聚合物在生物大分子分離中實際應(yīng)用

聚合物在生物大分子分離中實際應(yīng)用分離過程及原理聚合物在DNA分離中的應(yīng)用聚合物在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用內(nèi)容1.分離過程及原理定義：將一定樣品中相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)拆解成純的物質(zhì)稱為分離。方法：萃取、過濾、離心、色譜、電泳等。實質(zhì)：混合的逆過程。混合是自發(fā)的，分離是被動的，需要能量或外力的推動。原理：差速運(yùn)動過程，即利用速度差別進(jìn)行物質(zhì)的分離與純化，

電泳：帶電粒子在電場作用下于一定介質(zhì)（溶劑）中所發(fā)生的運(yùn)動。電泳分離及其條件選擇的依據(jù)：離子所帶電荷越多、解離度越大、體積越小、溶液的黏度越小，電泳速度越快。電滲：毛細(xì)管中的溶劑因軸向直流電場作用而發(fā)生的定向流動，起因于定域電荷。定域電荷：牢固結(jié)合在管壁上、在電場作用下不能遷移的離子或帶電基團(tuán)。電滲的方向：與固體表面電荷所具有的電泳方向相反；電滲的強(qiáng)度:與定域離子的數(shù)量或固液界面成正比；與流路通道孔徑有關(guān)。熔融硅毛細(xì)管中的電滲定域電荷產(chǎn)生指向負(fù)極的電滲CE工作原理組分合淌度合速度正離子中性分子負(fù)離子例：當(dāng)把樣品從正極端注入到石英毛細(xì)管中時，不同符號的離子將按表中的速度向負(fù)極遷移。電滲率：電遷移率：

2．聚合物在DNA分離中的應(yīng)用

人類基因組計劃（HumanGenomeProject－HGP）

1986年，著名生物學(xué)家、諾貝爾獎獲得者H.Dulbecco提出人類基因組計劃。1990年正式啟動，其主要目標(biāo)有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。

遺傳學(xué)

核酸(DNA和RNA)的功能：儲存和傳遞信息，指導(dǎo)和控制蛋白質(zhì)的合成。DNA:主要的遺傳物質(zhì)，通過復(fù)制而將信息由親代傳給子代。RNA:與遺傳信息在子代的表達(dá)有關(guān)。刑偵學(xué)腺嘌呤(A)鳥嘌呤(G)胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)DNA的組成DNA的結(jié)構(gòu)毛細(xì)管電泳分離DNA的過程

電滲是CE的基本現(xiàn)象之一，它可以控制組分的遷移速度和方向，進(jìn)而影響CE的分離效率和重現(xiàn)性．DNA的分離理論310型全自動遺傳分析儀ABIPrism?3100遺傳分析儀

DNA分析儀ABI310-DNA中的染料如何控制電滲流？理論：能影響電滲的因素都有可能用于電滲的控制實際：能理想地調(diào)節(jié)電滲而又不影響分離過程的控制方法目前不多見．對于DNA分離及測序來說，，常用管壁涂層（涂覆)技術(shù).用于DNA分離的聚合物交聯(lián)聚合物非交聯(lián)聚合物篩分介質(zhì)：凝膠和非凝膠(非交聯(lián)的聚合物溶液)

。要求：低黏度、高的篩分能力和自涂覆功能。非凝膠：均聚物、共聚物（包括無規(guī)、嵌段、接枝等）、共混物等。均聚物線形聚丙烯酰胺聚N,N-二甲基丙烯酰胺聚氧化乙烯羥乙基纖維素聚乙烯基吡咯烷酮存在的問題：共聚物a.

無規(guī)共聚物poly(DEA-co-DMA)聚(N,N-二乙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺）poly(AM-co-DMA)聚(丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)poly(AA-co-AG)聚(丙烯酰胺-co-β-吡喃型葡萄糖)poly(AM-co-AAG)聚(丙烯酰胺-co-葡糖酰丙胺)poly(NEEA-co-NMEA)聚(乙氧基乙基丙烯酰胺-co-乙氧基甲基丙烯酰胺)等b.嵌段共聚物PEG-(CnF2n+1)2末端帶有碳氟化合物的聚乙二醇PEO-PPO-PEO低分子量的聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷的三嵌段共聚物BEB/EBE聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丁烷的三嵌段共聚物等C.接枝共聚物PAM-g-PNIPAM（聚丙烯酰胺-g-聚N-異丙基丙烯酰胺)PNIPAM-g-PEO(聚N-異丙基丙烯酰胺-g-聚環(huán)氧乙烷)PAM-g-PDMA（聚丙烯酰胺-g-聚N，N-二甲基丙烯酰胺）PDMA-g-PMMA（聚N，N-二甲基丙烯酰胺-g-聚甲基丙烯酸甲酯）等存在的問題：

共混聚合物不同分子量的PEO分離ds和ssDNAHEC，LPA等不同分子量的混合物也都能成功地對DNA分離或排序存在的問題：線形聚丙烯酰胺（LPA，高分子量)：優(yōu)點(diǎn)：測序功能優(yōu)異，如DNA讀取長度缺點(diǎn)：高黏度、無自涂覆能力聚N,N-二甲基丙烯酰胺（PDMA):優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)異的自涂覆功能、低黏度缺點(diǎn)：測序功能不如LPA很少有均聚物能同時滿足以上要求。準(zhǔn)互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物(quasi-IPN)(1)PVP和PDMA組成的quasi-IPN分離雙鏈DNA(ds-DNA)4%PVP均聚物+4%PDMA均聚物Quasi-IPN(4%PVP+4%PDMA)PVP、PDMA、它們的共混物、quasi-IPN形成網(wǎng)絡(luò)的原理Quasi-IPN重現(xiàn)性的研究Electrophoresis2002,23,1460-1466(2)PAM和PDMA組成的quasi-IPN在DNA測序中的應(yīng)用反相微乳液聚合合成PAMElectrophoresis2005,26,126-136PAM/PDMA組成的quasi-IPN用于DNA測序不足之處：quasi-IPNGNPsquasi-IPN/GNPsDMAinitiatorquasi-IPNLPA(3)quasi-IPN/GNPs復(fù)合介質(zhì)TEMimagesof(A)GNPs20(~20nm),(B)GNPs40(~40nm),and(C)GNPs60(~60nm)inwater,and(D)GNPs40(~40nm)inquasi-IPN3polymersolution.Thepartialfour-color(baseC,T,A,G)electropherogramsofstandard

DNAsampleusing2.5%w/vquasi-IPN3/GNPs40-1byCEat50℃.Electrophoresis,2007,28,1072-1080.Electrophoresis,2007,28,2998-3007中國發(fā)明專利：ZL2.3.(4)quasi-IPN/官能化金納米粒子復(fù)合介質(zhì)

Theschematicrepresentationofreactionroutesfor(A)GNP-PDMAand(B)quasi-IPN/GNP-PDMA.

(A1)GNPs(~18nm);(A2)GNP-PDMA;(B1)freshGNPsolution;(B2)GNPsolutionafter2months,(B3)GNP-PDMAsolutionafter10months.

Electrophoresis,2008,29,4637-4645(5)quasi-IPN/官能化的多壁碳納米管雙網(wǎng)絡(luò)復(fù)合介質(zhì)小結(jié)

將GNPs加入到由較低分子量的LPA和PDMA組成的quasi-IPN中，形成了quasi-IPN/GNPs。quasi-IPN/GNPs的測序時間不僅小于quasi-IPN，而且分離度也高于quasi-IPN，接近甚至高于含較高分子量LPA但不含GNPs的quasi-IPN。

將GNP-PDMA加入到由較低分子量LPA和PDMA所組成的quasi-IPN中得到quasi-IPN/GNP-PDMA.。GNP-PDMA的存在可以改善GNPs與整個測序體系的相容性、增大網(wǎng)絡(luò)的纏結(jié)程度并增加GNPs在體系中的含量，從而導(dǎo)致整個篩分網(wǎng)絡(luò)更加受限和穩(wěn)固、介質(zhì)的表觀分子量更高并且孔徑更小，因此與之前的quasi-IPN/GNPs相比，quasi-IPN/GNP-PDMA可以進(jìn)一步增強(qiáng)ssDNA的測序性能。通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法（ATRP）制備了PDMA官能化的多壁碳納米管（MWNT-PDMA）添加劑，并加入到由LPA（3.3MDa）和PDMA所組成的quasi-IPN中而得到了聚合物/納米管雙網(wǎng)絡(luò)復(fù)合篩分介質(zhì)（quasi-IPN/MWNT-PDMA）。柔性的quasi-IPN聚合物網(wǎng)絡(luò)和剛性的MWNTs（具有獨(dú)特的管狀結(jié)構(gòu)）網(wǎng)絡(luò)相互作用，從而避免聚合物之間彼此滑移、穩(wěn)固和制約總的篩分網(wǎng)絡(luò)、增加介質(zhì)的表觀分子量并減小介質(zhì)的孔徑。因此，quasi-IPN/MWNT-PDMA介質(zhì)中的這種更受限、更穩(wěn)固且孔徑更小的納米結(jié)構(gòu)使得測序性能更優(yōu)良。２．聚合物在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用

后基因組時代（Post-GenomeEra)

科學(xué)的發(fā)展以及技術(shù)上的突破，使人類基因組計劃一再提前，生命科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時代，科學(xué)家們的研究重心已從揭示基因組DNA的序列轉(zhuǎn)移到在整體水平上對基因組功能的研究。后基因組時代的一個重要標(biāo)志就是蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics)的建立。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，蛋白質(zhì)分離分析的重要性及意義也日見突出。

2001，人類蛋白質(zhì)組計劃(HumanProteomeProject,HPP)

蛋白質(zhì)是由氨基酸通過酰胺鍵連接而成的高分子，兩性，存在等電點(diǎn)，因其空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，有親水或疏水之分。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成成分，生命現(xiàn)象中絕大多數(shù)生物功能是通過蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的。蝴蝶從卵變蟲變蛹再變蝶，是個絕對神奇的過程。

基因只是遺傳信息的載體，要研究生命現(xiàn)象，詮釋生命活動的規(guī)律，只了解基因組的結(jié)構(gòu)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，必須對基因的編碼產(chǎn)物-蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。HumanBrainProject蛋白質(zhì)和疾病阿爾茨海默?。ˋlzheimerdisease，AD）與tau蛋白：在AD患者腦內(nèi)，發(fā)病機(jī)制很多，其中一種觀點(diǎn)認(rèn)為因Tau蛋白異常過度磷酸化，并聚集成雙螺旋絲形式，與微管蛋白的結(jié)合力降低，失去了促進(jìn)微管形成和維持微管穩(wěn)定的作用。異常磷酸化Tau蛋白的病理性沉積，導(dǎo)致了神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）的形成。蛋白質(zhì)在低于等電點(diǎn)時會帶上正電荷，在高于等電點(diǎn)時帶負(fù)電荷．若緩沖溶液的pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)則吸附H＋而帶正電荷，由于靜電相互作用，蛋白質(zhì)與管壁發(fā)生吸附。堿性蛋白質(zhì)（pI＝8）所帶電荷量隨pH的變化曲線；在pH＝4時，堿性蛋白質(zhì)（pI＝8）與毛細(xì)管壁發(fā)生吸附P/ACEMDQ(BeckmanCoulterInstruments)proteinacidprotein(pI<7)neutralprotein(pI=7)basicprotein(pI>7)SioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSioSio+++++pH<7,堿性蛋白質(zhì)帶正電。pH>3,SiOH→SiO_。蛋白質(zhì)吸附Dolnik,V.,Hutterer,K.M.,Electrophoresis2001,22,4163-4178.Towns,J.K.,Regnier,F.E.,AnalyticalChemistry1992,64,2473-2478.Hjerten,S.,Kubo,K.,Electrophoresis1993,14,390-395.極端pH值法

pH高于蛋白質(zhì)的pI時，毛細(xì)管內(nèi)壁對蛋白質(zhì)產(chǎn)生靜電排斥抑制吸附，但是，蛋白質(zhì)存在的自然狀態(tài)為pH4－10，高pH如時，容易使蛋白質(zhì)變性或者水解。pH小于（熔融硅或石英的等電點(diǎn)）時，蛋白質(zhì)的質(zhì)子化導(dǎo)致其質(zhì)荷比差別較小，分辨率難以提高。對等電點(diǎn)相近的蛋白質(zhì)不易實現(xiàn)分離。一般認(rèn)為，使蛋白質(zhì)混合物分離的首選pH值應(yīng)和蛋白質(zhì)混合物的pKa值基本一致。McManigillD.AnalChem,1986，58：166～170.添加小分子添加劑表面活性劑：季銨鹽和氟化的陽離子表面活性劑。中性鹽：如磷酸鹽，硫酸鉀等。胺類：三乙醇胺、三乙胺、N-乙基二乙醇胺，N,

N,N’,

N’-四甲基-1,

3-丁二胺（TMBD）等。有機(jī)溶劑：醇類、乙腈、丙酮、四氫呋喃、二甲亞砜等，其中最常用的是甲醇和乙腈。選用極端pH值或添加小分子添加劑的方法雖然能從一定程度上降低蛋白質(zhì)吸附，但是容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和變性。目前最常用的方法是用聚合物對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行改性處理。何金蘭等.高效毛細(xì)管電泳.北京：科學(xué)出版社，1996,72～75.VerzolaB,GelfiC,RighettiPG.JChromatogrA，2000，868：85～99.CorradiniD,CannarsaG,FabbriE,etal.JChromatogrA，1995，709：127～134.CorradiniD,CannarsaG.Electrophoresis，1995，16：630～635.1.形成涂層的聚合物必須具備抗蛋白質(zhì)吸附的功能。一般具有親水性；含有氫鍵受體；非氫鍵供體；電中性等四個特點(diǎn)；2.聚合物涂層要很穩(wěn)定。形成涂層的聚合物本身要很穩(wěn)定；涂層在使用時對周圍環(huán)境不敏感；3.涂層制備簡單且使用壽命長。PEG類材料的抗蛋白質(zhì)吸附原理

SioSioSioSioSioSiosiooosiooopolymercoatingSioSioSioSioSioSiosiooosiooosilanereagentsioooSioSioSioSioSiomonomerinitiator共價鍵涂層Sio

Lucy,C.A.,MacDonald,A.M.,Gulcev,M.D.,JournalofChromatographyA2008,1184,81-105.抑制熔硅毛細(xì)管表面Si－OH解離，修飾表面Zeta電勢．聚合物或硅烷化試劑的取代基覆蓋已離解的Si－OH．增加了內(nèi)壁表面層附近溶液的黏度，涂層的厚度和密度都將影響到表面層附近溶液的黏度，從而影響涂層的涂覆效果。涂層壽命長，穩(wěn)定性好，分離效率高。共價鍵合的過程中涉及毛細(xì)管硅烷化和引發(fā)單體聚合兩步反應(yīng)，一方面受兩步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率影響，Si－OH很難被完全屏蔽；另一方面，毛細(xì)管內(nèi)的聚合反應(yīng)很難控制，容易造成涂層的不均一性、不規(guī)整性，甚至阻塞毛細(xì)管。價格昂貴。3000元/米非共價鍵涂層SioSioSioSioSioSioSioSioSioSiopolymersolutionSioSio氫鍵、離子鍵、疏水相互作用等

涂層制備過程簡單易操作，涂覆過程可一步完成，涂層可再生。這種涂層可以是中性的、帶正電荷的、也可以是吸附在帶正電的聚合物涂層表面轉(zhuǎn)而帶負(fù)電荷的。非共價鍵涂層穩(wěn)定性不及共價鍵合涂層．(1)毛細(xì)管非共價鍵涂層的制備

(I)陽離子聚合物涂層的制備優(yōu)點(diǎn)：低粘度、商用產(chǎn)品，廣泛用于物理涂層存在的問題：容易被沖出毛細(xì)管。解決方案：cat-HEC1.溶菌酶;2.細(xì)胞色素c;3.核糖核酸酶A.Yang,R.M.,Shi,R.H.,Peng,S.H.,Zhou,D.,Liu,H.,Wang,Y.M.,Electrophoresis2008,29,1460-1466.cat-HEC-g-PPEGMASynthesisandcharacterizationofcat-HEC-g-PPEGMA

StabilizationofEOF

Milkpowdersamples

Eggwhitesamples1.α-lactalbumin;2.β-lactoglobulinB;3.β-lactoglobulinA.

1.lysozyme;2.ConA3.OVA(aandb:glycoisoforms)DanZhou,LinaXiang,RongjuZeng,FuhuCao,XiaoxiZhu,YanmeiWang*,Journalofseparationscience2011,34,3441-3450.A:BarecapillaryB:CoatedcapillaryHEC-g-P4VPYang,R.,Liu,Y.,Wang,Y.,Electrophoresis2009,30,2321-2327.HEC-g-PDMAEMAFuhuCao,ZhaofengLuo,DanZhou,RongjuZeng,YanmeiWang*,Electrophoresis2011,32,1148-1155.SuppressionofEOFSeparationofproteinmixture1.cytochromec;2.lysozyme;3.myoglobin;4.ribonucleaseA;5.a-chymotrypsinogenA;6.trypsininhibitor.

HangLiu,RonghuaShi,WenmingWan,RunmiaoYang,YanmeiWang*

Electrophoresis2008,

29,2812-2819samplesMn1HNMRa)(×10-4)Mn，GPCb)(×10-4)Mw/Mn(GPC)PEO113-b-P4VP450.971.41.21PEO113-b-P4VP901.442.01.29PEO113-b-P4VP1131.692.41.26PEO113-b-P4VP2943.595.21.35PEO-b-P4VPQPDMAEMA-PEO-QPDMAEMAFuhuCao,XiaoxiZhu,ZhaofengLuo,JinxingXing,XiaohuaShi,YanmeiWang,HervéCheradame,

Electrophoresis2011,32,2874-2883.HEC-g-PDMA1.溶菌酶;2.細(xì)胞色素c;3.核糖核酸酶A.Peng,S.H.,Shi,R.H.,Yang,R.M.,Zhou,D.,Wang,Y.M.,Electrophoresis2008,29,4351-4354.(II)中性聚合物涂層的制備PDMA-b-PEO-b-PDMAJingXu，LianyunYang，ZhaofengLuo，YanmeiWang*，Electrophoresis,

2010,31,1713-1720.1.細(xì)胞色素c;2.溶菌酶;3.肌紅蛋白;4.核糖核酸酶A;5.白蛋白6.胰蛋白酶抑制劑.

PEGMA-DMA

1,lysozyme;2,cytochromec;3,ribonucleaseA;and4,α-chymotrypsinogenA.Journalofseparationscience2011,34,1738-1745雜臂”星形聚合物及其形成的涂層

星形聚合物PEG3-PDMA

Science,2007,318,426-430研究背景polydopaminecoatingpolydopaminecoatingNH2PEG—NH2PEG—NH2PEG—NH2—PEGNH2PEG—++++++++++(2)毛細(xì)管仿生涂層Polydopamine-g-PEG涂層Cr+O2GlassslideGlassslideTris-HClsolutionpH=8.525oC,5hPolydopamineadlayer25mg/mLPEG-NH2Tris-HClsolutionpH=8.550oC,10hGlassslideProteinsAuFused-silicacapillaryFused-silicacapillaryFused-silicacapillaryPolydopamineadlayerTris-HClsolutio