雙水相萃取-綠色技術(shù)

雙水相萃取---綠色化工技術(shù)樊君教授西北大學(xué)化工學(xué)院萃取分離利用兩物質(zhì)在兩相中溶解度不同而使其分離的技術(shù)。按兩相組成不同分：一、有機(jī)溶劑萃?。╨ink)二、雙水相萃?。╨ink)三、超臨界萃?。╨ink)四、反膠束萃取（link)go一、有機(jī)溶劑萃取利用溶質(zhì)在水和有機(jī)溶液中溶解度不同而分離。應(yīng)注意變性，在低溫下操作；過程：（1）選擇適宜有機(jī)劑；（2）含組分和水溶液與預(yù)冷的有機(jī)劑混合，靜止分層；（3）將水相與有機(jī)相分開；（4）除去有機(jī)劑，獲得產(chǎn)物。有機(jī)相水相back二、雙水相萃取雙水相萃取技術(shù)(aqueous-twophaseextraction,ATPS)，又稱水溶液兩相分配技術(shù)(Partionoftwoaqueousphaseextraction)兩相為互不相溶的兩水相，組分在兩相中溶解度不同而分離。1、雙水相形成早在1896年,Beijerinck發(fā)現(xiàn),當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時(shí),得到一個(gè)混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉),這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性（incompatibility），從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueoustwophasesystem,ATPS)。將兩種親水性的聚合物都加在水溶液中,超過某一濃度產(chǎn)生兩相;成相是由于聚合物間不相溶,利用生物物質(zhì)在兩相中不同的分配實(shí)現(xiàn)分離.雙水相萃取關(guān)鍵點(diǎn):制備好雙水相系統(tǒng);首先選好適宜溶質(zhì);其次配制好溶液濃度和比例.聚合物的不相溶性(incompatibility)：當(dāng)兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時(shí)，由于相對(duì)分子質(zhì)量較大，分子間的相互排斥作用與混合過程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱為聚合物的不相容性。形成原理蛋白質(zhì)和酶由于它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的溶解度低并且會(huì)變性，傳統(tǒng)的溶劑萃取法并不適合；雙水相萃取法的特點(diǎn)是能夠保留產(chǎn)物的活性，整個(gè)操作可以連續(xù)化，在除去細(xì)胞或細(xì)胞碎片時(shí)，還可以純化蛋白質(zhì)2～5倍；雙水相萃取法與傳統(tǒng)的分離方法(如鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等)比較也有很大的優(yōu)勢(shì)(如表);2、雙水相萃取的優(yōu)勢(shì)雙水相萃取的優(yōu)勢(shì)處理量相同時(shí)，雙水相萃取法比傳統(tǒng)的分離方法,設(shè)備需用量要少3～10倍;乙醇脫氫酶的分離已達(dá)到幾十千克濕細(xì)胞規(guī)模；用聚乙二醇（PEGMr為6000）/磷酸鉀系統(tǒng)從大腸桿菌勻漿中提取β-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶的提取也到了中試規(guī)模等。雙水相的優(yōu)勢(shì)總結(jié)ATPE作為一種新型的分離技術(shù)，對(duì)生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的提取、純化表現(xiàn)出以下優(yōu)勢(shì)：

(1)含水量高(70％--90％)，在接近生理環(huán)境的體系中進(jìn)行萃取，不會(huì)引起生物活性物質(zhì)失活或變性；

(2)可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)（或者酶），還能不經(jīng)過破碎直接提取細(xì)胞內(nèi)酶，省略了破碎或過濾等步驟；

(3)分相時(shí)間短，自然分相時(shí)間一般為5min～15min；

(4)界面張力小(10-7～10-4mN／m)，有助于兩相之間的質(zhì)量傳遞，界面與試管壁形成的接觸角幾乎是直角；(5)不存在有機(jī)溶劑殘留問題，高聚物一般是不揮發(fā)物質(zhì)，對(duì)人體無(wú)害；

(6)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去；

(7)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無(wú)需進(jìn)行特殊處理；

(8)操作條件溫和，整個(gè)操作過程在常溫常壓下進(jìn)行；

(9)親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的選擇性。雙水相的問題1、含水量高，后續(xù)分離需經(jīng)濃縮；2、含高分子聚合物或鹽類，分離后需進(jìn)一步分離純化以除去。雙水相的雙聚合物體系：聚乙二醇(polyethyleneglycol,

PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇；甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。聚合物與無(wú)機(jī)鹽的混合溶液也可形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀(KPi)、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產(chǎn)物的雙水相萃取。PEG/無(wú)機(jī)鹽系統(tǒng)的上相富含PEG，下相富含無(wú)機(jī)鹽。在雙水相中,水的含量很高,達(dá)85%以上.

3、雙水相系統(tǒng)組成4、雙水相相圖在系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則，即聚合物Q或鹽/%聚合物P/%TBMT’B’C雙節(jié)線系線

系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度，系線越長(zhǎng)，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。當(dāng)系線長(zhǎng)度趨向于零時(shí)，即在圖中的雙節(jié)線上C點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此C點(diǎn)稱為臨界點(diǎn)(criticalpoint)。臨界點(diǎn)a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)圖a和b分別為PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖系線長(zhǎng)度代表了系統(tǒng)達(dá)到平衡時(shí)上、下相和總組成的關(guān)系，在臨界點(diǎn)附近系線的長(zhǎng)度趨向于零，上相和下相的組成相同，因此,分配系數(shù)應(yīng)該是1。隨著聚合物和成相鹽濃度增大，系線的長(zhǎng)度增加,上相和下相相對(duì)組成的差別就增大，產(chǎn)物如酶在兩相中的界面張力差別也增大，這將會(huì)極大地影響分配系數(shù)，使酶富集于上相。兩相組成;高分子聚合物分子量、濃度、極性；兩相溶液比例；鹽類(包括離子的類型和濃度、離子強(qiáng)度、pH值)，溶質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)（酶分子量、電荷、極性、等電點(diǎn)）；體系的溫度、pH值等。這些參數(shù)并不是獨(dú)立地起作用。要預(yù)測(cè)溶質(zhì)在雙水相系統(tǒng)間的分配系數(shù)是困難的。這些系統(tǒng)復(fù)雜性表現(xiàn)在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基團(tuán)會(huì)影響離子的分配和電位，在大分子(親水聚合物或蛋白質(zhì)溶質(zhì))結(jié)構(gòu)中構(gòu)象的變化，能使另一些原子暴露在微環(huán)境中。這些事實(shí)導(dǎo)致只能用實(shí)驗(yàn)的方法來確定滿足分配要求的操作條件。5、影響物質(zhì)分配的因素a\雙水相中聚合物組成的影響雙水相系統(tǒng)很大程度上取決于使用的聚合物類型，當(dāng)兩種不同聚合物的溶液混合時(shí)，可能存在三種情況：a完全混溶性(勻相溶液)；b物理的不相溶性(相分離)；c復(fù)雜的凝聚(相分離,聚合物聚集在同一相中，純?nèi)軇?水聚集在另一相中)。離子和非離子聚合物都可以使用在雙水相系統(tǒng)的構(gòu)成上，但是，當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時(shí)，它們互相吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。b\雙水相系統(tǒng)物理化學(xué)性質(zhì)的影響雙水相系統(tǒng)的性質(zhì)主要取決于下列物理化學(xué)參數(shù)：密度(ρ)和兩相間的密度差，黏度(μ)和兩相間的黏度差以及表面張力(σ)。c\鹽和緩沖液的影響鹽的種類和濃度對(duì)分配系數(shù)的影響主要反映在對(duì)相間電位和蛋白質(zhì)疏水性的影響。在雙聚合物系統(tǒng)中，無(wú)機(jī)離子具有各自的分配系數(shù)，不同電解質(zhì)的正負(fù)離子的分配系數(shù)個(gè)同，當(dāng)雙水相系統(tǒng)中含有這些電解質(zhì)時(shí)，由于兩相均應(yīng)各自保持電中性，從而產(chǎn)生不同的相間電位，因此，鹽的種類(離子組成)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分配系數(shù)，鹽濃度不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。例如，PEG/KPi系統(tǒng)中上、下相(或稱輕重相)的PEG和磷酸鉀濃度以及Cl離子在上、下相中的分配平衡隨添加NaCl濃度的增大而改變。這種相組成即相性質(zhì)的改變直接影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。離子強(qiáng)度對(duì)不同蛋白質(zhì)的影響程度不同，利用這一特點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)中的鹽濃度，可有效地萃取分離不同的蛋白質(zhì)。d/溫度的影響溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，因而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時(shí)，溫度的影響很小，1-2度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，不需冷卻。這是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，常溫下蛋白質(zhì)一般不會(huì)發(fā)生失活或變性；(2)常溫下溶液粘度較低，容易相分離；(3)常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用。附：雙水相中的分配及影響因素與溶劑萃取相同，溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用m=c2/c1表示。為簡(jiǎn)便起見，用c1和c2分別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質(zhì)的總濃度。影響雙水相系統(tǒng)中溶質(zhì)分配平衡的因素非常復(fù)雜，很難建立完整的熱力學(xué)理論體系。從雙水相萃取過程設(shè)計(jì)的角度出發(fā)，確定影響分配系數(shù)的主要因素是非常重要的。已有的大量研究表明，生物分子的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)與雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用等。因此，分配系數(shù)是各種相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分別為靜電作用、疏水作用和生物親和作用對(duì)溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻(xiàn)。6、雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用最重要的領(lǐng)域是蛋白質(zhì)的分離和純化，如表所示。應(yīng)用技術(shù)例：親合分配雙水相萃取技術(shù)高分子聚合物上引入親和配基；抗體結(jié)合到乙二醇上作為免疫性專一親和配基，通過雙水相萃取將人紅細(xì)胞與兔紅細(xì)胞分離。乙二醇抗體人紅細(xì)胞兔紅細(xì)胞back三、超臨界萃取利用組分與雜質(zhì)在超臨界流體SCF中溶解度不同達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。PSCFGLST同溫同壓下同物質(zhì)的液氣相的物理特性不同，當(dāng)溫度和壓力達(dá)到某特定數(shù)值時(shí)，氣液特性趨于相同，此數(shù)值為臨界點(diǎn)，當(dāng)溫度和壓力超過此點(diǎn)時(shí)，兩相變?yōu)橐幌?，此態(tài)下之流體稱為超臨界流體。超臨界流體(SCF)是指處于臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)以上，其物理性質(zhì)介于氣體與液體之間的流體1、超臨界流體超臨界流體特性相密度(g/ml)擴(kuò)散系數(shù)(cm2/s)粘度(g/cm.s)氣體(G)10-3

10-1

10-4

超臨界流(SCF)0.3～0.910-3～10-4

10-4～10-3

液體(L)110-5

10-2

超臨界流體物理特性和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間：具有和液體同樣的溶解能力，密度比氣體大得多，擴(kuò)散系數(shù)接近氣體，黏度大低于液體的。這種流體(SCF)兼有氣液兩重性的特點(diǎn)，它既有與氣體相當(dāng)?shù)母邼B透能力和低的粘度，又兼有與液體相近的密度和對(duì)許多物質(zhì)優(yōu)良的溶解能力。超臨界流體萃取原理溶質(zhì)在某溶劑中的溶解度與溶劑的密度呈正相關(guān)，SCF也與此類似。因此，通過改變壓力和溫度，改變SCF的密度，便能溶解許多不同類型的物質(zhì)，達(dá)到選擇性地提取各種類型化合物的目的。例如：溶解度大的物質(zhì)溶解在超臨界流體中，然后升溫或降壓，使其變成氣態(tài)而得到所需物質(zhì)。常見的超臨界流體2、超臨界流體萃取分離的流程圖超臨界流體萃取技術(shù)超臨界流體萃取儀(1)超臨界流體及提供系統(tǒng)(2)萃取器(3)阻力器(4)樣品收集器超臨界流體的操作方式(1)動(dòng)態(tài)法(2)靜態(tài)法(3)循環(huán)萃取法例：CO2超臨界萃取工藝(1)萃取.在萃取罐中進(jìn)行;(2)分離.在分離罐中進(jìn)行.萃取罐分離罐根據(jù)分離方法不同分離工藝有：1、等壓分離通過溫度變化進(jìn)行溶質(zhì)分離；2、等溫分離通過壓力變化使溶質(zhì)分離；3、吸附分離利用吸附劑將溶質(zhì)從超臨界CO2中吸附分離。在超臨界流體中加入少量夾帶劑提高分離效果。超臨界分離工藝壓縮機(jī)

萃取釜

制冷MVC-760L

二氧化碳循環(huán)泵

設(shè)備圖超臨界流體萃取設(shè)備圖1.先送空氣開關(guān)，指示燈亮后，啟動(dòng)綠色電源按鈕；2.接通制冷開關(guān)和水循環(huán)開關(guān)；3.設(shè)定萃取缸，分離釜1和分離釜2的溫度，接通加熱開關(guān)；4.在萃取缸，分離釜1和分離釜2的溫度達(dá)到設(shè)定溫度后，將CO2通入萃取缸，等壓力平衡后，打開放空閥排除空氣，關(guān)閉放空閥；4.加壓。將電極點(diǎn)撥到所需的壓力，啟動(dòng)壓縮泵，加壓到所需壓力；6.每隔15分鐘從分離釜1和2取樣一次并稱重；7.萃取完成后，關(guān)閉冷凍機(jī)，泵和各種加熱循環(huán)開關(guān)，再關(guān)閉總電源；8.萃取釜內(nèi)壓力放入后面分離器，待萃取釜內(nèi)壓力和后面壓力平衡后，再關(guān)閉閥門3，5，打開放空閥門4，待萃取缸中沒有壓力時(shí)，打開萃取缸蓋，取出料筒，整個(gè)萃取過程結(jié)束。超臨界流體萃取的操作步驟超臨界流體技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)溶解度可調(diào)節(jié)；溶劑與產(chǎn)品易分離；無(wú)溶劑殘留；溶劑價(jià)格便宜，無(wú)毒，來源豐富。缺點(diǎn)操作壓力較高；溶劑的壓縮成本；設(shè)備投資大；可供挑選的溶劑種類少。3、超臨界流體技術(shù)的應(yīng)用