分子生物學(xué) 分子生物學(xué)研究法

一.重組DNA技術(shù)概論二.常見(jiàn)的DNA操作技術(shù)三.基因克隆技術(shù)(狹義)四.基因表達(dá)研究技術(shù)五.基因芯片及數(shù)據(jù)分析六.蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù)第一頁(yè)，共九十三頁(yè)。一.重組DNA技術(shù)概論第二頁(yè)，共九十三頁(yè)。二.常見(jiàn)的DNA操作技術(shù)2.1瓊脂糖凝膠電泳2.2SDS電泳2.3PCR技術(shù)2.4測(cè)序技術(shù)2.5雜交技術(shù)2.6ELISA技術(shù)2.7細(xì)菌轉(zhuǎn)化2.8cDNA文庫(kù)2.9SNP技術(shù)及應(yīng)用2.10基因打靶第三頁(yè)，共九十三頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳1、原理：2、用途：3、技術(shù)要點(diǎn)第四頁(yè)，共九十三頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳的原理

1.DNA電泳遷移：電荷效應(yīng)＋分子篩效益（1）DNA帶負(fù)電，電場(chǎng)中，向正極移動(dòng)；（2）決定移動(dòng)速度三因素：DNA大小，電荷數(shù)，構(gòu)型；

(3)線性DNA分子移動(dòng)速度與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比；（分子量越大，跑得越慢）

2、檢測(cè)原理：（1）溴化乙錠（EB）可插入雙鏈DNA分子中，在紫外光照射下，發(fā)射熒光。第五頁(yè)，共九十三頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳用途1.DNA分子量測(cè)定（距離－>分子量）2.基因，克隆的鑒定（通過(guò)1完成）3、不同長(zhǎng)度的基因片斷的分離4、DNA濃度的測(cè)定

（熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分離鑒定第六頁(yè)，共九十三頁(yè)。加標(biāo)準(zhǔn)分子量DNAMarker,測(cè)定分子量加標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，測(cè)定濃度第七頁(yè)，共九十三頁(yè)。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)要點(diǎn)1.不同濃度凝膠分辨DNA片段能力不一樣(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(擴(kuò)散)(2)高:不利于大片段的分辨(遷移不動(dòng))(3)一般選1.0%2.凝膠要用緩沖液配(TBE或TAE)3.EB強(qiáng)致癌，帶手套操作；4.agarose(瓊脂糖）－－－電泳

agar(含瓊脂糖和瓊脂膠）－－－平板培養(yǎng)基第八頁(yè)，共九十三頁(yè)。SDS電泳1、原理2、用途3、技術(shù)要點(diǎn)第九頁(yè)，共九十三頁(yè)。SDS電泳原理1.SDS(帶負(fù)電)和還原劑破壞蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí)SDS與蛋白定量結(jié)合,消除蛋白之間的電荷差異,使得蛋白的遷移率主要依賴分子量(分子小跑得快).2.不連續(xù)電泳:上層為濃縮膠,可將樣品壓縮到同一起跑線,下層為分離膠;可獲得更高的分辨率.3.考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色.第十頁(yè)，共九十三頁(yè)。第十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。第十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。SDS電泳用途1.蛋白分子量的測(cè)定2.蛋白濃度的測(cè)定3.蛋白的鑒定(通過(guò)1來(lái)實(shí)現(xiàn))第十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。SDS技術(shù)要點(diǎn)1.濃縮膠一般用5%,

分離膠:次高分子(10萬(wàn)-20萬(wàn))用7%,

低分子(1.4萬(wàn)－10萬(wàn)）用12％2、PAGE配制時(shí)帶手套，（Acr-Bis液體有積累性神經(jīng)毒，聚合后無(wú)毒)3.SDS－PAGE測(cè)定的是單體蛋白分子量；（多亞基不行）4、SDS－PAGE不適于：（1）電荷異常蛋白：組蛋白（＋電多）（2）構(gòu)象異常的蛋白（3）帶有較大輔基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。第十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。PCR技術(shù)1、原理2、應(yīng)用3、技術(shù)要點(diǎn)第十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。PCR技術(shù)原理循環(huán)過(guò)程(32次左右）1.解鏈：94℃,30s2.引物結(jié)合:？

℃，30s3.延伸：72℃，？Min

特點(diǎn)1.引物兩條，以2n指數(shù)擴(kuò)增（前20-25次），后面擴(kuò)增效率降低，30次以后，基本進(jìn)入平臺(tái)期。2.引物結(jié)合溫度？

℃一般為50-55℃，需要調(diào)整；3.延伸時(shí)間？Min需要調(diào)整，一般1kb/min.第十六頁(yè)，共九十三頁(yè)。PCR技術(shù)應(yīng)用1.基因檢測(cè)；2.基因的制備（包括基因的修飾）第十七頁(yè)，共九十三頁(yè)。PCR技術(shù)操作要點(diǎn)1.靈敏度高，防止污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性(帶手套，設(shè)立陰性，陽(yáng)性對(duì)照）；2.需要摸索結(jié)合溫度，提高擴(kuò)增的特異性。第十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。雜交技術(shù)1.Southernblot檢測(cè)DNA2.Northernblot檢測(cè)RNA3.Westernblot檢測(cè)蛋白第十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。Southernblot,Northernblot和Westernblot比較名稱檢測(cè)對(duì)象探針檢測(cè)原理處理過(guò)程用途SouthernblotDNA標(biāo)記單鏈核酸核酸復(fù)性中堿基配對(duì)專一性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因檢測(cè)（拷貝數(shù)）NorthernblotRNA標(biāo)記單鏈核酸核酸復(fù)性中堿基配對(duì)專一性變性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因表達(dá)的檢測(cè)（表達(dá)量）Westernblot蛋白抗體抗原－抗體特異性結(jié)合SDS后轉(zhuǎn)膜基因表達(dá)產(chǎn)物――蛋白的檢測(cè)ELISA原理和用途類似于Westernblot,但在酶標(biāo)板中操作，無(wú)需SDS轉(zhuǎn)膜，操作簡(jiǎn)單，可批量檢測(cè)，并可半定量測(cè)定。第二十頁(yè)，共九十三頁(yè)。Southernblot第二十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。Northernblot第二十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。Westernblot第二十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。雙脫氧法測(cè)序

(Dudeoxysequenceanalyses)雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測(cè)序1.原理：

Atkinson發(fā)現(xiàn)用DNApol合成DNA時(shí)如在反應(yīng)物中加入一定量的2`,3`ddTTP時(shí)，因ddT

的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger利用此原理建立了雙脫氧測(cè)序法。原理和加減法相似，但不再是加一種dNTP或減一種dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來(lái)終止聚合反應(yīng)。用此法測(cè)得G4含5577bp.第二十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。第二十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。第二十六頁(yè)，共九十三頁(yè)。第二十七頁(yè)，共九十三頁(yè)。2.1細(xì)菌轉(zhuǎn)化通常情況下，外源基因無(wú)法進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)；當(dāng)用電擊法，或CaCl2，或RuCl等方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源基因進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的活性較低，處理需溫柔。第二十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。2.2PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃第二十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。PCR第三十頁(yè)，共九十三頁(yè)。2.3cDNA文庫(kù)cDNA:

(1)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA.

(2)特點(diǎn):

A.穩(wěn)定;

B.無(wú)內(nèi)含子.二.cDNA文庫(kù):

(1)

代表了生物體某一器官或者組織mRNA中所含的全部或絕大部分遺傳信息.(2)特點(diǎn):

A.不同的生物,同一生物不同組織,同一組織不同發(fā)育時(shí)間或不同生理狀態(tài)下,cDNA文庫(kù)不同;B.建好的cDNA文庫(kù)的具體的信息未知,僅提供吊取相關(guān)目的基因的材料.C.每個(gè)克隆不一定是全長(zhǎng)基因第三十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。cDNA文庫(kù)建庫(kù)過(guò)程1.高質(zhì)量mRNA的制備;2.反轉(zhuǎn)錄生成cDNA3.與載體分子連接(噬菌體文庫(kù))4.轉(zhuǎn)染(噬菌體的包裝)第三十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。第三十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。說(shuō)明:引物oligodT,隨機(jī)引物R6(得到全長(zhǎng)cDNA)兩端可加上酶切接頭,便于克隆到載體上.合成時(shí),原料用甲基化的dCTP.防止酶切時(shí)損傷內(nèi)部序列.轉(zhuǎn)化效率要高,防止少量表達(dá)的mRNA未得到克隆.第三十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。2.4SNP技術(shù)及應(yīng)用Singlenucleotidepolymorphism單核苷酸多態(tài)性(標(biāo)記)是指同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。用途:(1)遺傳的分子標(biāo)記物種鑒定

(2)生物功能異常的基因標(biāo)記疾病的檢測(cè);第三十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。Singlenucleotidepolymorphism第三十六頁(yè)，共九十三頁(yè)。SNP的特征SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個(gè)堿基對(duì)就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SNP，估計(jì)整個(gè)人類基因組30億堿基中至少有300萬(wàn)個(gè)SNP。

SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（C—T，G—A），也可能是顛換。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生C—T的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。第三十七頁(yè)，共九十三頁(yè)。SNP的檢測(cè)方法單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：?jiǎn)捂淒NA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當(dāng)某一個(gè)堿基發(fā)生突變時(shí)，便會(huì)直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移率會(huì)發(fā)生改變。第三十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。第三十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。熒光共振能量傳遞

(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)

供者受者

探針5‘3‘Taqman法分子信標(biāo)(molecularbeacon)法

第四十頁(yè)，共九十三頁(yè)。高效液相色譜ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質(zhì)譜分析法DNA芯片技術(shù)（DNAchip）

第四十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。SNP數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心德國(guó)的HGBAS網(wǎng)站

日本JST的數(shù)據(jù)庫(kù)

第四十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。2.5基因打靶(genetargeting)通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能。(反向遺傳學(xué))基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代第四十三頁(yè)，共九十三頁(yè)?；虼虬械谋貍錀l件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽(yáng)性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：?jiǎn)渭儼捳畈《?herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)第四十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種第四十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。第四十六頁(yè)，共九十三頁(yè)?；蚯贸齂nockout1.完全基因敲除可能會(huì)致死.2.條件型基因敲除Cre/LoxP,FLP/FRT第四十七頁(yè)，共九十三頁(yè)?；蚯贸娜秉c(diǎn)能將基因與表型(生物功能)聯(lián)系起來(lái),但不能提供具體的作用機(jī)制;對(duì)多基因決定的表型無(wú)法將其聯(lián)系全部找出;操作復(fù)雜,成本高.第四十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。三.基因克隆技術(shù)(狹義)

獲取目的基因的技術(shù)1.RACE技術(shù)2.cDNA差示顯示法3.基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)4.酵母雙雜交法5.酵母單雜交系統(tǒng)6.基因的圖位克隆法第四十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。3.1RACE技術(shù)RapidamplificationofcDNAends已知基因一端序列,快速獲取另一端序列.5’RACE(獲取5’序列)3’RACE(獲取3’序列)需要合成引物接頭(單鏈DNA),用RNAligase將基因(RNA)與引物(DNA)連接.第五十頁(yè)，共九十三頁(yè)。5’RACE第五十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。3’RACE(非mRNA擴(kuò)增)合成兩條互補(bǔ)的引物,序列任意.及一條序列特異的引物互補(bǔ)引物中一條5’標(biāo)記Pi,通過(guò)RNAligase將其與RNA連接.第五十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。第五十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。3.2cDNA差示顯示法(cDNA-RDA)僅知道生理功能,性狀,對(duì)基因序列一無(wú)所知.獲得該相關(guān)基因的方法.原理:A.樣本(sample)與對(duì)照(control)mRNAs被轉(zhuǎn)錄成cDNA,酶切加可PCR擴(kuò)增接頭,擴(kuò)增后除去接頭,只有樣本被加上新接頭(可PCR擴(kuò)增).B.樣本(ss)與過(guò)量對(duì)照(cc)雜交后,PCR擴(kuò)增.sc被線形擴(kuò)增;ss被指數(shù)擴(kuò)增;CC不被擴(kuò)增.第五十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。第五十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。3.3基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)(Gateway克隆技術(shù))1.不需要酶切,連接;2.利用TOPO反應(yīng),將PCR產(chǎn)物克隆到Entry載體;再通過(guò)LR反應(yīng),將基因定點(diǎn),定向重組到表達(dá)載體.3.上游引物5’端需要引入CACC序列.第五十六頁(yè)，共九十三頁(yè)。第五十七頁(yè)，共九十三頁(yè)。第五十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。第五十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。3.4酵母雙雜交法

（蛋白－蛋白相互作用）1.篩選與已知蛋白相互作用的蛋白基因2.真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子基本結(jié)構(gòu)一般有2個(gè)功能域（functionaldomain）DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain）－－DBD轉(zhuǎn)錄激活域（transcription-activatingdomain）--AD(許多激活子還有二聚體化域,有的還有受體結(jié)合域)第六十頁(yè)，共九十三頁(yè)。第六十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。第六十二頁(yè)，共九十三頁(yè)?！矮C物”為一個(gè)庫(kù)；２．將不同的“誘餌”克隆后，捕獲不同的“獵物”第六十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。３.5酵母單雜交

（蛋白核酸相互作用）用于鑒定與特定順式作用元件（DNA序列）作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合域．或反之．第六十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。第六十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。３.6基因的圖位克隆法

目的：克隆具有某種表型的未知基因的方法．原理：略第六十六頁(yè)，共九十三頁(yè)。四.基因表達(dá)研究技術(shù)１.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE)2.RNA選擇性剪切機(jī)制3.原位雜交技術(shù)４.定點(diǎn)突變技術(shù)５．RNAi技術(shù)第六十七頁(yè)，共九十三頁(yè)。4.１.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE)

以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息；理論依據(jù)：９－１０堿基的核酸片段可代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異序列（序列標(biāo)簽）某序列標(biāo)簽占總標(biāo)簽數(shù)的比例對(duì)應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率．第六十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。第六十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。4.2.RNA選擇性剪切機(jī)制RT-PCR擴(kuò)增不同組織特異基因電泳分析片段大小是否一致．第七十頁(yè)，共九十三頁(yè)。４.3.原位雜交技術(shù)通過(guò)標(biāo)記的核酸探針,在組織,細(xì)胞,間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段.(1)RNA原位雜交組織切片中,該基因的表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)在細(xì)胞水平上作出定性定量分析.-{區(qū)別免疫組化(蛋白)}(2)染色體原位雜交eg.熒光原位雜交(FISH),確定DNA序列染色體上的位置.

第七十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。第七十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。4.3定點(diǎn)突變1.研究某個(gè)氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),功能的影響;2.改造DNA調(diào)控序列,修飾表達(dá)載體,引入新的酶切位點(diǎn).第七十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。TaKaRamutationkit第七十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。4.4RNAi技術(shù)RNAi是指dsRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)同源基因表達(dá)阻斷的生物學(xué)現(xiàn)象。在線蟲、昆蟲、哺乳動(dòng)物、植物和真菌中廣泛存在。是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）的重要機(jī)制。細(xì)胞利用RNAi抵御病毒和其它外源核酸的侵染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。第七十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。雙鏈RNA先被切割酶Dicer切割成21－23個(gè)堿基對(duì)的siRNA中間體，觸發(fā)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。在ATP的存在下，復(fù)合物中雙鏈RNA被螺旋酶解旋，形成單鏈RNA（ssRNA）的活化體。一旦單鏈RNA同目的mRNA配對(duì)，核酸酶被活化，在復(fù)合物內(nèi)部降解mRNA。第七十六頁(yè)，共九十三頁(yè)。RNAi的應(yīng)用

基因功能的研究：RNAi作為一種反相遺傳工具，可通過(guò)抑制特定基因的表達(dá)來(lái)研究該基因功能?；蛑委煟嚎捎糜谝种茀⑴c病程的開始或發(fā)展的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，例如參與病毒或寄生蟲與宿主相互作用、病原體的復(fù)制、癌癥的發(fā)生及細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。第七十七頁(yè)，共九十三頁(yè)。RNAi的缺點(diǎn)

A.在哺乳動(dòng)物中，存在非特異性效應(yīng)的dsRNA觸發(fā)途徑,如（1）dsRNA依賴的蛋白激酶(PKR)和干擾素途徑，該途徑引起對(duì)蛋白合成和凋亡的全身性的抑制；(2)dsRNA誘導(dǎo)的2′–5′多聚腺苷酸的合成，該途徑導(dǎo)致非特異性的RNA酶即RnaseL的活化。但PKR不能被少于30個(gè)核苷的dsRNA活化，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)盡量避免。但非特異性RNAi效應(yīng)有時(shí)還是存在，而且不可預(yù)測(cè)。對(duì)有的高表達(dá)的基因，RNAi可能會(huì)無(wú)效或效果不明顯。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的RNAi效果比較短暫（約1周左右）。對(duì)一個(gè)基因設(shè)計(jì)的不同片段的RNAi可能效果差異很大，篩選的工作量繁重。有時(shí)細(xì)胞導(dǎo)入效率低下，也增加了技術(shù)實(shí)現(xiàn)的難度。第七十八頁(yè)，共九十三頁(yè)。4.5生物芯片技術(shù)

生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，它主要是指通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。第七十九頁(yè)，共九十三頁(yè)。主要特點(diǎn)

高通量、微型化和自動(dòng)化。芯片上集成的成千上萬(wàn)的密集排列的分子微陣列，能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍。但目前的成本較高，重復(fù)性較差。第八十頁(yè)，共九十三頁(yè)。生物芯片分類

(1)用途

1.樣品制備芯片2.生化反應(yīng)芯片（如PCR芯片）3.檢測(cè)芯片（如基因芯片，蛋白芯片）4.芯片實(shí)驗(yàn)室（是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)分析的整個(gè)過(guò)程集約化形成微型分析系統(tǒng)）。第八十一頁(yè)，共九十三頁(yè)。生物芯片分類

(2)制造技術(shù)微孔板/微陣列芯片DNA微點(diǎn)陣(陣列)芯片此類芯片的共同特點(diǎn)是,將多達(dá)成千上萬(wàn)種ＤＮＡ探針?lè)肿影凑找欢樞蚺帕性诠滔嗷?多數(shù)采用玻片)上組成密集的微點(diǎn)陣(Microarray)或陣列(Array),利用核酸雜交原理對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)分析。蛋白質(zhì)微點(diǎn)陣(陣列)芯片將大量純化的蛋白分子按一定的排列規(guī)律連接于玻片上,形成密集的微點(diǎn)陣(陣列),進(jìn)行高通量的生物活性檢測(cè)、蛋白質(zhì)靶標(biāo)分子(蛋白質(zhì)、抗體、ＤＮＡ、ＲＮＡ)相互作用研究。微流路芯片流過(guò)式芯片微流路(Microfluidic)芯片的共同特點(diǎn)是采用半導(dǎo)體微加工技術(shù)和(或)微電子工藝在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)(由儲(chǔ)液池、微反應(yīng)室、微通道、微電極、微電路中的一種或幾種組成),加載生物樣品和反應(yīng)液后,在壓力泵或電場(chǎng)的作用下形成微流路,于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng),達(dá)到對(duì)樣品的高通量快速分析的目的。微電子芯片PCR芯片毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管層析芯片多功能集成芯片蛋白質(zhì)分析微流路芯片第八十二頁(yè)，共九十三頁(yè)。六.蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù)1.雙向電泳2.質(zhì)譜技術(shù)3.蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)4.EMSA5.噬菌體展示技術(shù)6.免疫共沉淀技術(shù)7.蛋白質(zhì)磷酸化分析第八十三頁(yè)，共九十三頁(yè)。6.1雙向電泳

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的主要分離方法，同時(shí)能分離成百上千種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在第一向根據(jù)電荷的不同（等電聚焦），第二向根據(jù)分子量的不同進(jìn)行分離（SDS）。分離后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，根據(jù)實(shí)際分析情況，分別進(jìn)行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色。掃描后用相關(guān)軟件（PDQUEST等）進(jìn)行圖譜分析，分析差別點(diǎn)等。雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，還可以進(jìn)一步分析差別點(diǎn)蛋白的特性。第八十四頁(yè)，共九十三頁(yè)。第八十五頁(yè)，共九十三頁(yè)。6.2MS質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m