分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(十)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（十）湖北民族學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（polymerasechainreaction,PCR）湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心模板DNA：

恩施州土家族人群人血DNA

目的基因：

GSTM1基因

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉PCR技術(shù)的基本原理2、掌握其操作方法3、了解引物設(shè)計(jì)的一般要求二、實(shí)驗(yàn)原理PCR是一種體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù)，可在體外特異的對(duì)目的基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，其巧妙之處在于預(yù)先設(shè)計(jì)合成二段分別與待測(cè)目的基因兩端互補(bǔ)的引物，以起到指向定點(diǎn)的作用，再借助于DNA聚合酶催化的若干次擴(kuò)增反應(yīng)，即可使特定的基因片段成百萬(wàn)次的擴(kuò)增。

1、變性通過(guò)加熱使雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。

2、退火當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多與模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈。三、

基本反應(yīng)步驟：

3、延伸在DNA聚合酶和4種dNTP及Mg2+存在的條件下，DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)DNA鏈的延伸反應(yīng)。以上3步為一個(gè)循環(huán)，其產(chǎn)物可作為下一循環(huán)的模板，經(jīng)若干次循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到大量復(fù)制。四、試劑（一）制備模板DNA的試劑1、裂解液2、8MKAc3、氯仿4、無(wú)水乙醇5、70%乙醇6、TE緩沖液7、RNA酶10mg/ml8、3MNaAc（pH4.8）9、蛋白酶K20mg/ml（二）PCR反應(yīng)體系1、引物

2、dNTPs3、10×PCRbuffer4、Tap聚合酶

5、模板DNA五、主要實(shí)驗(yàn)儀器1、臺(tái)式高速離心機(jī)2、PCR擴(kuò)增儀3、電泳儀、電泳槽4、可調(diào)式微量加樣器及吸頭5、凝膠成像系統(tǒng)六、實(shí)驗(yàn)步驟（一）PCR反應(yīng)1、按下列次序?qū)⒏鹘M分加入0.2ml滅菌管內(nèi)并混合。10×PCRbuffer8μldNTPs200mmol/L引物10.2mmol/L引物2100pmolTaq酶1.5u模板DNA100ng加水至總體積25μl2、94℃預(yù)變性3min。3、94℃1min→59℃

1min

→72℃

1.5min

共35個(gè)循環(huán)。4、72℃延伸10min。5、冷卻至4

℃用于電泳或轉(zhuǎn)至-20℃保存。（二）PCR產(chǎn)物的凝膠電泳分析

PCR產(chǎn)物可通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增片段大小，以及有無(wú)預(yù)期特定片段長(zhǎng)度DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的生成，分析PCR的效果及特異性，或