蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的NMR研究

蛋白質(zhì)分子溶液結(jié)構(gòu)與功能的NMR研究部分蛋白質(zhì)的NMR研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化蛋白質(zhì)與靶分子（靶蛋白、核酸、配體小分子、藥物）的相互作用蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)特性蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制和折疊路徑

一.

確定生物分子的溶液三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子：天然態(tài)蛋白質(zhì)、突變體蛋白質(zhì)、部分折疊態(tài)蛋白質(zhì)、非天然態(tài)蛋白質(zhì)。核酸分子：DNA、RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物、蛋白質(zhì)與DNA或RNA復(fù)合物，蛋白質(zhì)與藥物小分子復(fù)合物、蛋白質(zhì)與拮抗劑小分子復(fù)合物。蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)確定的技術(shù)基礎(chǔ)高場(chǎng)核磁共振波譜儀的發(fā)展

500MHz600MHz750MHz800MHz900MHz多維（二維、三維、四維）核磁共振實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展

※梯度場(chǎng)多維NMR脈沖程序※TROSY類型多維NMR脈沖程序※取向介質(zhì)中蛋白質(zhì)殘余偶極相互作用檢測(cè)方法處理和解析多維核磁共振數(shù)據(jù)的軟件開發(fā)研究蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)確定的重要性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的重要部分蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)可在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上研究蛋白質(zhì)發(fā)揮生理功能的活性部位可在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上研究蛋白質(zhì)內(nèi)運(yùn)動(dòng)與功能特性的關(guān)系蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)特性與結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)二.天然態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)－功能研究蛋白質(zhì)與藥物小分子、拮抗劑等結(jié)合的活性部位確定蛋白質(zhì)發(fā)揮生理功能時(shí)活性部位的構(gòu)象變化蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)特性與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)折疊/去折疊蛋白質(zhì)穩(wěn)定性蛋白質(zhì)在水溶液中多構(gòu)象的平衡蛋白質(zhì)肽鍵的順反異構(gòu)與功能關(guān)系蛋白質(zhì)中的水分子

Research:3DsolutionstructureNOE,3JN,3J,Hydrogen-bondbindingsiteNOE,,3JN,3J,Hydrogen-bondconformationalchangeNOE,,3JN,3J,Hydrogen-bondfolding/unfoldingNOE,,H,3JNbackbonedynamics

15N-T1,15N-T2,15N-NOE,H/Dexchangeprotein-proteininteractionNOE,,Hprotein-nucleicacidinteractionNOE,,H三.蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用的研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用研究蛋白質(zhì)與拮抗劑和底物小分子相互作用靶蛋白質(zhì)與藥物小分子相互作用Research:conformationofthecomplexconformationofproteinconformationofsubstrate,peptide,----bindingsiteonproteinbindinginterfaceMethodology:isotopelabelingofproteinisotopelabelingofnucleicacidisotopelabelingofpeptidehetero-nuclearfilteringNMRexperimentsdockingbyusingsoftwarepackage四.非天然態(tài)蛋白質(zhì)的研究蛋白質(zhì)片段的溶液構(gòu)象變性劑作用下蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)特性變化脲變性、酸變性蛋白質(zhì)的特性與殘存結(jié)構(gòu)五.膜蛋白質(zhì)分子的研究膜蛋白質(zhì)與膜脂分子相互作用Studyofnon-nativeproteinResearch:refoldingprocessofproteindynamicpropertiesofnon-nativeproteinresidualstructuresofproteinProblems:extensiveoverlapofpeaksreducingtheNOEsaveragedoveranensembleofconformationsbroadlinewidthsMethodology:isotopelabelingofproteinsite-directedmutagenesishydrogen-exchangepulselabeling多維NMR研究蛋白質(zhì)溶液三維空間結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系NMR方法是確定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的唯一有效手段確定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的重要性：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的重要部分蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)是研究蛋白質(zhì)發(fā)揮生理功能的活性部位的必要條件可在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上研究蛋白質(zhì)內(nèi)運(yùn)動(dòng)與功能特性的關(guān)系蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)特性與結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)(1)多維NMR確定蛋白質(zhì)分子溶液

三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)☆

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息20種氨基酸：氨基酸由H、C、N、O、S等元素組成，提供鏈長(zhǎng)和鍵角信息。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈中氨基酸殘基序列。提供蛋白質(zhì)的氨基酸組分，排列順序以及各類原子數(shù)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子不同肽段主鏈原子在三維空間中不同的排列規(guī)律性，表現(xiàn)為α-螺旋，β-片層、轉(zhuǎn)角和環(huán)等基本結(jié)構(gòu)單元。在不同二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的肽段中，肽鍵的二面角不同，主鏈氫原子間的相對(duì)位置或距離不同。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元在三維空間中的相對(duì)排列，提供原子間的遠(yuǎn)程距離信息?！?/p>

核磁共振波譜信息化學(xué)位移：氨基酸的H、C原子的核磁共振峰在α-螺旋與β鏈中的化學(xué)位移分布呈現(xiàn)規(guī)律性的差異。J-偶合：反映了肽鍵的二面角(φ，ψ，χ)大小。α-螺旋和β片層二級(jí)結(jié)構(gòu)單元中的J-偶合數(shù)值范圍不同。NOE：核自旋之間的偶極－偶極相互作用產(chǎn)生的交叉馳豫導(dǎo)致NOE現(xiàn)象，在兩個(gè)核之間的距離小于5?時(shí)可以觀察到NOE信號(hào)?！?/p>

波譜信息與結(jié)構(gòu)信息的對(duì)應(yīng)化學(xué)位移可以直接用作判別形成α螺旋、β片層的氨基酸殘基肽段的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。J－耦合可用以直接確定肽鍵的二面角φ，ψ，χ。NOE信號(hào)強(qiáng)度與兩個(gè)核之間的距離六次方成反比。由NOE強(qiáng)度可以確定兩個(gè)原子之間的距離，在α螺旋與β片層中氫原子之間的NOE強(qiáng)度呈現(xiàn)不同的特征?？捎靡跃_地測(cè)定α螺旋與β片層。由主鏈原子間遠(yuǎn)程相互作用提供的NOE可以精確地測(cè)定蛋白質(zhì)分子的三級(jí)折疊。

☆多維NMR確定蛋白質(zhì)分子溶液三維結(jié)構(gòu)的流程圖NMR研究蛋白質(zhì)中存在的問題同核(1H-1H)NMR在確定蛋白質(zhì)溶液的結(jié)構(gòu)方面，可以獲得小于100個(gè)殘基的小蛋白的溶液結(jié)構(gòu)，在準(zhǔn)確度方面類似于2.0-2.5?

分辨率的晶體結(jié)構(gòu)

隨著蛋白質(zhì)分子量的進(jìn)一步提高，由于化學(xué)位移的重疊或簡(jiǎn)并，使得在(1H-1H)NMR方法中所使用的自旋系統(tǒng)識(shí)別和序列識(shí)別方法不再完全有效其次是隨著分子量增加，譜線變寬，因而使得較難利用建立在小的同核耦合(耦合常數(shù)12Hz)之上的一些位移相關(guān)實(shí)驗(yàn)a.a.殘基數(shù)1H核數(shù)13C核數(shù)15N核數(shù)Ala14424214Thr10404010Ser520155Lys2323013823His3/418183/4Glu12726012Pro642300Ile545255Asp832328Gly10302010Val945459Met424204Tyr742497Gln648306Phe321213Arg540305Leu12/11847212/11Asn636246Trp19111Cys0000149920722143金黃色葡萄球菌核酸酶9201Hresonancesin~10ppm72213Cresonancesin~185ppm14315Nresonancesin~220ppm小蛋白和大蛋白二維同核NMR譜的比較

BmP02(28個(gè)殘基)ADR6(115個(gè)殘基)部分NOESY譜增加NMR波譜的維數(shù)從二維擴(kuò)展到四維可提高譜圖分辨率

二維――→

三維―――→

四維

1H/13C/15N多維核磁共振波譜示意圖單鍵異核耦合用于磁化強(qiáng)度傳遞磁化矢量之間的傳遞是建立不同自旋之間聯(lián)系的方式，也是多維核磁共振方法的基礎(chǔ)。溶液核磁共振方法中常見的傳遞方式，一是通過(guò)跨鍵連接，也就是標(biāo)量耦合進(jìn)行傳遞，如同核傳遞，異核傳遞；二是通過(guò)跨空間相互作用。對(duì)于1H的同核傳遞通過(guò)3JHH，一般取1/(2*3JHH)，約30~80ms。

對(duì)于脂肪鏈13C同核傳遞通過(guò)1JCC

傳遞，一般取3/(4*1JCC)，約10~20ms。對(duì)于1H-13C的異核傳遞通過(guò)1JCH，一般取0.8/1JCH，約6.7ms。蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定同位素(13C,15N)標(biāo)記核自旋自然豐度(%)1H1/299.98D10.01513C1/21.1112C0

15N1/20.3714N199.63(2)

蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備需要對(duì)白質(zhì)分子進(jìn)行穩(wěn)定同位素(13C,15N)標(biāo)記for

protein

of

M.W.upto20kDa[50%2H]labeling[95%ul15N]labeling[98%ul13C]labeling[95%ul15N,98%ul13C]labeling

forproteinofM.W.>40kDaorhigher[50%2H,95%ul15N,98%ul13C]labeling

(3)

基本的多維NMR實(shí)驗(yàn)Multi-dimensionalNMRpulseprogram:

forbackboneresonanceassignmentsforside-chainresonanceassignmentsforNOEmeasurementsforJ-couplingconstantmeasurementsforH/Dexchangeexperimentsfor15Nrelaxationexperiments三維異核實(shí)驗(yàn)脈沖程序：?用于氨基酸殘基序列(主鏈)指認(rèn)的脈沖程序3D1H-15N-13CHNCA,HNCO,HN(CA)CO,HN(CO)CA,HN(CA)HA,HCACO,HCA(CO)N?用于氨基酸殘基的側(cè)鏈指認(rèn)的脈沖程序3D1H-15N-13CCBCA(CO)NH,HNCACB,HBHA(CBCACO)NH,CC(CO)NH3D1H-13CHCCH-COSY,HCCH-TOCSY

CBCA(CO)NH脈沖程序:頂部是磁化矢量傳遞路徑，緊挨其下的I3,I2等對(duì)應(yīng)于不同的磁性核。=10；=y；1=y；2

=x,-x＋頻率分辨（TPPI或者States-TPPI）；3=x；4=x；5=2(x),2(-x)；

rec=x,2(-x),x。

(4)

三維NMR波譜分析☆共振峰指認(rèn)

共振譜峰分布范圍1H：～10ppm；13C：～185ppm；15N：～220ppm兩種指認(rèn)策略：

三維異核波譜譜峰指認(rèn)(基于J耦合的共振峰指認(rèn)):

☆首先完成氨基酸序列(主鏈)指認(rèn)☆然后進(jìn)行氨基酸殘基的側(cè)鏈(自旋系統(tǒng))指認(rèn)SNase的HNCA譜SNase的HNCA和HNCO波譜Ssh10bCBCA(CO)NH/HNCACB譜K64-K68條帶圖。從左到右，每個(gè)殘基的CBCA(CO)NH和HNCACB譜圖依次相鄰。HNCACB譜上淺色的峰是負(fù)峰。

Ssh10bHNCO/HN(CA)CO譜K64-K68條帶圖。從左到右，每個(gè)殘基的HNCO譜和HN(CA)CO譜依次相鄰。

Ssh10b的HBHA(CO)NH和HBHANH實(shí)驗(yàn)，S79－G82條帶圖。從左到右，每個(gè)殘基的HBHA(CO)NH和HBHANH譜圖依次相鄰。標(biāo)的是1H，標(biāo)的是1H。在譜上，1H和1H符號(hào)相反。

Ssh10b殘基I76的CC(CO)NH和HCCH-TOCSY譜。（A）CC(CO)NH實(shí)驗(yàn)的15N平面；（B）HCCH-TOCSY實(shí)驗(yàn)I76的側(cè)鏈13C各個(gè)對(duì)應(yīng)的1H-1H平面。

☆NOE共振峰指認(rèn)1H-15NNOESY-HSQC蛋白質(zhì)中常見二級(jí)結(jié)構(gòu)單元典型的NOE相關(guān)性Characteristicsofsecondarystructuralelements(1)-helixstrongdNN(i,i+1)NOEs(continuousstretch)strongdN(i,i)anddN(i+1,i)NOEsmediumdN(i,i+3)NOEsdNN(i,i+2)NOEsd(i,i+3)NOEsweakorabsentdN(i,i+1)NOEs(2)Anti-parallel–pleatedsheet

strongNOEs:dN(i,i+1)mediumNOEs:dNN(i-1,j+1)dNN(i+1,j-1)dN(i,j+1)dN(j,i+1)d(i,j)weakorabsentNOEs:dNN(i,i+1)Anti-parallel–pleatedsheet圖例(3)Parallel–pleatedsheetstrongNOEs:dN(i,i+1)mediumNOEs:dN(i,j)ordN(j,i)weakorabsentNOEs:dNN(i,i+1)Nod(i,j);dNN(i-1,j+1);dNN(i+1,j-1)NOEs(4)TurnsReverseturnII:strongNOEs:dN(2,3)&dNN(3,4)weakNOEs:dN(1,2)&dN(3,4)somedN(i,i+2)&dNN(i,i+2)NOEsrequireaGlyatposition3small3JNcouplingconstant

ReverseturnI:strongdNN(2,3)&dNN(3,4)NOEsweakdNN(1,2),dN(2,3)&dN(3,4)NOEssomedN(i,i+2)&dNN(i,i+2)NOEsHalfturn:

strongdN(2,3)&dN(3,4)NOEsweakdN(1,2)&dNN(3,4)NOEssomedN(i,i+2)NOEsnodNN(i,i+2)NOEs-helix

Anti-parallel–pleatedsheetAnti-parallel–pleatedsheet&Reverseturn

☆確定J-耦合常數(shù)

加WATERGATE水峰壓制的HNHA實(shí)驗(yàn)脈沖序列。其中1=5.3ms，2=T/2=13.4ms。1H通道標(biāo)2的脈沖（2msSEDUCE-1）用于水峰倒返，并且結(jié)合在延時(shí)1之內(nèi)。

應(yīng)該盡可能短，以減小弛豫引起的信號(hào)損失。相循環(huán)為：1＝x,x,-x,-x＋t2間接維頻率區(qū)分（TPPI或者States-TPPI），2＝x，3＝x＋t1間接維頻率區(qū)分（TPPI或States-TPPI），4＝x,y，rec＝x,-x,-x,x,y,-y,-y,y。

HNHA實(shí)驗(yàn)的15N平面。1H的峰在譜圖上是負(fù)峰。☆獲得弛豫參數(shù)現(xiàn)有譜儀的磁場(chǎng)強(qiáng)度下主要是偶極弛豫起作用

這里J稱為譜密度函數(shù)，同分子運(yùn)動(dòng)方式及快慢有關(guān)SNase三個(gè)片段的R1,R2和1H-15NNOE

R2來(lái)源于ns時(shí)間尺度的分子轉(zhuǎn)動(dòng)和ms-s時(shí)間尺度的構(gòu)象交換☆確定化學(xué)交換

Ssh10b異核相關(guān)縱向弛豫/化學(xué)交換實(shí)驗(yàn)☆殘余偶極耦合常數(shù)確定(5)

確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

☆二級(jí)結(jié)構(gòu)確定

§化學(xué)位移指數(shù)

(Chemicalshiftindex,CSI)方法

§基于NOE,二面角,氫鍵信息☆確定三級(jí)結(jié)構(gòu)§基于NOE,二面角,氫鍵等距離約束進(jìn)行結(jié)構(gòu)計(jì)算

理論上n(n-1)/2對(duì)1H間的距離確定了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(n為蛋白質(zhì)含有的1H數(shù))

以金黃色葡萄球菌酶（149個(gè)氨基酸）為例，1H對(duì)數(shù)目為422,740。以金黃色葡萄球菌酶（149個(gè)酸）為例，1H對(duì)數(shù)目為422，740。1.NOE約束以特定的已知參考距離rref及其NOE強(qiáng)度Vref為參照，按下式進(jìn)行NOE強(qiáng)度到距離的轉(zhuǎn)換

常用參考距離如下：-CH2-的兩同碳1H之間的距離：1.78?芳環(huán)上相鄰1H（1Hδ，1Hε）距離：2.48?α-Helix結(jié)構(gòu)單元的1HNi-1HNi+1：2.80?β-sheet上的1Hαi-1HNi+1：2.20?NOE通常以半定量方式:強(qiáng),中,弱(強(qiáng)：2.7；中：3.3；弱：5.0)分類作為距離約束上限2.

二面角約束

各類3J-偶合常數(shù)對(duì)應(yīng)的Karplus公式參數(shù)3J()=Acos2+Bcos+C3J-偶合常數(shù)與二面角通過(guò)Karplus關(guān)系式聯(lián)系3J-偶合還可直接作為約束引入結(jié)構(gòu)計(jì)算,在結(jié)構(gòu)計(jì)算程序的目標(biāo)方程中加入下項(xiàng)：KJ是權(quán)重因子，3Jexp

值是實(shí)驗(yàn)測(cè)得的偶合常數(shù)，3Jcalc值是根據(jù)扭轉(zhuǎn)角按Karplus關(guān)系式計(jì)算出的理論偶合常數(shù)。

3.

取向約束殘余偶極偶合（RDC）正比于磁場(chǎng)強(qiáng)度的平方，表現(xiàn)為直接鍵連原子間的單鍵標(biāo)量偶合引起的裂分有小的場(chǎng)依賴性改變?？赏ㄟ^(guò)準(zhǔn)確測(cè)量在不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的1J偶合常數(shù)獲得RDC信息。殘余偶極偶合約束給出的是分子內(nèi)一對(duì)耦合的磁性核（比如15N-1H，13C-1H，15N-13C'）之間的矢量相對(duì)于整個(gè)分子某個(gè)固定軸的相對(duì)取向，它給出真正的長(zhǎng)程約束信息。4.

氫鍵約束H-鍵可通過(guò)1H交換實(shí)驗(yàn)和/或跨H-鍵偶合實(shí)驗(yàn)來(lái)確定H-鍵以類似于NOE的距離約束方式引入結(jié)構(gòu)計(jì)算，1H

－受體的距離的典型值為：1.8-2.0?，受體－1H直接共價(jià)結(jié)合的原子的距離為2.7-3.0?，后者起到限制H-鍵鍵角作用。5.結(jié)構(gòu)計(jì)算在笛卡兒空間，每個(gè)原子都獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，共價(jià)結(jié)構(gòu)必須用力場(chǎng)勢(shì)能來(lái)鞏固；在扭轉(zhuǎn)角空間，共價(jià)結(jié)構(gòu)被固定在理想值，并無(wú)影響共價(jià)結(jié)構(gòu)參數(shù)的自由度。依賴于所用結(jié)構(gòu)計(jì)算算法，特殊共價(jià)鍵如二硫鍵，環(huán)肽鍵必須用距離約束來(lái)維持。實(shí)踐上，首先從經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)及氨基酸序列計(jì)算出隨機(jī)的折疊起始結(jié)構(gòu)，然后計(jì)算機(jī)嘗試折疊該結(jié)構(gòu)使之滿足實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的要求，通過(guò)引入勢(shì)能概念，建立目標(biāo)方程來(lái)衡量構(gòu)象與約束集的吻合程度，將結(jié)構(gòu)計(jì)算轉(zhuǎn)化為使目標(biāo)方程最小化。目前應(yīng)用最廣泛的是基于模擬退火算法。笛卡兒空間的分子動(dòng)力學(xué)模擬退火這種算法通過(guò)數(shù)字求解牛頓運(yùn)動(dòng)方程來(lái)獲得分子體系的軌跡,以各原子的笛卡兒坐標(biāo)為自由度。計(jì)算程序是Xplor及它的后續(xù)版CNS(Brungeretal.,1998)。由n個(gè)位置ri，質(zhì)量mi的粒子構(gòu)成的體系的經(jīng)典動(dòng)力學(xué)服從牛頓運(yùn)動(dòng)方程：力Fi由勢(shì)能方程Epot及笛卡兒坐標(biāo)按下式給出：模擬退火使用簡(jiǎn)化的勢(shì)能方程，包括維持共價(jià)結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)勢(shì)能項(xiàng)如鍵長(zhǎng)，鍵角，二面角，手性，平面性，替代Lennard－Jones和靜電非鍵相互作用的簡(jiǎn)化排斥勢(shì)，以及實(shí)驗(yàn)約束勢(shì)能項(xiàng)，例如Xplor使用以下力場(chǎng)：扭轉(zhuǎn)角空間分子動(dòng)力學(xué)Dyana所用的快速扭轉(zhuǎn)角動(dòng)力學(xué)的核心思想是鏈?zhǔn)椒肿尤绲鞍祝怂?，可以很自然地表示成由n+1個(gè)彼此之間有n個(gè)可旋轉(zhuǎn)共價(jià)鍵連接的剛體組成的樹狀結(jié)構(gòu)，每個(gè)剛體由一個(gè)或多個(gè)原子構(gòu)成。樹結(jié)構(gòu)的基點(diǎn)常為多肽鏈的N端，“葉子”終點(diǎn)是側(cè)鏈末端和肽鏈C端。自由度是n個(gè)扭轉(zhuǎn)角，構(gòu)象由所有的扭轉(zhuǎn)角確定。目前流行的計(jì)算程序是DYANA。笛卡兒空間與扭轉(zhuǎn)角空間分子動(dòng)力學(xué)比較☆結(jié)構(gòu)分析一般包含兩方面的內(nèi)容：（1）考察計(jì)算出的分子坐標(biāo)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的吻合程度；計(jì)算程序如CNS、DYANA都會(huì)在計(jì)算出結(jié)構(gòu)的同時(shí)給出能量及約束違規(guī)報(bào)告，通過(guò)對(duì)約束違規(guī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一違規(guī)在系綜的大部分結(jié)構(gòu)甚至全部結(jié)構(gòu)中都出現(xiàn)的話，應(yīng)仔細(xì)檢查該違規(guī)對(duì)應(yīng)的指認(rèn)和峰積分是否有錯(cuò)誤。（2）考察計(jì)算結(jié)果的各種結(jié)構(gòu)幾何特性與對(duì)應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)允許值之間的吻合程度；經(jīng)驗(yàn)允許值可由理論計(jì)算或從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)、核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（NDB）、劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（CSD）統(tǒng)計(jì)衍生得來(lái)。常用的分析軟件有MOLMOL、AQUA、PROCHECK－NMR、WHATIF、PROSA等。金黃色葡萄球菌酶30個(gè)結(jié)構(gòu)的疊加金黃色葡萄球菌酶140片段結(jié)構(gòu)的疊加☆影響蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)正確測(cè)定的因素NMR波譜中NOE交叉峰指認(rèn)的正確性被指認(rèn)的NOE交叉峰的數(shù)量長(zhǎng)程N(yùn)OE交叉峰正確指認(rèn)的數(shù)量NOE交叉峰強(qiáng)度測(cè)定的正確性蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與功能1.幾個(gè)蛋白質(zhì)的NMR三維結(jié)構(gòu)金黃色葡萄球菌酶(SNase)蛇毒蛋白CobrotoxinII蛇毒蛋白CobrotoxinII結(jié)構(gòu)疊加圖人白血病細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白質(zhì)(PDCD5)人源PDCD5基因編碼蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并且在細(xì)胞凋亡過(guò)程中快速地由細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核中．人翻譯控制的腫瘤蛋白(TCTP)TCTP蛋白與腫瘤相關(guān)，在癌細(xì)胞中通常含量增加，而在腫瘤回復(fù)中被強(qiáng)烈下調(diào)，是一個(gè)新的抗凋亡蛋白．有180個(gè)a.a．人胎兒肝臟新基因(c6orf115)編碼的蛋白質(zhì)

從人胎兒肝臟中克隆出來(lái)新基因編碼的蛋白質(zhì)，它有81個(gè)氨基酸，動(dòng)植物里均保守存在，功能未知。結(jié)構(gòu)顯示它是個(gè)wingedhelixfold。這種折疊一般存在于轉(zhuǎn)錄因子中，具有DNA結(jié)合的活性。

嗜熱古菌核酸結(jié)合蛋白Ssh10b的NOE分布圖示

Ssh10b溶液三維結(jié)構(gòu)2.金黃色葡萄球菌酶體外折疊的研究主要的研究片段：SNase20(1-20)SNase28(1-28)SNase36(1-36)SNase79(1-79)SNase102(1-102)SNase110(1-110)SNase121(1-121)SNase135(1-135)SNase137(1-137)SNase139(1-139)SNase140(1-140)SNase141(1-141)G88W110G88W121V66W110V66W121對(duì)SNase110(1-110殘基)片段及其G88W和V66W突變體(G88W110、V66W110)的折疊研究

G88W110

V66W110

SNase110SNase110(1-110殘基)，SNase121(1-121基)，SNase135(1-135殘基)片段的折疊路徑研究

TwoFoldingpathways：Thickarrow:FoldingpathwayenergeticallymorefavorableforSNasefragmentsThinarrow:FoldingpathwaydisadvantageenergeticallyforSNasefragmentsSNase的β-與-亞結(jié)構(gòu)域片段(SNase121與SNase3)復(fù)合體的溶液三維結(jié)構(gòu)和相互作用機(jī)制的研究SNase121在復(fù)合體中的HSQC譜SNase121的HSQC譜可以看到SNase121在復(fù)合體中的譜峰分布與SNase的HSQC譜近。

SNase3的構(gòu)象:

在復(fù)合體中的HSQC譜在水溶液中的HSQC譜可以看到SNase3在復(fù)合物中已具有一定的構(gòu)象。SNase*－DNA復(fù)合物的NMR研究在復(fù)合物中SNase*的HSQC譜SNase的HSQC譜3.

凋亡相關(guān)蛋白PDCD5的研究通過(guò)化學(xué)位移和弛豫參數(shù)對(duì)難以解析結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(凋亡相關(guān)蛋白PDCD5)進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征鑒定N端核心結(jié)構(gòu)C端4.Ssh10b與核酸相互作用溫度依賴性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Ssh10b在核磁譜圖上呈現(xiàn)兩種象，比例與溫度相關(guān)．譜圖分析表明兩種構(gòu)象是L61-P62順反異構(gòu)造成的L61-P62反式順式在新藥發(fā)現(xiàn)中的NMR應(yīng)用

Animportanttechniqueinsupportofstructure-baseddrugdesign

provideinformationonthenatureofmolecularinteractions,identifyweak-bindingcompoundstoaiddevelopmentofthedrug-likeinhibitorsforuseasleadcompoundsindrugdiscovery.NMR進(jìn)行新藥研究的策略檢測(cè)蛋白質(zhì)：1.選擇性地同位素標(biāo)記某種類型的氨基酸殘基;2.‘segmentallabelling’:discretesegmentsofthepolypeptidechainareuniformlylabelled;3.Chemical-shiftmappingorDifferentialchemical-shift

mapping檢測(cè)底物小分子：

BasedonT2

andT1enhancement:thelargedifferencesintheratesofrotationalandtranslationalmotionsofasmallmoleculeinthefreestaterelativetowhenitisboundtoamacromolecule新的脈沖方法：SEA-TROSY:selectssolvent-exposedamideprotonsinuniformlydeuterated15N-labelledproteinsdissolvedinH2