細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件：細(xì)胞組分的分級分離

細(xì)胞組分的分級分離主要過程：勻漿、差速離心、分析。勻漿：低溫條件下，在等滲介質(zhì)中，制成各種細(xì)胞器的混合液。差速離心：在均一介質(zhì)中，由低速到高速逐級離心，使細(xì)胞器按照比重從大到小逐漸沉降的方法。分析：用細(xì)胞化學(xué)和生物化學(xué)方法進(jìn)行定量和定性檢測。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞分級分離(cellfractionation)：細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小等都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同介質(zhì)和不同轉(zhuǎn)速的離心，將細(xì)胞各種組分分級分離出來。離心技術(shù)：是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10-25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500Kg。顆粒直徑離心機(jī)機(jī)型轉(zhuǎn)速103nm低速離心機(jī)8000轉(zhuǎn)/分102~104nm高速離心機(jī)8000~25000轉(zhuǎn)/分102nm超速離心機(jī)25000~80000轉(zhuǎn)/分分離方法差速離心分離法：利用不同離心速度產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開。密度梯度離心分離法：將要分離的細(xì)胞組分鋪放在密度逐漸增加的介質(zhì)表面，在超速離心力的作用下，不同的組分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降帶。特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。差速離心Differentialcentrifugation差速離心法differentialcentrifugation勻漿離心1000G20分鐘細(xì)胞核離心15000G120分鐘離心0.26%脫氧膽酸鈉15000G20分鐘核糖體等離心20分鐘10000G微粒體線粒體等小白鼠脫臼處死，迅速開腹，取出肝臟，剪成大塊，沖洗一半肝組織，0.25M蔗糖洗3次，加3ml0.25M蔗糖，剪碎勻漿（5-8次），6層紗布過濾至10ml離心管取出1ml至dorf管（A），3000rpm，10min上清入dorf管(B)沉淀加入1ml1M蔗糖，懸3800rpm,10min棄上清，沉淀加少量0.25M蔗糖，懸涂片1涂片2涂片312000rpm,20min棄上清，沉淀加1ml0.25M蔗糖，懸12000rpm,20min沉淀上清加0.25M蔗糖，懸涂片5涂片4涂片1，2，3(晾干）95%乙醇固定5min，晾干甲基綠-哌羅寧染色20min，沖洗丙酮分色，沾2-3次沖洗，晾干，觀察1.染核酸涂片4，5（晾干）詹納斯綠B染色15min沖洗，晾干，觀察2.染線粒體作業(yè)：1.比較分離細(xì)胞核的3張涂片有何不同，為什么？2.比較分離線粒體的2張涂片有何不同，為什么？涂片1，2，3(晾干）95%乙醇固定5min，晾干甲基綠-哌羅寧染色20min，沖洗涂片1，2，3(晾干）丙酮分色，沾2-3次沖洗，晾干，觀察95%乙醇固定5min，晾干涂片1，2，3(晾干）

線粒體正常情況下一般呈圓形，饑餓時(shí)，缺乏供能營養(yǎng)物質(zhì)，線粒體會數(shù)目減少，大量的嵴會消失，會使線粒體形狀變得細(xì)長，因而易于觀察。線粒體含量較多；長度適合觀察，約5μm；肝臟較軟，易于破碎，并且適于快速提取，因而利于保持線粒體活性。細(xì)胞器沉降先后順序先后是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。詹納斯綠B可專一性地對線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使詹納斯綠B染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色