第3章熒光分析法課件

第3章熒光分析法3.1概述3.2熒光光譜的基本原理3.3定量分析方法3.4熒光分析技術及應用第3章熒光分析法3.1概述13.1概述熒光和磷光的發(fā)展簡史基本概念3.1概述熒光和磷光的發(fā)展簡史216世紀：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；1575年：Monardes-植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液-天藍色熒光；1852年：Stokes闡明熒光發(fā)射機制(奎寧和葉綠素的熒光)；1905年：Wood發(fā)現(xiàn)氣體分子的共振熒光；1926年:Gaviola直接測定了熒光壽命；1923年：熒光X射線光譜；1964年：原子熒光光譜分析的建立；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應用；15世紀:磷光被發(fā)現(xiàn)(重晶石在強烈陽光下的發(fā)光)1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs將磷光分析用于定量分析及多組分混合物分析；1963年：廣泛用于血液及尿液中痕量藥物及農藥殘留量分析。3.1概述>>

3.1.1熒光和磷光的發(fā)展簡史16世紀：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；3.1概述>>

333.1概述>>

3.1.2.基本概念處于基態(tài)的分子吸收能量被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)釋放能量返回至基態(tài)。如果通過碰撞以熱能或動能的形式釋放能量回到基態(tài)，稱為無輻射躍遷；如果是以輻射(發(fā)射光子)的形式回到基態(tài)，此種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。常見的光致發(fā)光包括熒光和磷光。熒光光譜法：基于化合物的熒光測量而建立起來的分析方法，稱為熒光光譜法。特點：靈敏度高，檢測限通常在ppb級(熒光10-7-10-9mg/mL)；發(fā)光參數(shù)多，可進行動力學分析；分析線性范圍比吸收光譜法寬；選擇性比吸收光譜法好。3.1概述>>

3.1.2.基本概念處于基態(tài)的分子吸收能量43.2基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3.2.3發(fā)光參數(shù)3.2.4影響物質發(fā)光的因素3.2基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生53.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級與電子能級的多重態(tài)熒光和磷光的產(chǎn)生3.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級63.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級與電子能級的多重態(tài)基態(tài)：處于基態(tài)的分子，由于成對電子填充在能量最低的各軌道中，能量最低最穩(wěn)定，所處的能態(tài)稱為基線單重態(tài)(圖示A狀態(tài))。單重態(tài)：當基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)—激發(fā)單重態(tài)(圖示B狀態(tài))。三重態(tài)：如果某電子在躍遷過程中，發(fā)生自旋方向改變，則分子具有兩個自旋不配對、自旋方向平行的電子，即分子處于激發(fā)三重態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)略低(圖示C狀態(tài))。3.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級與7光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉移失活非輻射失活熒光磷光振動馳豫內轉換外轉換系間竄躍3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉移失活非輻射失活熒光磷8復習電磁波譜：光的波粒二象性γ射線X射線紫外光可見光紅外光微波無線電波λ/nm

0.01104007605×1058×105MHz

波長頻率短高長低3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生復習電磁波譜：光的波粒二象性γ射線X射線紫外光可見光紅外光微9吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內轉換振動馳豫系間竄躍振動馳豫外轉換基態(tài)3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內轉換振動馳豫系間竄躍振動馳103.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生輻射躍遷－發(fā)光失活熒光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線態(tài)S1的最低振動能級回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)T1的最低振動能級回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。波長關系：激發(fā)光＜熒光＜磷光。3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.113.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生無輻射失活振動弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動能級轉至較低振動能級的過程，其效率較高內轉換：當兩個電子能級非常接近以致其振動能級有重疊時，電子由高能級回到低能級的過程。外轉換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑、溶質分子之間發(fā)生相互碰撞而失去能量的過程。系間竄越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.12任何熒光化合物都具有激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光或磷光光譜)兩種特征光譜3.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光化合物都具有激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光或磷133.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個特點：⑴斯托克斯位移，波長：熒光＞激發(fā)光；⑵熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像對稱；⑶熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長無關。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜3.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光143.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖11-4蒽(乙醇)的激發(fā)光譜和不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜/nm3.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖11153.2基本原理>>

3.2.3發(fā)光參數(shù)熒光壽命(τf)：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最大熒光強度的一半所需的時間稱為熒光壽命(10-8～10-10s)。熒光物質受到一個極短時間的脈沖光激發(fā)后，熒光強度從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化，可用指數(shù)衰減定律表示：Ft=F0e-Kt。F0、Ft

：開始時和t時的熒光強度，K為衰減常數(shù)。熒光產(chǎn)率()：又稱為熒光量子產(chǎn)率、熒光效率。3.2基本原理>>

3.2.3發(fā)光參數(shù)熒光壽命(τf)163.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素1.內部因素：分子結構對熒光效率的影響2.外部因素：外界條件對熒光效率的影響3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素1.內17內部因素：分子結構對熒光效率的影響。物質分子有強的紫外吸收和一定的熒光產(chǎn)率是發(fā)射熒光的兩個必備條件。分子結構中有π→π﹡躍遷（K帶強吸收）或n→π﹡躍遷（R帶弱吸收）。⑴長共軛結構：分子中必須具有大的共軛π鍵結構。共軛度越大，發(fā)射波長長移，發(fā)光強度增加。⑵分子的剛性和共平面性：具有剛性平面性結構的分子熒光量子產(chǎn)率高。⑶取代基的影響：給電子取代基使熒光強度增大；而吸電子取代基則使熒光強度降低。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素內部因素：分子結構對熒光效率的影響。物質分子有強的紫外吸收和183.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素長共軛結構示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36維生素Aλex＝327nm；λem＝510nm3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1193.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素剛性和共平面結構示例形成絡合物后，如果分子的剛性和共平面性增強，可使熒光增強。聯(lián)苯f＝0.2芴f＝1.08-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1203.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順反異構體：反式分子有熒光，而順式分子沒有熒光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有強烈熒光，而順式無熒光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸鹽②1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽f＝0.75f＝0.033.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1213.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素取代基作用第一類取代基是給電子基團，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長長移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二類取代基是吸電子基團，會妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(鹵素原子序數(shù)↑，熒光效率↓)等。第三類取代基對電子共軛體系作用較小，對熒光的影響不明顯。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>122表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式λF/nm相對熒光強度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚陰離子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正離子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-0表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式λF/nm相對熒光強23外部因素：外界條件對熒光強度的影響⑴溫度的影響：溫度降低會使熒光強度增大；溫度升高熒光強度減小。⑵溶劑的影響：溶劑極性增加有時會使熒光強度增加，熒光波長長移；溶劑的黏度減小，熒光強度減弱。⑶pH的影響：對于弱酸或弱堿性熒光物質，溶液的pH值改變，影響其解離平衡，使熒光強度發(fā)生變化。⑷熒光熄滅的影響：熒光物質與熒光熄滅劑相互作用，引起熒光強度降低。⑸散射光的干擾：瑞利光和拉曼光。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素外部因素：外界條件對熒光強度的影響3.2基本原理>>

3243.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素pH值影響熒光強度示例

pH值：<27～12>13存在形式：離子分子離子有無熒光：無藍色熒光無3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2253.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素熄滅劑：鹵素離子、重金屬離子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子與分子發(fā)生彈性碰撞時，僅改變光子運動方向，不發(fā)生能量交換，這種散射光稱為瑞利光。特點：波長與入射光相同。拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子與物質分子發(fā)生非彈性碰撞時，不僅改變光子運動方向，而且發(fā)生能量交換，這種散射光稱為拉曼光。特點：當光子失去部分能量時，波長比入射光長，干擾最大；當光子多得到部分能量時，波長比入射光短。消除方法：選擇適當?shù)募ぐl(fā)光波長可消除拉曼光干擾。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2263.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素例如：硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>227320448448360320350400350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4強度(a)強度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm圖11-6硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素320448448360320350400350激發(fā)350n283.3定量分析方法3.3.1熒光強度與濃度的關系3.3.2定量分析方法3.3定量分析方法3.3.1熒光強度與濃度的關系29熒光是物質吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強度(F)與熒光物質吸收光的程度以及發(fā)射熒光的能力有關。測試熒光的方向與激發(fā)光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。熒光分析定量依據(jù)：熒光強度F與濃度c成線性關系。3.3定量分析方法>>

3.3.1熒光強度與濃度的關系熒光是物質吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強度(F)與熒光物質吸收30標準曲線法用已知量的標準物質經(jīng)過和試樣相同的處理之后，配制一系列標準溶液，測定該標準系列的熒光強度，繪制F(縱)-c(橫)標準曲線，然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度，從標準曲線求出待測熒光物質的含量。比例法若標準曲線通過原點，在線性范圍內可采用比例法(只需1個標準溶液)；若標準曲線不通過原點，則應扣除空白溶液的熒光強度后再計算：多組分混合物的熒光分析3.3定量分析方法>>

3.3.2定量分析方法標準曲線法用已知量的標準物質經(jīng)過和試樣相同的處理之后，配制313.4熒光分析技術及應用3.4.1熒光儀器簡介3.4.2應用與示例3.4.3熒光分析技術3.4熒光分析技術及應用3.4.1熒光儀器簡介32熒光分光光度計方框圖光源第一單色器第二單色器檢測器放大記錄器I0IF樣品吸收池1．光電熒光計：基本淘汰。2．熒光分光光度計：能繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。第一單色器(激發(fā)單色器)選擇激發(fā)光波長(＞250nm)第二單色器(熒光單色器)與激發(fā)光入射方向垂直，選擇熒光波長，可提高方法的選擇性和準確度。3.4熒光分析技術及應用>>

3.4.1熒光儀器簡介熒光分光光度計方框圖光源第一第二檢測器放大I0IF樣品1．光33圖11－8熒光儀器的光路示意圖A光電熒光計第一濾光片第二濾光片電表光電管樣品池狹縫汞弧燈樣品池檢測器光源B熒光分光光度計3.4熒光分析技術及應用>>

3.4.1熒光儀器簡介圖11－8熒光儀器的光路示意圖A光電熒光計第一濾光片343.4熒光分析技術及應用>>

3.4.2應用與示例1.無機化合物的熒光分析熒光法靈敏度高、選擇性好，可用于痕量分析，但是能發(fā)生熒光的化學體系不多，這是熒光法的應用特點。無機物通過與熒光試劑(如下圖)作用生成熒光螯合物而進行熒光分析，非過渡金屬離子的熒光螯合物較多，熒光試劑具有兩個(或以上)與MZ+形成螯合物的電子給予體官能團的芳香結構。參閱P291.表11－2無機離子的熒光測定法。能引起熒光熄滅(猝滅)化合物，可用熒光猝滅法測定。SO3NaN=NOHHOON8-羥基喹啉石榴茜素R3.4熒光分析技術及應用>>

3.4.2應用與示例1353.4熒光分析技術及應用>>

3.4.2應用與示例2.有機化合物的熒光分析(1)熒光胺(2)鄰苯二甲醛(3)丹酰氯熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺類形成的衍生物有高強度熒光3.4熒光分析技術及應用>>

3.4.2應用與示例236

3.4熒光分析技術及應用>>

3.4.4熒光分析新技術1.時間分辨熒光分析2.同步熒光分析3.膠束增敏熒光分析4.磷光分析法5.化學發(fā)光和生物發(fā)光分析(課后閱讀教材)3.4熒光分析技術及應用>>

3.4.4熒光分37課后作業(yè)思考題：1、2(課后復習)、3(第一問)習題：2、3課后作業(yè)思考題：1、2(課后復習)、3(第一問)38第3章熒光分析法3.1概述3.2熒光光譜的基本原理3.3定量分析方法3.4熒光分析技術及應用第3章熒光分析法3.1概述393.1概述熒光和磷光的發(fā)展簡史基本概念3.1概述熒光和磷光的發(fā)展簡史4016世紀：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；1575年：Monardes-植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液-天藍色熒光；1852年：Stokes闡明熒光發(fā)射機制(奎寧和葉綠素的熒光)；1905年：Wood發(fā)現(xiàn)氣體分子的共振熒光；1926年:Gaviola直接測定了熒光壽命；1923年：熒光X射線光譜；1964年：原子熒光光譜分析的建立；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應用；15世紀:磷光被發(fā)現(xiàn)(重晶石在強烈陽光下的發(fā)光)1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs將磷光分析用于定量分析及多組分混合物分析；1963年：廣泛用于血液及尿液中痕量藥物及農藥殘留量分析。3.1概述>>

3.1.1熒光和磷光的發(fā)展簡史16世紀：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；3.1概述>>

3413.1概述>>

3.1.2.基本概念處于基態(tài)的分子吸收能量被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)釋放能量返回至基態(tài)。如果通過碰撞以熱能或動能的形式釋放能量回到基態(tài)，稱為無輻射躍遷；如果是以輻射(發(fā)射光子)的形式回到基態(tài)，此種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。常見的光致發(fā)光包括熒光和磷光。熒光光譜法：基于化合物的熒光測量而建立起來的分析方法，稱為熒光光譜法。特點：靈敏度高，檢測限通常在ppb級(熒光10-7-10-9mg/mL)；發(fā)光參數(shù)多，可進行動力學分析；分析線性范圍比吸收光譜法寬；選擇性比吸收光譜法好。3.1概述>>

3.1.2.基本概念處于基態(tài)的分子吸收能量423.2基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3.2.3發(fā)光參數(shù)3.2.4影響物質發(fā)光的因素3.2基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生433.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級與電子能級的多重態(tài)熒光和磷光的產(chǎn)生3.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級443.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級與電子能級的多重態(tài)基態(tài)：處于基態(tài)的分子，由于成對電子填充在能量最低的各軌道中，能量最低最穩(wěn)定，所處的能態(tài)稱為基線單重態(tài)(圖示A狀態(tài))。單重態(tài)：當基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)—激發(fā)單重態(tài)(圖示B狀態(tài))。三重態(tài)：如果某電子在躍遷過程中，發(fā)生自旋方向改變，則分子具有兩個自旋不配對、自旋方向平行的電子，即分子處于激發(fā)三重態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)略低(圖示C狀態(tài))。3.2基本原理>>

3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生分子能級與45光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉移失活非輻射失活熒光磷光振動馳豫內轉換外轉換系間竄躍3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉移失活非輻射失活熒光磷46復習電磁波譜：光的波粒二象性γ射線X射線紫外光可見光紅外光微波無線電波λ/nm

0.01104007605×1058×105MHz

波長頻率短高長低3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生復習電磁波譜：光的波粒二象性γ射線X射線紫外光可見光紅外光微47吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內轉換振動馳豫系間竄躍振動馳豫外轉換基態(tài)3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內轉換振動馳豫系間竄躍振動馳483.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生輻射躍遷－發(fā)光失活熒光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線態(tài)S1的最低振動能級回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)T1的最低振動能級回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。波長關系：激發(fā)光＜熒光＜磷光。3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.493.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.熒光和磷光的產(chǎn)生無輻射失活振動弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動能級轉至較低振動能級的過程，其效率較高內轉換：當兩個電子能級非常接近以致其振動能級有重疊時，電子由高能級回到低能級的過程。外轉換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑、溶質分子之間發(fā)生相互碰撞而失去能量的過程。系間竄越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。3.2基本原理>>3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生>>

2.50任何熒光化合物都具有激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光或磷光光譜)兩種特征光譜3.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光化合物都具有激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光或磷513.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個特點：⑴斯托克斯位移，波長：熒光＞激發(fā)光；⑵熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像對稱；⑶熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長無關。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜3.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光523.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖11-4蒽(乙醇)的激發(fā)光譜和不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜/nm3.2基本原理>>

3.2.2激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖11533.2基本原理>>

3.2.3發(fā)光參數(shù)熒光壽命(τf)：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最大熒光強度的一半所需的時間稱為熒光壽命(10-8～10-10s)。熒光物質受到一個極短時間的脈沖光激發(fā)后，熒光強度從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化，可用指數(shù)衰減定律表示：Ft=F0e-Kt。F0、Ft

：開始時和t時的熒光強度，K為衰減常數(shù)。熒光產(chǎn)率()：又稱為熒光量子產(chǎn)率、熒光效率。3.2基本原理>>

3.2.3發(fā)光參數(shù)熒光壽命(τf)543.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素1.內部因素：分子結構對熒光效率的影響2.外部因素：外界條件對熒光效率的影響3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素1.內55內部因素：分子結構對熒光效率的影響。物質分子有強的紫外吸收和一定的熒光產(chǎn)率是發(fā)射熒光的兩個必備條件。分子結構中有π→π﹡躍遷（K帶強吸收）或n→π﹡躍遷（R帶弱吸收）。⑴長共軛結構：分子中必須具有大的共軛π鍵結構。共軛度越大，發(fā)射波長長移，發(fā)光強度增加。⑵分子的剛性和共平面性：具有剛性平面性結構的分子熒光量子產(chǎn)率高。⑶取代基的影響：給電子取代基使熒光強度增大；而吸電子取代基則使熒光強度降低。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素內部因素：分子結構對熒光效率的影響。物質分子有強的紫外吸收和563.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素長共軛結構示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36維生素Aλex＝327nm；λem＝510nm3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1573.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素剛性和共平面結構示例形成絡合物后，如果分子的剛性和共平面性增強，可使熒光增強。聯(lián)苯f＝0.2芴f＝1.08-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1583.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順反異構體：反式分子有熒光，而順式分子沒有熒光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有強烈熒光，而順式無熒光。①1-二甲胺基萘-7-磺酸鹽②1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽f＝0.75f＝0.033.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1593.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>1.內部因素取代基作用第一類取代基是給電子基團，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長長移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二類取代基是吸電子基團，會妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(鹵素原子序數(shù)↑，熒光效率↓)等。第三類取代基對電子共軛體系作用較小，對熒光的影響不明顯。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>160表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式λF/nm相對熒光強度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚陰離子C6H5O-310-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正離子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-0表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式λF/nm相對熒光強61外部因素：外界條件對熒光強度的影響⑴溫度的影響：溫度降低會使熒光強度增大；溫度升高熒光強度減小。⑵溶劑的影響：溶劑極性增加有時會使熒光強度增加，熒光波長長移；溶劑的黏度減小，熒光強度減弱。⑶pH的影響：對于弱酸或弱堿性熒光物質，溶液的pH值改變，影響其解離平衡，使熒光強度發(fā)生變化。⑷熒光熄滅的影響：熒光物質與熒光熄滅劑相互作用，引起熒光強度降低。⑸散射光的干擾：瑞利光和拉曼光。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素外部因素：外界條件對熒光強度的影響3.2基本原理>>

3623.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素pH值影響熒光強度示例

pH值：<27～12>13存在形式：離子分子離子有無熒光：無藍色熒光無3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2633.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素熄滅劑：鹵素離子、重金屬離子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleighscatteringlight)：光子與分子發(fā)生彈性碰撞時，僅改變光子運動方向，不發(fā)生能量交換，這種散射光稱為瑞利光。特點：波長與入射光相同。拉曼光(Ramanscatteringlight)：光子與物質分子發(fā)生非彈性碰撞時，不僅改變光子運動方向，而且發(fā)生能量交換，這種散射光稱為拉曼光。特點：當光子失去部分能量時，波長比入射光長，干擾最大；當光子多得到部分能量時，波長比入射光短。消除方法：選擇適當?shù)募ぐl(fā)光波長可消除拉曼光干擾。3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2643.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素例如：硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>265320448448360320350400350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4強度(a)強度(b)λ/nmλ/nmλ/nmλ/nm圖11-6硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜3.2基本原理>>

3.2.4影響物質發(fā)光的因素>>2.外部因素320448448360320350400350激發(fā)350n663.3定量分析方法3.3.1熒光強度與濃度的關系3.3.2定量分析方法3.3定量分析方法3.3.1熒光強度與濃度的關系67熒光是物質吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強度(F)與熒光物質吸收光的程度以及發(fā)射熒光的能力有關。測試熒光的方向與激