細胞因子及其受體的檢測

細胞因子及其受體的檢測

第一節(jié)細胞因子檢測概述一、細胞因子的類型與作用特點二、細胞因子檢測的特點與方法由非神經(jīng)—內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生的一大類與免疫應答活動密切相關的低分子蛋白與多肽。細胞因子細胞因子的類型與作用特點1、細胞因子的分類2、細胞因子的作用特點以生物學作用進行劃分的分類白細胞介素（Interleukin）——IL-1、IL-2、……IL-18干擾素（Interferon）——IFN-、IFN-、IFN-腫瘤壞死因子（Tumornecrosisfactor）——TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulatingfactor）——M-CSF、G-CSF轉(zhuǎn)化生長因子（Transforminggrowthfactor）——TGF-趨化因子（Chemokine）——IL-8、GROs、MCP-1生長因子（Growthfactor）——EGF、FGF、IGF、PDGFTNFsILsIFNsTGFsChemokinesCSFs各類細胞因子間關系1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性2、多源與同源性3、高效性4、多效性（pleiotropy）5、豐余性（redundancy）6、協(xié)同性7、拮抗性8、網(wǎng)絡性細胞因子細胞因子細胞因子受體細胞因子受體細胞因子的自分泌與旁分泌性

IL-2IFN-TNF-細胞因子的同源性與多源性IFN-T細胞T細胞NK細胞IL-4Th細胞肥大細胞Th細胞B細胞細胞因子的多效性Th細胞B細胞細胞因子的豐余性IL-2IL-4IL-5Th細胞B細胞細胞因子的協(xié)同性IL-4IL-5Th2細胞B細胞細胞因子的拮抗性Th1細胞IL-4IFN-細胞因子的網(wǎng)絡性IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSFTNFTGFIL-1IFNIL-1IFNTNFIL-1TGFIFNIL2IL-4IFNIL2IL-4IL-5IL-6TNFIFNIL-1TGFTNFIL-1IFNIL-5GM-CSFG-CSFM-GSFTNFTNFIL-1TGFIL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIL-1IL-6IL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIFN內(nèi)皮細胞成纖維細胞TB細胞因子檢測的特點與方法1、檢測的特點2、檢測的方法

細胞因子檢測的特點免疫原性較弱樣品含量低樣品具有時效性生物效應特異性差細胞因子檢測的方法免疫學檢測方法——抗原性檢測細胞生物學檢測方法——生物活性檢測分子生物學檢測方法——基因表達檢測

第二節(jié)細胞因子檢測的方法與原理一、細胞因子的細胞生物學檢測二、細胞因子的免疫學檢測三、細胞因子的分子生物學檢測細胞因子的細胞生物學檢測1、檢測方法與原理2、檢測中的操作注意要點

檢測方法與原理細胞增殖或增殖抑制試驗細胞病變抑制試驗細胞毒試驗細胞趨化試驗濾膜：計數(shù)受趨化細胞趨化因子細胞趨化試驗原理示意檢測中的操作注意要點靶細胞的選擇與培養(yǎng)檢測標本的制備顯示檢測結(jié)果靶細胞的選擇與培養(yǎng)1、對所測的細胞因子有特異的敏感性2、易培養(yǎng)、保存、生物學特性穩(wěn)定3、有良好的生長狀態(tài)4、種屬適配各類細胞因子檢測的常用靶細胞細胞因子實驗系統(tǒng)干擾因素IL-1D10（M）增殖法IL-2、IL-4EL-4（M）增殖法IL-4A352（H）增殖抑制法IL-2CTLL（M）增殖法IL-4IL-3KG-1（H）增殖法

TF-1（H）增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL（M）增殖法IL-2IL-5BCL-1（M）增殖法IL-4各類細胞因子檢測的常用靶細胞細胞因子實驗系統(tǒng)干擾因素IL-6B9（M）增殖法IL-4、IL-11BM60（H）增殖法IL-7Clone-IXN/2b（M）增殖法IL-8中性粒細胞（M、H）趨化法GM-CSFTF-1（H）增殖法IL-3、IL-5IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）細胞毒法IFNwish（H）病變保護法IFN-、IFN-L929（M）病變保護法IFN-、IFN-

檢測標本的準備1、分離特定的產(chǎn)生細胞2、對產(chǎn)生細胞進行誘導、激活3、選擇適當?shù)氖占瘯r間顯示檢測結(jié)果1、細胞增殖狀態(tài)的顯示：放射性核素摻入法、胞內(nèi)酶活性顯示法活細胞染色法細胞熒光測定法2、細胞毒或細胞病變狀態(tài)的顯示活細胞染色法胞內(nèi)酶活性顯示法

DNA斷片測定法直接計數(shù)法

簡便、直觀,但費時、主觀因素影響大、難以標準化和自動化細胞代謝活性測定方法

3H-TdR、125I-UdR摻入法或MTT等比色法細胞代謝產(chǎn)物測定法代謝產(chǎn)物熒光強度測定法和指示細胞表面標記或可溶性分子測定法細胞增殖檢測方法分類

通過檢測細胞DNA合成的增加或減少來判斷細胞增殖的方法。在細胞的增殖過程中，DNA合成的增加使得指示細胞對核苷或堿基的需求增多，若將核苷標記上可以示蹤的同位素（3H/125I），通過檢測細胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細胞增殖的程度。結(jié)果客觀易于自動化；適用于大標本量的測定

優(yōu)點缺點方法的特異性受依賴細胞株影響；放射性污染(1)放射性核素摻入法特點：不使用放射性核素，以細胞代謝變化為增殖指征指示細胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關測定步驟類似相同點不同點與同位素摻入法相比摻入物：MTT而非3H-TdR；反應條件：選用的細胞及其濃度、培養(yǎng)時間不同(2)MTT比色法敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾生物學活性測定方法學評價細胞因子的免疫學檢測分泌型細胞因子的檢測細胞內(nèi)細胞因子的檢測敏感性偏低不能判斷細胞因子的生物學活性。ELISA特異、簡便易于推廣和標準化等優(yōu)點可同時檢測大量標本且試驗廢棄物便于處理細胞因子測定的首選方法優(yōu)點缺點ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT或ElisaSpot)在包被有待測細胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應細胞因子的待測細胞，經(jīng)在有或無刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測細胞分泌細胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應如同ELISA，即在洗去細胞后視用于試驗的酶標抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。一個斑點代表一個細胞因子分泌細胞，斑點的顏色深淺程度與細胞分泌的細胞因子量相關基本原理細胞內(nèi)細胞因子檢測技術激活膜抗原標記細胞內(nèi)細胞因子標記流式細胞分析法流式細胞分析法，是基于熒光抗體染色技術并借助流式細胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細胞內(nèi)細胞因子和細胞表面粘附分子的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進行單個細胞水平的細胞因子或粘附因子的檢測，精確判斷不同細胞亞群細胞因子和膜分子的表達情況。1．分離和培養(yǎng)待檢細胞2．細胞固定3．封閉非特異性結(jié)合位點4．染色與分析基本步驟使用流式細胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性的細胞亞群：

Th1細胞IFN-γTh2細胞IL-4細胞表面的粘附分子或細胞因子受體：單克隆抗體技術直接或間接熒光抗體染色無需作細胞固定和非特異性結(jié)合位點的封閉待測細胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細胞，保持良好狀態(tài)四、免疫學測定方法學評價優(yōu)點：特異性高

操作簡便、快速，無需依賴細胞株影響因素較少且易控制，重復性好，方法容易標準化。缺點：所測定的只是細胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關系敏感性相對較低標本中細胞因子的可溶性受體，會影響特異性抗體對細胞因子的結(jié)合細胞因子的分子生物學檢測此方法測定的并非細胞因子本身，而是細胞因子的基因。方法：1、Northern印跡雜交法2、Southern印跡雜交法3、PCR與逆轉(zhuǎn)錄PCR4、原位雜交，原位PCR和原位RT—PCR

第三節(jié)常用細胞因子的檢測方法一、IL-2的檢測二、IFN-γ的檢測三、TNF的檢測待檢樣品（細胞上清）指示細胞（CTLL-2）按不同稀釋度加入37oC，16-20小時加入3HTdR（1-5Ci）37oC，4-6小時收集細胞測定白細胞介素-2的測定示意圖待檢樣品（細胞上清）指示細胞（L929）按不同稀釋度加入37oC，4小時37oC，24-48小時棄取上清，加入VSV觀察細胞病變（鏡檢或比色）干擾素的測定示意圖腫瘤壞死因子的測定示意圖待檢樣品（細胞上清）指示細胞（L929）按不同