）氨基酸一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺等,可以增加蛋白質(zhì)藥物在給定pH下的溶解度,并可提高其穩(wěn)定性,用量一般為0.5%～5%,其中,甘氨酸比較常用。氨基酸除了可降低表面吸附和保護(hù)蛋白質(zhì)的構(gòu)象之外,還可防止多肽、蛋白質(zhì)藥物熱變性與聚集。氨基酸類可穩(wěn)定干擾素、EPO、尿激酶和門冬酰胺酶等。69（6）氨基酸一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺等2.注射用無菌粉末

多肽、蛋白質(zhì)藥物注射用無菌粉末在臨用時(shí)加注射用水或?qū)ｉT的稀釋液溶解,如人生長(zhǎng)激素(hGH)凍干制劑配有2.5ml的稀釋液(裝于5ml安瓿中),其中含0.3%的防腐劑(甲酚)和1.7%的等張調(diào)節(jié)劑(甘油),pH為7.5。溶解后一般也要求在2～8℃下保存,不能冷凍或振搖,并按要求在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用,有的還需要避光。設(shè)計(jì)多肽、蛋白質(zhì)藥物的注射用無菌粉末（冷凍干燥制劑更為常用）時(shí)，一般可考慮加入填充劑、緩沖劑和穩(wěn)定劑等。702.注射用無菌粉末

多肽、蛋白質(zhì)藥物注射用無菌粉末在臨用時(shí)固體狀態(tài)蛋白質(zhì)藥物的

穩(wěn)定性與工藝在一些蛋白質(zhì)藥物不能采用溶液型制劑時(shí)，往往用冷凍干燥與噴霧干燥的工藝解決這類制劑的穩(wěn)定性問題，這兩種工藝均可用于熱敏感藥物的脫水以延緩溶液中常見的分解作用。71固體狀態(tài)蛋白質(zhì)藥物的

穩(wěn)定性(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

冷凍干燥制備蛋白質(zhì)類藥物制劑主要考慮兩個(gè)問題：一是選擇適宜的輔料，優(yōu)化蛋白質(zhì)藥物在干燥狀態(tài)下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。二是考慮輔料對(duì)冷凍干燥過程一些參數(shù)的影響，如最高與最低干燥溫度，干燥時(shí)間，冷凍干燥產(chǎn)品的外觀等。72(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

冷凍干燥制備蛋白質(zhì)類藥物制劑(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

關(guān)于蛋白質(zhì)類藥物添加劑的選擇，首先要認(rèn)識(shí)到雖然凍干可以使蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定，但不應(yīng)忽略有些蛋白質(zhì)藥物在凍干過程中反而失去活性。另外，高濃度的鹽、緩沖組分的結(jié)晶或緩沖液pKa對(duì)溫度敏感而導(dǎo)致pH變化，濃縮時(shí)蛋白質(zhì)有限的溶液度等均能導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物失活。73(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

關(guān)于蛋白質(zhì)類藥物添加劑的選擇(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

在選擇凍干制劑的緩沖體系時(shí)，要考慮到溫度對(duì)pH和緩沖系統(tǒng)溶液度的影響。凍干狀態(tài)與溶液狀態(tài)的穩(wěn)定機(jī)制不同，凍干狀態(tài)的穩(wěn)定機(jī)制可能是除去水化層后，輔料作為水的替代物結(jié)合在蛋白質(zhì)上。74(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

在選擇凍干制劑的緩沖體系時(shí)，(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

單劑量的蛋白質(zhì)藥物的量一般很少，凍干過程中和除去水分后，瓶?jī)?nèi)只剩很少的物質(zhì)，也不會(huì)形成凍干餅塊，因此用填充劑來改善產(chǎn)品的外觀。甘露醇是最常使用的填充劑，它還可作凍干保護(hù)劑。其他羥基醇如山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐也可用作增容填充劑。75(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

單劑量的蛋白質(zhì)藥物的量一般很(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑糖類與多元醇還具有凍干保護(hù)劑的作用。在冷凍干燥過程中隨著周圍的水被除去蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性,而糖類和多元醇等多羥基化合物可代替水分子,使蛋白質(zhì)與之產(chǎn)生氫鍵（水置換假說）。這對(duì)蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定是十分有利的。76(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑糖類與多元醇還具有凍干保護(hù)劑的作(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑溶液中的成分也可以影響冷凍干燥過程中與熱有關(guān)的工藝參數(shù)。凍干過程中與熱有關(guān)的性質(zhì)有：制劑的冷凍溫度，有可能使餅狀物熔化或坍塌的溫度，有可能使產(chǎn)品發(fā)生降解的溫度。77(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑溶液中的成分也可以影響冷凍干燥過(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑在凍干過程中還應(yīng)考慮藥物的含水量與餅狀物的物理狀態(tài)(無定性或晶形)，其物理狀態(tài)與冷凍過程的溫度及添加劑有關(guān)。無定形的水分含量一般較高。水分的增加會(huì)降低餅狀物的物理穩(wěn)定性并可能導(dǎo)致貯藏過程中餅狀物的坍塌。此外水分也可以影響蛋白質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性。DSC是表征與優(yōu)化凍干工藝有用的技術(shù)。78(1)冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑在凍干過程中還應(yīng)考慮藥物的含水量(2)噴霧干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

噴霧干燥的特點(diǎn)是所得產(chǎn)品可以控制顆粒大小與形狀，生產(chǎn)出流動(dòng)性很好的球狀顆粒。此項(xiàng)工藝對(duì)制備蛋白質(zhì)類藥物的控釋制劑特別是發(fā)展新的給藥系統(tǒng)是很有用的。在噴霧干燥過程中也可加入穩(wěn)定劑。噴霧干燥的缺點(diǎn)是操作過程中損失大，特別是小規(guī)模生產(chǎn)，水分含量高。79(2)噴霧干燥蛋白質(zhì)藥物制劑

噴霧干燥的特點(diǎn)是所得產(chǎn)品可以二、新型注射給藥系統(tǒng)

要延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)血漿半衰期就需要改變蛋白質(zhì)的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)的分子進(jìn)行化學(xué)修飾以抑制其藥理清除達(dá)到延長(zhǎng)蛋白質(zhì)類藥物血漿半衰期的目的。PEG化除了化學(xué)修飾外，用控制藥物釋放來延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，達(dá)到提高療效的目的。這方面的研究有控釋微球制劑與脈沖式給藥系統(tǒng)。80二、新型注射給藥系統(tǒng)

要延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)血漿半衰期就需（一）控釋微球制劑為了達(dá)到蛋白質(zhì)類藥物控制釋放，可將其制成生物可降解的微球制劑目前已經(jīng)實(shí)際應(yīng)用的生物可降解材料有聚乳酸（PLA）或聚乳酸乙醇共聚物（PLGA）聚丙交酯-乙交酯81（一）控釋微球制劑818282（一）控釋微球制劑首次經(jīng)FDA批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)類藥物微球制劑就是醋酸亮丙瑞林PLGA微球。83（一）控釋微球制劑首次經(jīng)FDA批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)類藥物微球制劑就是PLGA微球O/O液中干燥法O/W液中干燥法84PLGA微球O/O液中干燥法O/W液中干燥法84

ABC

(A)PLGA15000(B)PLGA20000(C)PLGA30000

85

APLA微球光鏡照片（×160）86PLA微球光鏡照片（×160）86PLA微球電鏡照片(×2000)

87PLA微球電鏡照片(×2000)

87國(guó)外開發(fā)的LHRH及其類似物緩釋注射劑

藥物生物半衰期劑型商品名骨架緩釋時(shí)開發(fā)公司LHRH

亮丙瑞林

(leuprorelin)活性/min

材料間/月

18

1516微球ProstapSR，PLGA1Abott/武田

Enantone，75∶25

Lucrin，

Lupron，

Tap-144SR

微球

PLA3武田(1996年

向歐美提出

新藥申請(qǐng))88國(guó)外開發(fā)的LH曲普瑞林

(triptorelin)10030微球DecapeptylPLCG1Ipsen/

50∶50

Ferring布舍瑞林

(buserelin)2580注射埋

PLCG1Hoechst

植劑

75∶25

高舍瑞林

(goserelin)75

注射埋ZoladexPLCG1ICI

植劑

50∶50

那法瑞林

(nafarelin)200144微球

PLCA

Syntex/South

50∶50

Res.Inst.(Ⅱ

期臨床)國(guó)外開發(fā)的LHRH及其類似物緩釋注射劑89曲普瑞林

(triptorelin)10030微球Decap研究中的其它多肽、蛋白質(zhì)藥物微球注射劑

藥物適應(yīng)證劑型骨架研究進(jìn)展

材料

促紅細(xì)胞生成腎功能不全微球PLGA體外緩釋素(EPO)貧血

50∶502周γ-干擾素肉芽瘤微球PLGA體外緩釋(rhIFN-γ)

50∶507d白介素(IL-α)腫瘤免疫微球PLGA動(dòng)物體內(nèi)治療

50∶50緩釋7d

75∶25

人粒細(xì)胞巨噬細(xì)骨髓移植微球PLGA動(dòng)物體內(nèi)胞集落刺激因子

50∶50緩釋9d(GM-CSF)

人生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)不良微球PLGA動(dòng)物體內(nèi)(rhGH)腎功能不全

50∶50緩釋30d生長(zhǎng)抑素生長(zhǎng)激素分注射埋PLGA動(dòng)物體內(nèi)(somatostatin)泌亢進(jìn)植劑50∶50緩釋250d90研究中的其它多肽、蛋白質(zhì)藥物微球注射劑

藥物適應(yīng)證劑型骨此類制劑盡管有發(fā)展前景，但仍存在許多問題，主要是由于體內(nèi)多聚物降解而產(chǎn)生酸性環(huán)境使蛋白分子不穩(wěn)定，因而在其他類型的生物技術(shù)產(chǎn)品的應(yīng)用上受到限制。91此類制劑盡管有發(fā)展前景，但仍存在許多問題，91常用于制備多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子藥物微球的方法：

1、噴霧干燥法2、復(fù)乳液中干燥法3、低溫噴霧干燥法4、超臨界萃取法92常用于制備多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子藥物微球的方法：92超臨界萃取法超臨界流體既具有對(duì)溶質(zhì)有較大溶解度的特點(diǎn)，又具有氣體易于擴(kuò)散和動(dòng)運(yùn)的特點(diǎn)。更為重要的是在臨界點(diǎn)附近，壓力和溫度微小的變化都可以引起流體密度很大的變化，并相應(yīng)地表現(xiàn)為溶解度的變化。93超臨界萃取法超臨界流體既具有對(duì)溶質(zhì)有較大溶解度的特點(diǎn)，又具有超臨界萃取法在制備微粒中根據(jù)聚合物及藥物的溶解特性又分為超臨界溶液快速膨脹（rapidexpansionofsupercriticalsolution，RESS）技術(shù)和氣體反溶劑（gasantisolution,GAS）技術(shù)。94超臨界萃取法在制備微粒中根據(jù)聚合物及藥物的溶解特性94RESS技術(shù)RESS技術(shù)是將固體物質(zhì)在一定的溫度和壓力下溶解在超臨界流體中形成溶液，然后將此高壓溶液從一個(gè)細(xì)小的噴嘴(內(nèi)徑為幾十微米，長(zhǎng)約幾個(gè))噴射到常壓的空間中，由于超臨界流體在減壓的過程中變成了氣體，溶解在其中的溶質(zhì)就沉淀析出，產(chǎn)生直徑從幾百納米到幾個(gè)微米左右的顆粒。95RESS技術(shù)RESS技術(shù)是將固體物質(zhì)在一定的溫度和壓力下溶解GAS技術(shù)GAS技術(shù)是將溶質(zhì)先溶解在某種有機(jī)溶劑中，然后將此溶液與超臨界流體混合。由于有機(jī)溶劑可溶于超臨界流體而溶質(zhì)不溶，于是溶質(zhì)析出形成微粒。96GAS技術(shù)GAS技術(shù)是將溶質(zhì)先溶解在某種有機(jī)溶劑中，96控釋微球制劑由于微球的注射劑量有限,在制備多肽、蛋白質(zhì)藥物緩釋微球時(shí),應(yīng)選擇日劑量小的藥物；微球的釋藥模式與藥物的臨床需求應(yīng)基本吻合；微球中藥物的包封率要高,釋藥時(shí)突釋作用應(yīng)較小(這是一個(gè)難題),釋藥模式要恒定,釋藥時(shí)間要達(dá)到要求。97控釋微球制劑由于微球的注射劑量有限,在制備多肽、蛋白質(zhì)藥(二)脈沖式給藥系統(tǒng)肝炎、破傷風(fēng)、白喉等疾病所用預(yù)防藥物即疫苗或類毒素均為抗原蛋白，其中乙肝疫苗已能用生物技術(shù)制造。使用這些疫苗全程免疫至少進(jìn)行三次接種，才能確證免疫效果由于種種原因，全世界不能完成全程免疫接種而發(fā)生輟種率達(dá)70%因此為了提高免疫接種的覆蓋率，減少一些重大疾病的死亡率，世界衛(wèi)生組織疫苗發(fā)展規(guī)化主要目標(biāo)之一，就是將多劑疫苗發(fā)展為單劑疫苗，其中之一就是研制成脈沖式給藥系統(tǒng)。98(二)脈沖式給藥系統(tǒng)98脈沖式給藥系統(tǒng)示意圖99脈沖式給藥系統(tǒng)示意圖99研究中的一次性注射疫苗微球

抗原微球骨架材料粒徑/μm體內(nèi)釋藥模式動(dòng)物及用藥途徑BSA乙烯醋酸乙0.3初始突釋，以后小鼠皮下埋植酯(EVAC)

連續(xù)釋藥

γ-核糖核EVAC0.3初始突釋，以后兔皮下埋植酸酶A

連續(xù)釋藥

BSAEVAC

初始突釋，以后兔皮下埋植

連續(xù)釋藥

BSA聚TTH-亞氨0.5克微球(內(nèi)連續(xù)釋藥后期小鼠皮下埋植基碳酸鹽含BSA50mg)減慢

卵清蛋白PLGA50∶505.34

小鼠腹腔注射34kDa

SEBPLGA1～10

小鼠腹腔注射50∶5020～50

100研究中的一次性注射疫苗微球

抗原微球骨架白喉類毒素PLA30～100初始突釋，以小鼠氣管滴注至49kDa

后連續(xù)釋藥肺、皮下注入MN-rgp120PLGA20～100脈沖釋藥豚鼠皮下注入HSD白喉PLGA65∶355～90連續(xù)釋藥大鼠、猴肌注類毒素PLA

MN-rgp120PLGA50∶500.37～0.50

小鼠皮下、肌注34kDa

及鼻腔用藥各種多肽PLGA0.45～0.60

小鼠腹腔、肌內(nèi)抗原50∶501.21～3.20

注射

6.24～32.1

注：BSA：牛血清白蛋白；SEB：葡萄球菌腸毒素β類毒素；MN-rgp120：人免疫缺陷病毒(HIV-1)預(yù)防疫苗的蛋白亞單位101白喉類毒素PLA30～100初始突釋，以小鼠氣管滴注至49k(三)主要發(fā)展方向注射型給藥系統(tǒng)主要以生物降解材料為載體，

天然聚合物：明膠、葡聚糖、白蛋白、甲殼素等。合成聚合物：PLA、聚丙交酯、聚己內(nèi)酯、聚羥丁酸等。102(三)主要發(fā)展方向102(1)埋植型緩控釋給藥系統(tǒng)(棒狀結(jié)構(gòu))如：布舍瑞林+PLA熔融混合→擠出條狀物(直徑為1mm)→切割成單劑量(含3.6mg藥物/段)→滅菌→密封于一次性注射器內(nèi)(供皮下或肌肉注射，緩控釋作用可達(dá)1年以上)。103(1)埋植型緩控釋給藥系統(tǒng)(棒狀結(jié)構(gòu))103(2)微球型緩控釋注射給藥系統(tǒng)一般皮下或肌肉注射，粒徑<500um。主要制備技術(shù)：相分離法、復(fù)乳-液中干燥法、噴霧干燥法、噴霧冷凍法、熔融擠出法等(緩釋作用可達(dá)1~3個(gè)月)。104(2)微球型緩控釋注射給藥系統(tǒng)104(3)納米型給藥系統(tǒng)

粒徑<200nm，皮下或肌肉注射緩控釋，靜脈和動(dòng)脈給藥靶向性）主要?jiǎng)┬陀校褐|(zhì)體、微乳和復(fù)乳、脂質(zhì)納米粒、納米球和納米囊。105(3)納米型給藥系統(tǒng)

粒徑<200nm，皮下或肌肉注射緩控第三節(jié)多肽、蛋白質(zhì)藥物非注射制劑

蛋白質(zhì)和多肽類藥物非注射途徑包括鼻腔、口服、直腸、口腔、透皮、眼內(nèi)和肺部給藥，其中鼻腔似乎最有前景，然而口服給藥是目前最受歡迎的給藥途經(jīng)。蛋白質(zhì)類藥物非注射途經(jīng)系統(tǒng)存在的主要問題是藥物穿透粘膜能力差，易受酶的降解，以至生物利用度很低。106第三節(jié)多肽、蛋白質(zhì)藥物非注射制劑

蛋白質(zhì)和多肽類藥物為了提高這類藥物制劑的生物利用度，一般采用以下方法：(1)對(duì)藥物進(jìn)行化學(xué)修飾或制成前體藥物；(2)應(yīng)用吸收促進(jìn)劑；(3)使用酶抑制劑；(4)采用離子電滲法皮膚給藥。107為了提高這類藥物制劑的生物利用度，一般采用以下方法：107吸收促進(jìn)劑作用機(jī)制(1)增強(qiáng)藥物的熱力學(xué)運(yùn)動(dòng)，使藥物不易聚集，溶解性增加，易于吸收；(2)改變上皮細(xì)胞的體積，使細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)更易進(jìn)行；(3)增加生物膜的流動(dòng)性，使藥物容易穿過，或引起膜磷酯排列的混亂或是促進(jìn)膜中蛋白的瀝濾；(4)抑制藥物的水解。108吸收促進(jìn)劑作用機(jī)制(1)增強(qiáng)藥物的熱力學(xué)運(yùn)動(dòng)，使藥物不易聚集(一)鼻腔給藥系統(tǒng)

鼻腔給藥對(duì)多肽蛋白質(zhì)藥物在非注射劑型中是一個(gè)較有希望的給藥途經(jīng)。由于鼻腔粘膜中動(dòng)靜脈和毛細(xì)淋巴管分布十分豐富，鼻腔呼吸區(qū)細(xì)胞表面具有大量微小絨毛，鼻腔粘膜的穿透性較高而酶相對(duì)較少，對(duì)蛋白質(zhì)類藥物的分解作用比胃腸道粘膜為低，因而有利于藥物的吸收并直接進(jìn)入體內(nèi)血液循環(huán)。為了提高蛋白質(zhì)類藥物鼻腔給藥的生物利用度，可采用吸收促進(jìn)劑。109(一)鼻腔給藥系統(tǒng)鼻腔給藥對(duì)多肽蛋白質(zhì)藥物在非注射劑型中是鼻腔給藥常用吸收促進(jìn)劑(1)膽酸鹽類：甘膽酸鹽、膽酸鹽、去氧膽酸鹽、牛磺膽酸鹽、葡萄糖膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽、烏索去氧膽酸鹽等。(2)脂肪酸及其酯類：癸酸酯、辛酸酯、月桂酸酯等。(3)其它：十二烷基硫酸鈉、檸檬烯、?；请p氫褐霉素鈉、殼聚糖等。110鼻腔給藥常用吸收促進(jìn)劑(1)膽酸鹽類：甘膽酸鹽、膽酸鹽、去氧(二)肺部給藥系統(tǒng)肺部具有巨大的可供吸收的表面積和十分豐富的毛細(xì)血管,從肺泡表面到毛細(xì)血管的轉(zhuǎn)運(yùn)距離極短,而且肺部的酶活性較胃腸道低,沒有胃腸道那么苛刻的酸性環(huán)境,在肺部吸收的藥物可直接進(jìn)入血液循環(huán),故可避開肝臟的首過效應(yīng)?，F(xiàn)在人們已越來越多地意識(shí)到,肺部對(duì)那些在胃腸道難以吸收的藥物(如大分子藥物)來說可能是一個(gè)很好的給藥途徑。111(二)肺部給藥系統(tǒng)肺部具有巨大的可供吸收的表面積和十分豐富早在1987年就有人進(jìn)行了糖尿病患兒的胰島素吸入治療；1993年以來很多人進(jìn)行過糖尿病患者的胰島素霧化吸入治療,有人證實(shí)胰島素吸入的生物利用度達(dá)15%左右,有人證實(shí)胰島素吸入可以調(diào)節(jié)餐后高血糖。112早在1987年就有人進(jìn)行了糖尿病患兒的胰島素吸入治療；1近年來胰島素的肺部給藥系統(tǒng)又取得了較大進(jìn)展,如Aradigm公司開發(fā)了可精確控制給藥量的霧化吸人裝置(AERx),在健康志愿者和糖尿病患者身上達(dá)到了與皮下注射相似的降糖效果,而且重現(xiàn)性較好；Dura和Inhale公司則開發(fā)了胰島素的粉末吸入裝置,在餐后高血糖的控制與長(zhǎng)期給藥的療效方面都獲得了較好的結(jié)果,與皮下注射給藥進(jìn)行了二個(gè)月的比較,對(duì)血糖的控制幾乎相同,而且粉末吸入組沒有出現(xiàn)肺部的損害。這些研究顯示了多肽、蛋白質(zhì)藥物肺部給藥系統(tǒng)的光明前景。113近年來胰島素的肺部給藥系統(tǒng)又取得了較大進(jìn)展,113(二)肺部給藥系統(tǒng)

目前肺部給藥系統(tǒng)存在的主要問題：(1)長(zhǎng)期給藥后安全性評(píng)估；(2)肺吸收分子大小的限制；(3)促進(jìn)吸收的措施；(4)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物的處方設(shè)計(jì)等。114(二)肺部給藥系統(tǒng)目前肺部給藥系統(tǒng)存在的主要問題：11(三)口服給藥系統(tǒng)蛋白質(zhì)類口服給藥主要存在的問題：(1)在胃內(nèi)酸催化降解；(2)在胃腸道內(nèi)的酶水解；(3)對(duì)胃腸道粘膜的透過性差；(4)在肝的首過效應(yīng)。115(三)口服給藥系統(tǒng)115蛋白質(zhì)類口服給藥主要?jiǎng)┬停?1)微乳制劑；(2)納米囊；(3)腸溶軟膠囊；(4)微球制劑；(5)脂質(zhì)體等。116蛋白質(zhì)類口服給藥主要?jiǎng)┬停?2)納米囊；(4)微球制劑；(四)口腔粘膜給藥系統(tǒng)口腔粘膜較鼻腔粘膜厚，但無角質(zhì)層，面頰部血管豐富，藥物吸收后可經(jīng)頸靜脈、上腔靜脈直接進(jìn)入全身，可胃腸消化液降解和肝的首過效應(yīng)?？谇徽衬の罩饕倪M(jìn)藥物的膜穿透性和抑制藥物的代謝。117(四)口腔粘膜給藥系統(tǒng)117口腔粘膜給藥常用吸收促進(jìn)劑有：甘膽酸鈉、去氧膽酸鈉、梭鏈孢酸鈉、聚氧乙烯(9)月桂基醚、聚氧乙烯(9)辛基醚、十二烷基硫酸鈉、磷脂酰肌醇等。118口腔粘膜給藥常用吸收促進(jìn)劑有：118(五)直腸給藥系統(tǒng)直腸內(nèi)水解酶活性比胃腸道低，pH接近中性，且藥物吸收后可基本上避免肝的首過效應(yīng)。119(五)直腸給藥系統(tǒng)119直腸給藥常用吸收促進(jìn)劑有：水楊酸、5-甲氧基水楊酸、去氧膽酸鈉、DL-苯基苯胺乙醚乙酸乙酯(DL-phenylalanineethylacetoacetate)、聚氧乙烯(PEO-9-月桂基醚)、烯胺類(enamine)衍生物如D-甘氨酸鈉、D-亮氨酸鈉、D-苯丙氨酸鈉等。120直腸給藥常用吸收促進(jìn)劑有：120（六）經(jīng)皮給藥系統(tǒng)皮膚的穿透性低是多肽和蛋白質(zhì)藥物經(jīng)皮吸收的主要障礙，但皮膚的水解酶活性相當(dāng)?shù)停瑸槎嚯暮偷鞍踪|(zhì)藥物經(jīng)皮吸收創(chuàng)造了有利條件。121（六）經(jīng)皮給藥系統(tǒng)121Thanks122Thanks122生物技術(shù)藥物制劑藥劑教研室張娜123生物技術(shù)藥物制劑藥劑教研室1本章學(xué)習(xí)要求：掌握生物技術(shù)的概念和生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)和理化性質(zhì)。掌握蛋白質(zhì)類藥物的處方與工藝。熟悉掌握蛋白質(zhì)類藥物新型給藥系統(tǒng)和評(píng)價(jià)方法。124本章學(xué)習(xí)要求：掌握生物技術(shù)的概念和生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)和理化性主要內(nèi)容第一節(jié)概述蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法第二節(jié)多肽、蛋白質(zhì)類藥物的注射給藥第三節(jié)多肽、蛋白質(zhì)類藥物的非注射制劑

第四節(jié)基因傳遞系統(tǒng)125主要內(nèi)容第一節(jié)概述3第一節(jié)概述

生物技術(shù)或稱生物工程（biotechnology),是應(yīng)用生物體（包括微生物，動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞）或其組成部分（細(xì)胞器和酶），在最適條件下，生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)物或進(jìn)行有益過程的技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要包括基因工程，細(xì)胞工程與酶工程。此外還有發(fā)酵工程（微生物工程）與生化工程。126第一節(jié)概述生物技術(shù)或稱生物工程（biotechnolo二、生物技術(shù)藥物產(chǎn)品生物技術(shù)藥物產(chǎn)品，目前國(guó)內(nèi)外已批準(zhǔn)上市的約40多種，正在研究的數(shù)百種之多，這些藥物均屬肽類與蛋白質(zhì)類藥物。1、定義系指由重組產(chǎn)品、天然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物藥物的總稱。127二、生物技術(shù)藥物產(chǎn)品52、現(xiàn)代生物藥物的分類(1)基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑(即重組DNA技術(shù))；(2)基因藥物(基因治療劑、基因疫苗、反義藥物和核酸)；(3)天然生物藥物(動(dòng)物、植物、微生物和海洋生物藥物)；(4)合成和部分合成生物藥物。1282、現(xiàn)代生物藥物的分類63、生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

多數(shù)受胃酸及消化酶的降解破壞其生物半衰期亦較短，需頻繁注射給藥即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也較低長(zhǎng)期注射易造成患者心理和生理的痛苦另外，多數(shù)多肽和蛋白質(zhì)類藥物不易被親脂性膜所攝取，很難通過生物屏障。1293、生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

多數(shù)受胃酸及消化酶的降解破壞7三、生物技術(shù)藥物及其制劑的發(fā)展前景1、發(fā)展概況自1982年第一個(gè)重組藥物：人工胰島素上市以來，第二代生物技術(shù)藥物正在取代第一代多肽、蛋白質(zhì)類替代治療劑。第一代重組藥物是一級(jí)結(jié)構(gòu)與天然產(chǎn)物完全一致的藥物；第二代生物技術(shù)藥物是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造的自然界不存在的新的重組藥物。130三、生物技術(shù)藥物及其制劑的發(fā)展前景8生物技術(shù)藥物的發(fā)展到1998年為止,全球已有65個(gè)生物技術(shù)藥物問市,另有2600多個(gè)生物技術(shù)藥物正處于臨床前的研究階段,700多個(gè)生物技術(shù)藥物正進(jìn)行臨床評(píng)價(jià),其中200多種已進(jìn)入四期臨床或最后審批階段,估計(jì)2000年全球生物技術(shù)藥物的銷售額會(huì)超過200億美元,而近年內(nèi)生物技術(shù)藥品將占新藥總數(shù)的20%以上。生物技術(shù)藥物有著廣闊的發(fā)展前景。131生物技術(shù)藥物的發(fā)展到1998年為止,全球已有65生物技術(shù)藥物的發(fā)展美國(guó)一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首，已上市116個(gè)藥物，治療數(shù)百種疾病，2000年產(chǎn)值超過200億美元；已有723種生物技術(shù)藥物正在通過FDA審批。德國(guó)已超過日本，到2001年底已有68種藥物上市，正在臨床試驗(yàn)的有100多個(gè)。日本多數(shù)藥物是與美國(guó)合作的產(chǎn)物，已上市的有50個(gè)藥物。我國(guó)已批準(zhǔn)上市的品種有21種，主要通過跟蹤研究與創(chuàng)仿相結(jié)合的方法，目前已步入自主創(chuàng)新階段，并以“新型生物技術(shù)藥物和疫苗”作為發(fā)展重點(diǎn)。132生物技術(shù)藥物的發(fā)展美國(guó)一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首，已上市生物技術(shù)藥物的發(fā)展目前以生物技術(shù)，微電子，新材料，新能源，海洋工程和空間技術(shù)等為主要內(nèi)容的新技術(shù)革命浪潮正以萬鈞之勢(shì)迅猛發(fā)展。在新技術(shù)革命中，生物技術(shù)又是各國(guó)優(yōu)先發(fā)展的領(lǐng)域。傳統(tǒng)的經(jīng)典制藥工業(yè)由于基因工程，細(xì)胞融合，酶工程，結(jié)構(gòu)修飾等現(xiàn)代生物技術(shù)的滲入，使醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)期。盡管這類產(chǎn)品目前還不太多，但它代表了醫(yī)藥產(chǎn)品發(fā)展的方向。133生物技術(shù)藥物的發(fā)展目前以生物技術(shù)，微電子，新材料，新能源，海隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，肽和蛋白質(zhì)藥物制劑的研究與開發(fā)，已成為醫(yī)藥工業(yè)中一個(gè)重要的領(lǐng)域，同時(shí)給藥物制劑帶來新的挑戰(zhàn)，由于生物技術(shù)產(chǎn)品多為多肽和蛋白質(zhì)類，性能很不穩(wěn)定，極易變質(zhì)，因此如何將這類藥物制成穩(wěn)定，安全，有效的制劑，就是擺在我們面前的一大難題。運(yùn)用制劑手段將注射用藥制成口服或其他途徑給藥，亦即研究新的給藥系統(tǒng)，也是一項(xiàng)十分艱巨的任務(wù)。由于這類藥物及其制劑療效獨(dú)特應(yīng)用日益廣泛，因而具有進(jìn)一步研究的價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。生物技術(shù)藥物的發(fā)展134隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，肽和蛋白質(zhì)藥物制劑的研究與開發(fā)，已成表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物135表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物13表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物136表已上市的部分常見生物技術(shù)藥物14蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)

一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(一)蛋白質(zhì)的組成和一般結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定排列順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈。蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)包括氨基酸組成，肽鏈數(shù)目，末端組成，氨基酸排列順序和二硫鍵的位置等。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種。連接氨基酸之間的鍵稱為酰胺鍵，又稱肽鍵，是蛋白質(zhì)中氨基酸之間連接最基本的共價(jià)鍵。137蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)15蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)為初級(jí)結(jié)構(gòu)，指蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸排列順序，包括肽鏈數(shù)目和二硫鍵位置。二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)為高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和二硫鍵與蛋白質(zhì)的生物活性有重要關(guān)系。138蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)：16(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)包括二級(jí)，三級(jí)與四級(jí)結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈骨架的折疊方式，即肽鏈主鏈有規(guī)律的空間排布，一般有α螺旋結(jié)構(gòu)與β折疊形式。139(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)包括二級(jí)，三級(jí)與四α螺旋與β折疊140α螺旋與β折疊18(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條螺旋肽鏈，即已折疊的肽鏈在分子中的空間構(gòu)型，即分子中的三維空間排列或組合的方式，系一條多肽鏈中所有原子的空間排部。四級(jí)結(jié)構(gòu)是指具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的各亞基聚合而成的大分子蛋白質(zhì)。141(二)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條螺旋肽鏈，即已折疊的肽蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖142蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖20蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素的四級(jí)結(jié)構(gòu)可以由兩個(gè)以上的分子量為6000或12000的小亞基聚合而成。所謂亞基就是含有二條或多條多肽鏈的蛋白質(zhì)，這些多肽鏈彼此以非共價(jià)鏈相連，每一條多肽鏈都有自己的三級(jí)結(jié)構(gòu)，此多肽鏈就是該蛋白質(zhì)分子的亞單位（亞基）。143蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素的四級(jí)結(jié)構(gòu)可以由兩個(gè)以上的分子量為60二條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)144二條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)22六條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)145六條亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)23蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象又叫空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、三維構(gòu)象等，它是指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間中的排布。這種空間排布的變化，僅涉及到氫鍵等次級(jí)鍵的生成與斷裂，但不涉及共價(jià)鍵的生成與斷裂。146蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象又叫空間結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)豐富多彩的蛋白質(zhì)世界147豐富多彩的蛋白質(zhì)世界25蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)與生物活性蛋白質(zhì)分子只有在其立體結(jié)構(gòu)呈特定的構(gòu)象（conformation)時(shí)才有生物活性，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力有氫鍵、疏水作用力（hydrophobicforce)、離子鍵、范德華力、二硫鍵與配位鍵。除二硫鍵為共價(jià)鍵外，其余都是非共價(jià)鍵，維持蛋白質(zhì)構(gòu)象是弱作用力。148蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)與生物活性蛋白質(zhì)分子只有在其立體結(jié)構(gòu)呈特維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力蛋白質(zhì)分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋、β折疊的形成依靠氫鍵，可以說蛋白質(zhì)分子內(nèi)部布滿了氫鍵。疏水作用力也稱疏水鍵，系兩個(gè)疏水基為了避開水相而群集在一起的作用力，在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。149維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力蛋白質(zhì)分子中二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋、β折疊的維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力范德華力對(duì)穩(wěn)定和維持三級(jí)，四級(jí)結(jié)構(gòu)十分重要。離子鍵對(duì)于維持蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)是不可缺少的。不少蛋白質(zhì)含有金屬離子，而金屬離子是通過配位鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，故結(jié)合蛋白質(zhì)是由氨基酸成分與非氨基酸通過配位組成。150維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力范德華力對(duì)穩(wěn)定和維持三級(jí)，四級(jí)結(jié)構(gòu)十分金屬離子配位鍵151金屬離子配位鍵29二、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)1、旋光性蛋白質(zhì)分子總體旋光性由構(gòu)成氨基酸各個(gè)旋光度的總和決定，通常是右旋，它由螺旋結(jié)構(gòu)引起。蛋白質(zhì)變性，螺旋結(jié)構(gòu)松開，則其左旋性增大。152二、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)30(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

2、紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶苯丙氨酸，酪氨酸與色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm顯示強(qiáng)吸收。153(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

2、紫外吸收31(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

3、蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)除了肽鏈N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的側(cè)鏈上還有很多解離基團(tuán)，這些解離基團(tuán)在一定pH條件下都能發(fā)生解離而帶電。因此蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下蛋白質(zhì)會(huì)成為陽離子，陰離子或二性離子。154(一)蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)

3、蛋白質(zhì)兩性本質(zhì)與電學(xué)性質(zhì)(二)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的原因1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性

共價(jià)鍵改變引起蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的化學(xué)反應(yīng)有水解，氧化和消旋化，此外還有蛋白質(zhì)的特有反應(yīng)，即二硫鍵的斷裂與交換。有時(shí)幾種反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行155(二)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的原因1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)（IP）時(shí)一般最穩(wěn)定，溶解也最少。在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相應(yīng)的pH所有離子的凈電荷為零，因而減少了電荷排斥和蛋白質(zhì)伸展的趨勢(shì)。1561、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)（I1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)可被酸，堿和蛋白酶催化水解，使蛋白質(zhì)分子斷裂，分子量逐步變小，成為分子量大小不等的肽段和氨基酸。水解分完全水解與不完全水解。1571、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)水解31、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的氧化蛋白質(zhì)中具有芳香側(cè)鏈的氨基酸可以在一些氧化劑作用下氧化。常用氧化劑有分子氧、過氧化氫、過甲酸、氧自由基等。1581、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的氧化1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(3)外消旋作用(racemization)某些旋光性物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)過程中，由于不對(duì)稱碳原子上的基團(tuán)在空間位置上發(fā)生轉(zhuǎn)移，使D-或L-型化合物轉(zhuǎn)變?yōu)镈-型和L-型各50%的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，這種現(xiàn)象稱為外消旋作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)用堿水解時(shí)往往會(huì)使某些氨基酸產(chǎn)生消旋作用。1591、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(3)外消旋作用(r1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(4)二硫鍵及其交換二硫鍵（-S-S-）又叫二硫橋或硫硫橋，是很強(qiáng)的化學(xué)鍵。它是由兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈上的疏基（-SH）脫氫相連而成。二硫鍵把同一肽鏈或不同肽鏈（肽鏈間）的不同部分連接起來，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象起重要作用。1601、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性(4)二硫鍵及其交1、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的數(shù)目愈多，則結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗拒外界因素的能力也愈強(qiáng)。蛋白質(zhì)分子中二硫鍵斷裂接著重排能夠改變蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，因此影響其生物活性。1611、蛋白質(zhì)藥物由于共價(jià)鍵破壞引起不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性引起蛋白質(zhì)不可逆失活作用的三種主要類型聚集（aggregation)，宏觀沉淀，和表面吸附與蛋白質(zhì)變性，這些都是由于與空間構(gòu)象有關(guān)的非共價(jià)鍵引起。非共價(jià)的靜電力，氫鍵，疏水的相互作用以及蛋白質(zhì)的水化，可以因溫度于pH而發(fā)生改變。1622、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性402、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的不可逆失活，一般以自然狀態(tài)開始可逆的伸展，隨著溫度的增加，溶液中的蛋白質(zhì)分子在熔融溫度(Tm)從天然的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)。溶液pH可以影響靜電的相互作用。Tm為50%分子伸展時(shí)的溫度。1632、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的不可逆失活，一般以自然2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)的聚集與沉淀蛋白質(zhì)聚集(凝集，aggregation)是蛋白質(zhì)分子結(jié)合的微觀過程。蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)指可見蛋白質(zhì)顆粒的生成。不可逆的聚集往往是由于蛋白質(zhì)伸展所致。1642、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(1)蛋白質(zhì)的聚集與沉淀422、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)溶液振搖可以導(dǎo)致聚集與沉淀，這是由于空氣氧化，界面變性，吸附于容器或機(jī)械應(yīng)力所致。1652、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)溶液振搖可以導(dǎo)致聚集與沉2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的吸附蛋白質(zhì)和多肽吸附于容器、濾器或輸液系統(tǒng)材料的表面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液濃度較低時(shí)，由于吸附藥物損失相對(duì)就較高。

1662、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(2)蛋白質(zhì)的吸附442、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(3)蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)在受到一些物理因素或化學(xué)試劑影響會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化，破壞蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)有關(guān)氫鍵及其他弱鍵(二級(jí)結(jié)構(gòu)以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性的喪失(抗原性改變，生物功能喪失)同時(shí)還伴隨一些物化常數(shù)的變化。如發(fā)生溶解度的降低、旋光值改變、光吸收系數(shù)的增大、粘度改變、聚集，沉淀等。但蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)即肽鍵沒有被破壞,這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。1672、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性(3)蛋白質(zhì)的變性破壞蛋白質(zhì)2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的變性也可以說是從肽鏈的折疊（refolding)狀態(tài)變到伸展（unfolding)狀態(tài)。

天然蛋白質(zhì)在體內(nèi)條件下，具有呈現(xiàn)全部生物功能所需要的精確的構(gòu)象。變性作用是天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的松解，即由原來有規(guī)則，緊密結(jié)構(gòu)變成無規(guī)則，松散結(jié)構(gòu)。1682、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的變性也可以說是從肽鏈的2、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性變性可以分可逆變性和不可逆變性。除去變性因素，蛋白質(zhì)構(gòu)象可以恢復(fù)原狀的，叫可逆變性。鹽析1692、由非共價(jià)鍵引起的不穩(wěn)定性變性可以分可逆變性和不可逆變性影響蛋白質(zhì)變性的因素①溫度的影響：蛋白質(zhì)在50~60°C的溶液中，經(jīng)過一定時(shí)間，往往發(fā)生變性。有些蛋白質(zhì)熱變性是可逆的，有些是不可逆的。不可逆熱變性往往發(fā)生沉淀和聚集現(xiàn)象。一般來說，熱變性僅涉及非共價(jià)鍵的變化。170影響蛋白質(zhì)變性的因素48影響蛋白質(zhì)變性的因素②pH對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：大多數(shù)蛋白質(zhì)，僅在pH4-10的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，超過這個(gè)范圍，就發(fā)生變性，也有些蛋白質(zhì)只有當(dāng)pH<2時(shí)，才發(fā)生變性。171影響蛋白質(zhì)變性的因素②pH對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：49影響蛋白質(zhì)變性的因素③有機(jī)溶劑的影響：大多數(shù)蛋白質(zhì)水溶液在加入一定量的有機(jī)溶劑后蛋白質(zhì)就開始析出沉淀。脫水172影響蛋白質(zhì)變性的因素③有機(jī)溶劑的影響：脫水50影響蛋白質(zhì)變性的因素④鹽的影響：鹽對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的影響是很復(fù)雜的。蛋白質(zhì)水溶液中加入少量無機(jī)鹽會(huì)增加蛋白質(zhì)表面負(fù)荷，增強(qiáng)蛋與水的作用從而使蛋白質(zhì)在水中溶液度增大，這種現(xiàn)象稱為鹽溶（saltingin)。在高鹽濃度情況下，本來與蛋白質(zhì)結(jié)合的自由水與鹽解離產(chǎn)生的離子進(jìn)形配位，蛋白質(zhì)表面水層被破壞，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的相互作用增加而發(fā)生聚集，這種現(xiàn)象叫鹽析（saltingout)。173影響蛋白質(zhì)變性的因素④鹽的影響：鹽對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的影響是影響蛋白質(zhì)變性的因素⑤表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：長(zhǎng)鏈的脂肪酸（如月桂酸）或相應(yīng)的表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉）很容易與蛋白質(zhì)反應(yīng)，常常引起蛋白質(zhì)解離，在很低的濃度下，就能引起蛋白質(zhì)變化。174影響蛋白質(zhì)變性的因素⑤表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響：52蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法

一、液相色譜法液相色譜法是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的純度與穩(wěn)定性有力的工具。在蛋白質(zhì)分析中通常采用反相高壓液相色譜法RP-HPLC、離子交換色譜IEC與分子排阻色譜SEC。反相色譜是以非極性固定相與含水的極性流動(dòng)相為基礎(chǔ)的分析方法。應(yīng)用反相HPLC，由于有機(jī)溶劑，疏水的相互作用及分離時(shí)所用低pH值，會(huì)使蛋白質(zhì)變性。然而該方法對(duì)幾種蛋白質(zhì)特別有用，并被廣泛地用于胰島素制劑的質(zhì)量分析。175蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法一、液相色譜法5317654蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法二、光譜法通過對(duì)蛋白質(zhì)吸收、輻射、散射光的定量分析可以提供有價(jià)值的信息，了解蛋白質(zhì)的量、構(gòu)象和聚集傾向。用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)藥物的光譜方法有紫外可見吸收光譜UV、旋光色散ORD、圓二色譜CD、熒光、紅外IR和拉曼Raman光譜。紫外吸收常用于測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。光散射可用測(cè)定制劑中蛋白質(zhì)的聚集數(shù)量，散射強(qiáng)度是單位體積散射中心數(shù)的函數(shù)。177蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法二、光譜法55蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法三、電泳電泳技術(shù)是根據(jù)在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)在載體凝膠上產(chǎn)生特征性遷移，遷移率是所帶凈電荷和它的大小函數(shù)，以此來分離混合蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)的分析中廣泛使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳（SDS），等電點(diǎn)聚焦(isoclectricfocusing，IEF)和毛細(xì)管電泳（EC）法。SDS電泳用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞單位組成和分子量。EC優(yōu)點(diǎn)是：分辨率高、靈敏度高、分析時(shí)間短、易于自動(dòng)化。178蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法三、電泳56蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法四、生物活性測(cè)定與免疫測(cè)定生理活性檢測(cè)是利用體內(nèi)模型或體外組織或細(xì)胞對(duì)活性蛋白質(zhì)多肽的特異生物學(xué)反應(yīng)，通過劑量(或濃度)效應(yīng)曲線進(jìn)行定量（絕對(duì)量或比活性單位）。用理化方法代替生物活性測(cè)定時(shí)，需建立兩種方法之間的相關(guān)性。免疫測(cè)定優(yōu)點(diǎn)是可用于定量化學(xué)分析不能檢測(cè)的情況。179蛋白質(zhì)類藥物的評(píng)價(jià)方法四、生物活性測(cè)定與免疫測(cè)定57蛋白質(zhì)類藥物制劑的評(píng)價(jià)

1、制劑中藥物的含量測(cè)定；2、制劑中藥物的活性測(cè)定；3、制劑中藥物的體外釋藥速率測(cè)定；4、制劑的穩(wěn)定性研究（物理和化學(xué)穩(wěn)定性）；5、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究；6、刺激性和生物相容性研究。180蛋白質(zhì)類藥物制劑的評(píng)價(jià)1、制劑中藥物的含量測(cè)定；58生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

1．蛋白質(zhì)或多肽類藥物大多為內(nèi)源性物質(zhì)，臨床使用劑量小，藥理活性高，副作用小，很少有過敏反應(yīng)；2．蛋白質(zhì)或多肽類藥物穩(wěn)定性差，在酸堿環(huán)境或體內(nèi)酶存在下極易失活；3．蛋白質(zhì)或多肽類藥物分子量大，還時(shí)常以多聚體形式存在，很難透過胃腸道粘膜的上皮細(xì)胞層，故吸收很少，不能口服給藥，一般只有注射給藥一種途徑；4．蛋白質(zhì)或多肽類藥物體內(nèi)生物半衰期較短，從血中消除較快，因此在體內(nèi)的作用時(shí)間較短，往往不能充分發(fā)揮其作用。181生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)

1．蛋白質(zhì)或多肽類藥物大多為內(nèi)源性物質(zhì)，生物技術(shù)藥物給藥系統(tǒng)的研究開發(fā)（1）對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽類藥物的普通注射劑，關(guān)鍵是提高其穩(wěn)定性；（2）對(duì)于體內(nèi)生物半衰期較短的蛋白質(zhì)或多肽類藥物，需要研究其長(zhǎng)效制劑，以延長(zhǎng)作用時(shí)間；（3）對(duì)于需要長(zhǎng)期給藥的蛋白質(zhì)或多肽類藥物，要研究可減少給藥次數(shù)的新劑型；（4）研究開發(fā)生物技術(shù)藥物的非注射給藥新劑型，如鼻腔給藥系統(tǒng)、肺部給藥系統(tǒng)及