土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)教學文案

課題2土壤(tǔrǎng)中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)第一頁，共29頁。課題(kètí)背景1、關于(guānyú)尿素尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。但是它不能直接被農作物吸收。只有(zhǐyǒu)當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌分解尿素的原因——脲酶土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O第二頁，共29頁。課題(kètí)目的：一、從土壤中分離出能夠(nénggòu)分解尿素的細菌二、統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟(jiūjìng)含有多少這樣的細菌第三頁，共29頁。一、如何從土壤中分離出能夠分解尿素(niàosù)的細菌？土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱。同其他(qítā)生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。尤其是在富含有機質的土壤中，有更多的微生物。而這些微生物中只有一小部分能夠分解尿素。那么如何能從眾多的微生物中篩選出能夠分解尿素的細菌呢？第四頁，共29頁。資料(zīliào)一：思考：1、科學家為什么能從熱泉中篩選(shāixuǎn)出耐高溫的Taq細菌？DNA多聚酶鏈式反應（PCR）是一種在體外將少量DNA大量復制(fùzhì)的技術，而此項技術的實施必須使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。美國微生物學家托馬斯·布魯克于1966年在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)了水生耐熱細菌Taq，并從它體內分離出了耐高溫的TaqDNA聚合酶。因為熱泉溫度為70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細菌被篩選出來。第五頁，共29頁。啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)(gēnjù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。2、從上述(shàngshù)資料中你能得到什么啟示？第六頁，共29頁。實驗室中微生物的篩選，也是應用同樣的原理：即人為提供有利于目的菌株生長(shēngzhǎng)的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長(shēngzhǎng)。也就是利用選擇培養(yǎng)基篩選出你想要的目的菌株。比如：不加氮源的培養(yǎng)基——固氮菌不加碳源的培養(yǎng)基——自養(yǎng)微生物加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基——金黃色葡萄球菌

允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他(qítā)種類微生物生長的培養(yǎng)基。第七頁，共29頁。以尿素(niàosù)為唯一氮源的培養(yǎng)基——能夠分離尿素(niàosù)的細菌只有能分解尿素的細菌才能分解尿素，以尿素作為氮源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而無法生長繁殖(fánzhí)，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出能夠分解尿素的細菌。思考：什么樣的培養(yǎng)基能選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)出能夠分離尿素的細菌呢？第八頁，共29頁。思考：1、該培養(yǎng)基中有哪些成分？它們分別為微生物生長提供(tígōng)了什么營養(yǎng)？2、從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上看屬于哪類？第九頁，共29頁。1、顯微鏡直接計數(shù)法——全部細菌數(shù)利用(lìyòng)血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。統(tǒng)計(tǒngjì)菌落數(shù)目的方法：二、如何統(tǒng)計每克土壤(tǔrǎng)樣品中究竟含有多少這樣的細菌？2、稀釋涂布平板法——活菌數(shù)（最常用）3、濾膜法第十頁，共29頁。計算方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C—某一稀釋(xīshì)度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V—涂布平板時所用的稀釋(xīshì)液的體積(ml)，M—稀釋(xīshì)倍數(shù)。當樣品的稀釋(xīshì)度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋(xīshì)液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。原理(yuánlǐ)：稀釋涂布平板法：第十一頁，共29頁。注意事項：①為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板進行計數(shù)。②設置重復組：為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的培養(yǎng)皿中，經涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③設置對照組：將不加土樣的培養(yǎng)基置于相同(xiānɡtónɡ)條件下進行培養(yǎng)，作為空白對照。④統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。因為當兩個或多個細胞(xìbāo)連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。第十二頁，共29頁。討論題1：兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤(tǔrǎng)樣品中的細菌數(shù)。在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結果。1、第一位同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。2、第二位同學在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結果。分析：你認為哪位同學的結果更接近真實值？你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？

甲只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。乙有一個平板與另外兩個(liǎnɡɡè)平板相差很大，說明操作過程可能有誤，必須重做實驗。1、實驗時必須設置(shèzhì)重復組，至少要涂布3個平板。2、分析結果時，一定要考慮所設置(shèzhì)的重復組結果是否一致，結果不一致，意味著操作有誤，需要重做實驗。第十三頁，共29頁。討論題2：在做本課題的實驗時，A同學從對應106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落。但是，其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。其他同學認為A同學的結果有問題。他們分析可能是A同學的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質，因而導致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基上生長。但是，A同學確信自己的實驗操作(cāozuò)準確無誤，與其他同學的結果之所以不相同，是因為自己所選用的土壤樣品不同。但是，A同學在設計實驗的時候并沒有設置對照，因而此時也拿了不出令人信服的證據(jù)。分析：你能通過設置對照，幫助A同學學排除上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？第十四頁，共29頁。通過這個事例可以看出(kànchū)，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案(fāngàn)一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加(bùjiā)土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。

如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾第十五頁，共29頁。三.實驗的具體操作（一）.土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）.制備培養(yǎng)基制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白(dànbái)胨固體培養(yǎng)基。篩選出能夠(nénggòu)分解尿素的細菌與選擇培養(yǎng)基作對照，檢測選擇培養(yǎng)基是否(shìfǒu)具有選擇作用第十六頁，共29頁?！魬诨鹧媾苑Q取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程(guòchéng)中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度一般分離土壤中細菌，選用(xuǎnyòng)104、105、106倍的稀釋度分離土壤中放線菌，選用(xuǎnyòng)103、104、105倍的稀釋度分離土壤中真菌，選用(xuǎnyòng)102、103、104倍的稀釋度◆第一次實驗可將稀釋度放寬一點，選擇103~107（三）樣品(yàngpǐn)的稀釋第十七頁，共29頁。思考：為什么分離不同的微生物要采用(cǎiyòng)不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：不同微生物在土壤中的含量不同。目的：保證(bǎozhèng)能從中選擇出菌落數(shù)在30~300間的平板進行計數(shù)。第十八頁，共29頁。（四）.取樣(qǔyàng)涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記(biāojì)。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻?rúguǒ)得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果(rúguǒ)同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗操作有誤，需要重新實驗。第十九頁，共29頁。（五）.微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察◆在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。◆不同的微生物會表現(xiàn)出不同的菌落特征，包括菌落的形狀、大小、顏色和隆起程度等等(děnɡděnɡ)。這也是區(qū)別不同微生物的關鍵?！襞囵B(yǎng)(péiyǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)(péiyǎng)溫度和時間。細菌：30～37℃培養(yǎng)(péiyǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)(péiyǎng)5～7d霉菌：25～28℃培養(yǎng)(péiyǎng)3～4d。第二十頁，共29頁。第二十一頁，共29頁。四、結果分析與評價1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。2.樣品的稀釋操作是否成功：如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。3.重復組的結果是否一致：如果學生(xuésheng)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結果應該接近。如果結果相差太遠，則可能操作有誤，需要重做試驗。第二十二頁，共29頁。五、操作(cāozuò)提示無菌操作(cāozuò)做好標記(biāojì)規(guī)劃時間

第二十三頁，共29頁。六.課外延伸菌種的進一步鑒定：細菌合成的脲酶將尿素(niàosù)分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高。那么我們就可以在以尿素(niàosù)為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑變紅，說明該細菌能夠分解尿素(niàosù)。加入(jiārù)酚紅指示劑的培養(yǎng)基從功能上劃分屬于什么培養(yǎng)基？第二十四頁，共29頁。濾膜法：測定飲水(yǐnshuǐ)中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)呈黑色中心,有或無金屬光澤伊紅美藍培養(yǎng)基從功能上劃分(huàfēn)屬于什么培養(yǎng)基？第二十五頁，共29頁。練習1、需要在火焰旁操作的有（）①土壤取樣

②稱取土壤

③稀釋土壤溶液

④涂布平板

⑤微生物的培養(yǎng)．A．①②④

B．①④⑤

C．②③⑤

D．

②③④2、在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑的目的是（）A.

篩選出能分解尿素的細菌B．培養(yǎng)基中缺乏酚紅指示劑作細菌的營養(yǎng)C．對分離(fēnlí)的菌種作進一步的鑒定D．如指示劑變藍就能準確認定該菌能分解尿素3、測定土壤中細菌數(shù)量一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)，而測定真菌的數(shù)量一般選用102、103和104倍稀釋，其原因是()A．細菌個體小，真菌個體大B．細菌易稀釋，真菌不易稀釋C．細菌在土壤中數(shù)量比真菌多D．隨機的，沒有原因4、分離(fēnlí)土壤中分解尿素的細菌，對培養(yǎng)基的要求是()①加尿素②不加尿素③加瓊脂④不加瓊脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸鹽⑧不加硝酸鹽A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦第二十六頁，共29頁。5.下列說法不正確的是（）A.科學家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值C.設置對照實驗的主要(zhǔyào)目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。6、實驗測定鏈霉素對3種細菌的抗生素效應，用3種細菌在事先準備好的瓊脂平板上畫3條等長的平行線(3條線均與圖中的鏈霉素帶接觸)，將平板置于37℃條件下恒溫培養(yǎng)3天，結果如圖所示。從實驗結果分析，以下敘述不正確的是()A．鏈霉素能阻止結核菌的生長B．鏈霉素對結核菌比對霍亂菌更有效C．鏈霉素對結核菌比對傷寒菌更有效D．鏈霉素可以用于治療傷寒病人第二十七頁，共29頁。7、用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，需要設置的對照是()A．未接種的選擇培養(yǎng)基B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D．接種了的選擇培養(yǎng)基8、下列是關于“檢測土壤中細菌總數(shù)”實驗操作的敘述中，錯誤的是()A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1mL，分別涂布于各組平板上C．將實驗組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24～48hD．確定(quèdìng)對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的