真核細(xì)胞提取與酶切鑒定

關(guān)于真核細(xì)胞提取與酶切鑒定第一頁，共三十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)本身:實(shí)驗(yàn)室規(guī)則:時(shí)間、穿著、

儀器不能亂動、

賠償制度、

整潔、衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)報(bào)告（如實(shí)記錄）

規(guī)范操作（辨認(rèn)標(biāo)簽…）、

污染物、毒物、廢棄物

（酸堿燒傷大量自來水沖洗）規(guī)則實(shí)驗(yàn)

第二頁，共三十五頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求題目，組號實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作：如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析：實(shí)事求是討論或小結(jié)：認(rèn)真分析，仔細(xì)思考第三頁，共三十五頁，2022年，8月28日4真核細(xì)胞基因組DNA的分離提取及酶切電泳第四頁，共三十五頁，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握人外周血基因組DNA的提取原理、提取方法和注意事項(xiàng)。2.學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定DNA的原理和技術(shù)。第五頁，共三十五頁，2022年，8月28日基因組DNA提取的操作流程

〖實(shí)驗(yàn)步驟〗第六頁，共三十五頁，2022年，8月28日１、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml

Eppendorf離心管中。

抗凝劑

EDTA-Na2、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑

第七頁，共三十五頁，2022年，8月28日２、加入1mlSTMT，充分混勻

使其溶血。STMT（破壞細(xì)胞膜)sugar：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機(jī)械作用而降解。Tris·HCl:不含金屬離子,與EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。MgCl2:提供Mg2+，穩(wěn)定DNA。TritonX-100:非離子去污劑（表面活性劑），直接破裂血中紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜，釋出血紅蛋白及細(xì)胞核。第八頁，共三十五頁，2022年，8月28日３、10000g離心2min，棄上清。注意離心機(jī)的使用⑴配平⑵上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。第九頁，共三十五頁，2022年，8月28日4、用0.4ml生理鹽水洗沉淀，10000g

離心2min，棄上清。注意離心機(jī)的使用⑴配平⑵上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。第十頁，共三十五頁，2022年，8月28日５、加450μlNE溶液將沉淀重新懸浮。NENaCL:50mmol/LEDTA:1.二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2.降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性第十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日６、加50μl10%SDS，迅速混勻;再加50μl蛋

白酶K，輕輕搖勻后置50℃水浴1h。SDS

1.溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3.對RNA、DNA酶有抑制作用4.與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶)

廣譜蛋白酶，水解蛋白質(zhì)。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。第十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日７、加入TE飽合酚500μl，輕搖2min，10000g離心

1min，將上層水相移至另一新Eppendorf管內(nèi)。酚能有效地使蛋白質(zhì)變性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10％一15％的水分。第十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日８、加入酚－氯仿－異戊醇混合液500μl，輕搖

1min，10000g離心1min，將上層水相移至另

一Eppendorf管內(nèi)。氯仿也是一種蛋白變性劑，但氯仿的變性作用不如酚。氯仿有助于加速有機(jī)相和水相的分離；使用兩種不同的有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一一種有機(jī)溶劑效果好。酚和氯仿兩者交替反復(fù)抽提，還可克服酚的缺點(diǎn)。第十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日９、加入氯仿－異戊醇混合液500μl，輕搖

1min，10000g離心1min，將上層水相移至另

一新Eppendorf管內(nèi)。（定體積）移上清時(shí)要定量，寧少勿多氯仿：①將殘留在水相中的酚帶走②也可以再次使蛋白變性異戊醇：①降低分子表面張力，減少氣泡產(chǎn)生②有助于分層上層為水相中間為變性的蛋白下層為有機(jī)相第十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日10、向上清中加入1/10體積的NaAc，并混勻。

再加入2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻，

于－80℃放置10min。核酸是多聚陰離子的水溶性化合物，能與鈉、鉀、鎂等很多1價(jià)、2價(jià)陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會被變性。最常用的沉淀劑為1價(jià)鈉、鉀、銨和鋰等離子鹽類，如醋酸鈉、氯化鈉等。常用有機(jī)沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。第十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日11、10,000g離心5min，棄上清,將小管倒置于濾紙上。室溫干燥10min。第十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日12、加入20μl雙蒸水溶解基因組DNA?；蚪MDNA8μl10XH緩沖液1μlEcoRⅠ1μl離心甩一下，37℃溫浴1h。另外剩余的10μl留做電泳分析用。酶切體系第十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日

酶切注意事項(xiàng)按順序加樣，每加一個(gè)樣品更換一次tip頭一定要將酶加進(jìn)去加酶的時(shí)候一定保證低溫，在冰上操作加完后要充分混勻，用離心機(jī)“甩”一下再水?。ㄅ淦胶螅S意調(diào)時(shí)間，將轉(zhuǎn)速調(diào)到接近最大值，即刻再調(diào)回零）第十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日13、1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(上樣量10μl)10μL酶切后基因組DNA2μL6×Loadingbuffer10μ基因組DNA2μL6×Loadingbuffer10μLMarker1×TBE恒壓100V電泳0.5-1h第二十頁，共三十五頁，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)原理核酸：包括DNA、RNA兩種分子。

DNARNA多呈單鏈線性分子雙鏈線性分子雙鏈環(huán)狀分子第二十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日

真核生物DNA95%存在于細(xì)胞核5%存在于細(xì)胞器真核生物RNA10%存在于細(xì)胞核15%存在于細(xì)胞器75%存在于細(xì)胞質(zhì)第二十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日

分離純化核酸總的原則應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染第二十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日

完整性的保證盡量簡化操作步驟，縮短提取過程減少化學(xué)因素對核酸的降解減少物理因素對核酸的降解如機(jī)械剪切力、高溫防止核酸的生物降解

DNA酶、RNA酶第二十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日

純度的保證核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度排除其它核酸分子的污染第二十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日

從全血中制備基因組DNA

首先用去污劑TritonX-100直接破裂紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜，使之釋放出血紅蛋白及細(xì)胞核，通過離心分離即可獲得白細(xì)胞核；用SDS破壞核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，從而使DNA釋放入水相中。用酚／氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，再用氯仿除去DNA溶液中殘存的蛋白質(zhì)及酚；用無水乙醇沉淀水相中的DNA，即可獲得基因組DNA。破裂細(xì)胞→消化蛋白質(zhì)→有機(jī)抽提除去蛋白質(zhì)→沉淀水相中的DNA第二十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日DNA抽提示意圖第二十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是識別DNA的特異序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠMolecularscissor第二十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日

均來自微生物，并據(jù)此而進(jìn)行命名；識別序列長度常為4－8核苷酸序列;大部分酶識別序列呈二元旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)即回文結(jié)構(gòu);

其切割后的DNA可產(chǎn)生不同的末端。限制酶的特點(diǎn)（Ⅱ類酶）第二十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日

DNA的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海洋植物瓊脂中提取來的，為一種聚合鏈線性分子。線性DNA分子在電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)成反比DNA的空間構(gòu)型不同，即使分子量相同其遷移率也不相同

第三十頁，共三十五頁，2022年，8月28日

核酸電泳的染色劑

最常用的是溴乙錠染色法。(ethidiumbromide，EB)對1ngRNA，DNA均可顯色。EB染料是一種強(qiáng)烈的誘變劑，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，應(yīng)戴上聚乙烯手套。在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光(590nm）。

第三十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日

實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶切后的基因組DNA第三十二頁，共