丙種球蛋白的制備(電泳)

項目三丙種球蛋白的制備任務1丙種球蛋白分離制備方案的制定生藥13112013040808侯雅媛丙種球蛋白類藥物丙種球蛋白

（1）概念

中文簡稱：“丙球”英文名稱：γ-globulin、gammaglobulin

【別名】免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙種球蛋白，丙種球蛋白，靜脈注射用人免疫球蛋白（pH4）丙種球蛋白預防傳染性肝炎，預防麻疹等病毒性疾病感染，治療先天性丙種球蛋白缺乏癥，與抗生素合并使用，可提高對某些嚴重細菌性和病毒性疾病感染的療效。注：由于人血中的免疫球蛋白大多數(shù)為丙種球蛋白（γ-球蛋白），有時丙種球蛋白也被混稱為“免疫球蛋白”(immunoglobulin)。

（2）藥理作用注射丙種球蛋白是一種被動免疫療法。它是把免疫球蛋白內(nèi)含有的大量抗體輸給受者，使之從低或無免疫狀態(tài)很快達到暫時免疫保護狀態(tài)。由于抗體與抗原相互作用起到直接中和毒素與殺死細菌和病毒。因此免疫球蛋白制品對預防細菌、病毒性感染有一定的作用。制備丙種球蛋白的方法丙種球蛋白的兩種分離制備的方法①層析法（如：SephadexG-50）定義:是一種利用混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。②電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳)定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽離子或陰離子，在外加電場中以不同的遷移速度向電極移動，而達到分離目的的分析方法。（3）適應癥丙種球蛋白是血液中一種蛋白質(zhì)，它通常來源于許多人獻的血液，常被用來防止和治療感染，對慢性疲勞癥有顯著的改善作用。適用于預防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治療先生性丙種球蛋白缺乏癥，可提高對某些嚴重細菌性和病毒性疾病感染的療效。sephadexG-50

Sephadex是由葡聚糖通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒。

Sephadex凝膠按交聯(lián)度不同，用SephadexG加一個數(shù)字來區(qū)別型號,數(shù)字越小,表示介質(zhì)交聯(lián)度,分級范圍越小，反之亦然。電泳作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。作用原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

垂直平板：

1、多個樣品在同一塊凝膠上，電泳條件一致－－便于利用各種鑒定方法，直接比較各種樣品區(qū)帶，保證結(jié)果的準確可靠

2、可以進行雙向電泳

3、電泳時熱量容易消散，凝膠結(jié)果便于照相和易于制成干膠

圓盤電泳：

1、缺點是由于聚合效應，凝膠的長度和直徑有細微差別，即使同一樣品在兩個凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結(jié)果也會不同

2、但是研究工作中還會用到圓盤電泳，例如測定放射性標記的樣品測定蛋白質(zhì)的生物活性；測定蛋白質(zhì)分離的最適pH，凝膠濃度；雙向電泳中第一相的分離。

聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：

凝膠透明，有彈性，機械性能好；化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應；對pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用；樣品用量少，靈敏度可達10-6g;凝膠孔徑可調(diào)節(jié)；分辨率高。凝膠系統(tǒng)的分類1、連續(xù)性凝膠電泳連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。

2、不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應。垂直電泳原理陰極電泳用水溶性樹脂是一種陽離子型化合物，用有機酸中和，在水中溶解后，以分子和離子平衡狀態(tài)存在于直流電場中，兩極產(chǎn)生電位差，離子發(fā)生定向移動，陽離子向陰極移動，并在陰極表面上得到電子沉積于陰極表面，而陰離子向陽極移動，在陽極上放出電子氧化成酸。這就是電泳涂裝的基本原理。它是一個非常復雜的電化學反應，其中包括：電解、電泳、電沉積、電滲四個同時進行的過程。實驗步驟（1）溶液的配制

a貯液為49.5%T,3%Cb貯液為49.5%T,6%C。膠緩沖液為3molTris0.3g/LSDS用HCl調(diào)pH值至8145

陽極緩沖液為0.2molTris

用HCl調(diào)pH值至8.9。陰極緩沖液為0.1molTris0.1molTricine0.13g/LSDS用HCl

調(diào)pH值至8125。樣品緩沖液為3molTris(pH8.45)0.8gSDS0.3molDTT

少許溴酚藍,定容至10ml。膠的制備:按文獻分別配制分離膠、間隙膠和濃縮膠,依次灌膠。(2)樣品處理去除血清白蛋白后的樣品與2倍體積U9緩沖液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT)混勻,400～600r/min冰浴振蕩30min變性。取變性后樣品與樣品緩沖液等體積混勻,60℃水浴加熱5min。(3)電泳內(nèi)槽裝陰極緩沖液,外槽用陽極緩沖液恒壓電泳,先40V約1.5h,當樣品進入分離膠時,電壓升至60V約1.5h。(4)染色和脫色電泳結(jié)束時,用雙蒸水把膠面洗凈。置于染色液(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考馬斯亮藍G250)中,50～60r/min,振蕩染色1h。然后用雙蒸水洗凈膠面,轉(zhuǎn)至雙蒸水脫色,1h。更換雙蒸水2~3ci直到背景清晰。盤狀電泳

圓盤電泳是帶電粒子(膠體顆粒、離子等)在電場的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象.廣泛應用于生物大分子的分離和鑒定它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子的凝膠物。它同時兼有分子篩和電泳效應。當樣品通過凝膠進行電泳時，便可以根據(jù)其樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動出不同的區(qū)帶。由于聚丙烯酰胺凝膠化學性質(zhì)較瓊脂穩(wěn)定，很少帶有側(cè)基，在電泳過程中，吸附作用與電滲作用均小，所以該技術的分辨率均高于其它瓊脂電泳技術

圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.9(2)濃縮膠pH6.9

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應

1、濃縮效應每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。有效電荷多的，泳動的快，反之則慢。

2、電荷效應分子量大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時，受凝膠阻滯的程度不同，表現(xiàn)出不同的遷移率。3、分子篩效應樣品在分離之前，首先在濃縮膠得到濃縮，變成狹窄（很?。┑臉悠穾В狗直媛蚀蟠筇岣?。分離膠的制備濃縮膠的制備待分離樣品的準備加樣電泳脫色染色實驗方法材料與試劑1．20％單體母液

丙烯酰胺（Aorylamide）19.60g

雙丙烯酰胺（N，N—methylene

Bisaerylamide）0.40g

H2O加至100.00ml2．pH8.0Tris—EDTA緩沖液

Tris（三羥基甲基氨基甲烷）6.05g

EDTA（乙二胺四乙酸）1.17g

H2O加至100.00ml3．B—三甲基胺基丙腈液（B—DMPN）

（Dimethylaminopropionitrile），原液于4℃冰箱保存4．10％過硫酸銨溶液

過硫酸銨

0.50g

H2O加至5.00ml

現(xiàn)用現(xiàn)配或配后低溫保存不超過一周。5．0.025Mol/LpH9.0硼酸緩沖液

硼酸

3.948g

硼砂30.512g

H2O加至1000.0ml

使用時取該液90ml加H2O至1440ml，即為電泳液。五、操作步驟

1、分離膠的制備：（1）、將清潔、無破碎干燥的小玻管一端（同學們應該挑選一下比較平的那頭），用膠布貼封后，朝下垂直放入有機玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm處作一記號。（2）、用自動取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi)壁小心準確加入7.0cm高。（3）、凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）、將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進行聚合反應，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。2、濃縮膠的制備：（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的液體，并用吸水紙吸去未倒凈的液體（但不能觸及膠面）然后先小心用濃縮膠貯液洗滌凝膠表面1-2次，再小心加入該濃縮膠貯液1.5cm高。（2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表面。大約也在20-40分鐘后，待濃縮膠出現(xiàn)乳白色時，表明膠已聚合完畢。3、加樣：取一根上次做好的凝膠小玻管用吸水紙輕輕吸去濃縮膠表面上的水層，然后用微量注射器加10ul測試樣品溶液。4、裝置凝膠管：將加好樣品的凝膠管的加樣端（上端），插入上電泳槽孔中，然后將已插滿凝膠管的上電泳槽放入加有電極溶液的下電泳槽內(nèi)。此時凝膠玻管下端管口易產(chǎn)生氣泡，可通過輕輕擺動凝膠玻管以去除氣泡，插入上電泳槽的玻管上端，用滴管輕輕滴滿電極溶液，以免產(chǎn)生氣泡，最后將上電泳槽裝滿電極液。5、接通電源：接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，上槽電極接負極，下槽電極接正極，穩(wěn)壓300V電泳開始時，電流應由小逐步加大至額定值。這時的電流大約每管3.0-5.0mA

電流，直至指示劑前沿到達凝膠管底部約0.5cm處，（大約需時2小時），停止電泳。確定電泳結(jié)束時，不應將溴酚蘭跑出凝膠管，以防止標準分子量中的最低分子量蛋白質(zhì)也跑出凝膠管。6、練習取出玻管內(nèi)的凝膠：將一支帶有長針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，一邊開始壓水，一邊同時使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前進，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝離，這樣依靠水流的壓力和滑潤力，使玻管內(nèi)壁與凝膠分離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內(nèi)，此時可以將凝膠柱壓出玻管。7、取出玻管內(nèi)的凝膠8、凝膠染色：

將取出的凝膠柱，放入一合適干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入適量染色液，于搖床上進行振搖染色30分鐘，完畢，回收染色液，用清水洗凝膠柱2-3遍。在染色的同時，凝膠中蛋白質(zhì)區(qū)帶亦被固定。9、凝膠脫色：在培養(yǎng)皿（或試管）內(nèi)加入適量脫色液于搖床上進行振搖（2小時/次，需3次）脫色多次直至色帶完全清晰為止。10、繪圖：最后根據(jù)染色所出現(xiàn)的帶數(shù)和位置進行繪圖，以確定被分析樣品的組分。另一種方法是通過密度掃描儀掃出各組分的峰形位置，這樣不僅能確定組分，而且能比較出各組分所占比例（如果要計算出各分離區(qū)帶的相對遷移率，可參考教課書）。注意事項樣品的離子強度、pH值盡可能與濃縮膠溶液相同，如含大量鹽類時，應透析除鹽。最適合的樣品蛋白量是10μg～100μg，加入樣品量要少，血清樣品3μl～5μl，免疫球蛋白樣品可加15μl～20μl。凝膠柱面應平整，操作過程切勿產(chǎn)生氣泡，否則電泳區(qū)帶不整齊。電泳中電流應保持