醫(yī)學(xué)免疫學(xué)熒光免疫技術(shù)資料

熒光(yíngguāng)免疫技術(shù)第一頁，共18頁?；靖拍羁乖贵w反應(yīng)具有高度特異性熒光物質(zhì)的檢測具有靈敏性和直觀性熒光免疫技術(shù)是將兩者有機的結(jié)合起來將熒光物質(zhì)與抗原（抗體）連接(liánjiē)，形成熒光標(biāo)記物再與相應(yīng)的抗體（抗原）發(fā)生反應(yīng)，檢測反應(yīng)體系中的熒光強弱及存在部位用于物質(zhì)的定性、定量、定位檢測按技術(shù)原理及用途分為熒光抗體染色技術(shù)用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標(biāo)本中的抗原或抗體進行鑒定和定位檢測熒光免疫測定對體液標(biāo)本中的抗原或抗體進行定量檢測，有均相和非均相兩種第二頁，共18頁。熒光抗體染色(rǎnsè)技術(shù)基本原理在基質(zhì)片上，通過抗原抗體的反應(yīng)，連接上熒光素標(biāo)記的的抗體，借助(jièzhù)熒光顯微鏡觀察有無熒光及部位，最終作出定性、定位的判定技術(shù)要求基質(zhì)片熒光抗體熒光顯微鏡第三頁，共18頁?；|(zhì)(jīzhì)片將標(biāo)本固定在玻片上而形成，含有已知或待測抗原根據(jù)標(biāo)本來源不同可分為組織印片、組織切片(qiēpiàn)、細胞涂片、細菌涂片制備好的基質(zhì)片應(yīng)盡快染色或置－20℃保存第四頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體用化學(xué)的方法將熒光物質(zhì)共價連接在抗體上而形成熒光的基本知識自然界某些物質(zhì)能從外界吸收(xīshōu)能量（光能、化學(xué)能），外層電子發(fā)生躍遷，進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回復(fù)至基態(tài)時，多余的能量以光能的形式釋放，產(chǎn)生熒光，可分為光致熒光、化學(xué)熒光、X線熒光熒光物質(zhì)不會將全部吸收(xīshōu)的能量都轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒?，在此過程中，吸收(xīshōu)能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獾陌俜致史Q為熒光效率。熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力減弱甚至不能發(fā)射熒光稱為熒光的淬滅使熒光發(fā)生淬滅的因素有：長時間激發(fā)光照射、某些化學(xué)物質(zhì)（苯胺、酚、硝基苯、鹵化物等）環(huán)境因素對熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光強度有影響（pH、溫度、熒光素的濃度、基質(zhì)片上的固定劑等）第五頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體作為標(biāo)記的熒光物質(zhì)應(yīng)具備的條件與蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定結(jié)合，標(biāo)記容易，結(jié)合后不影響(yǐngxiǎng)蛋白質(zhì)活性熒光效率高熒光色澤與背景色澤對比鮮明物質(zhì)易得，來源廣泛第六頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體熒光抗體(kàngtǐ)染色技術(shù)中常用的標(biāo)記熒光物質(zhì)最大吸收(xīshōu)波長最大發(fā)射波長異硫氰酸熒光素（FITC）四乙基羅丹明（RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）藻紅蛋白495nm570nm550nm490～560nm525nm，黃綠色595nm，紅色595nm，紅色620nm，橙紅色在其他熒光免疫技術(shù)中的熒光物質(zhì)：鑭系金屬、酶作用產(chǎn)生熒光的物質(zhì)（MUG）第七頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體制備FITC中含活性基團（－N＝C＝S）在堿性條件下能與蛋白質(zhì)中賴氨酸的NH2發(fā)生反應(yīng)，使兩者共價結(jié)合在堿性條件下（CB），將待標(biāo)記蛋白質(zhì)與FITC按一定比例(bǐlì)混合，反應(yīng)一段時間生成物經(jīng)分離純化、鑒定合格后小瓶分裝，低溫下保存需去除的有游離的FITC、過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)、標(biāo)記的非特異性抗體按公式計算F/P的值，一般固定標(biāo)本1.5、活細胞染色2.4為宜第八頁，共18頁。熒光(yíngguāng)顯微鏡用于觀察熒光的特殊裝置除與普通的顯微鏡一樣能觀察細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)外，還應(yīng)有光源作為激發(fā)光，引起熒光的發(fā)出濾光片隔熱濾光片、激發(fā)濾光片、吸收濾光片聚光器觀察到的熒光包括特異性熒光由抗原抗體反應(yīng)后，熒光抗體結(jié)合在基質(zhì)(jīzhì)片上，所發(fā)出的熒光非特異性熒光背景熒光洗滌不徹底，熒光抗體非特異性吸附交叉反應(yīng)第九頁，共18頁。熒光(yíngguāng)抗體染色法技術(shù)類型直接法間接(jiànjiē)法補體結(jié)合法雙標(biāo)記法第十頁，共18頁。直接(zhíjiē)法原理(yuánlǐ)待測標(biāo)本熒光抗體熒光方法簡單、快速、特異，靈敏度低，每檢測一種抗原，需制備相應(yīng)的熒光抗體。常用于細胞、病毒(bìngdú)的快速檢測、腎活檢和皮膚活檢第十一頁，共18頁。間接(jiànjiē)法原理(yuánlǐ)已知抗原待測抗體熒光素標(biāo)記的抗抗體熒光方法(fāngfǎ)靈敏、檢測過程中只需制備一種熒光素標(biāo)記的抗體。常用于自身抗體的檢測標(biāo)記的抗體為針對所檢測物種所分泌的免疫球蛋白第十二頁，共18頁。補體結(jié)合法原理(yuánlǐ)已知抗原待測抗體抗補體熒光方法靈敏(línɡm(xù)ǐn)、熒光抗體也只需一種，但操作繁瑣、影響因素多，不常用熒光(yíngguāng)素標(biāo)記的抗體為抗補體的抗體第十三頁，共18頁。雙標(biāo)記(biāojì)法原理用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記兩種特異性抗體，再與基質(zhì)片作用后，用熒光顯微鏡觀察，以熒光的顏色來判斷(pànduàn)相應(yīng)抗原存在的情況第十四頁，共18頁。時間(shíjiān)分辨熒光免疫測定基本概念熒光免疫技術(shù)對物質(zhì)進行(jìnxíng)檢測時，待測物質(zhì)的含量與生成物熒光的強度存在著量的關(guān)系在激發(fā)光照射后一段時間，除特異性熒光外，反應(yīng)體系中還可能存在著其他非特異性熒光，以這段時間內(nèi)的熒光強度代表反應(yīng)體系的熒光強度，會導(dǎo)致結(jié)果的偏差激發(fā)光照射后經(jīng)過一段時間，待非特異性熒光消失，而特異性熒光仍然存在，這時再測量反應(yīng)體系的熒光強度標(biāo)記物應(yīng)用熒光壽命比非特異性熒光壽命長的熒光素第十五頁，共18頁。時間分辨(fēnbiàn)熒光免疫測定標(biāo)記物三價鑭系(Eu、Sm、Tb、Nd、Dy)金屬離子(lízǐ)螯合物熒光特點熒光壽命長（比非特異性熒光壽命長5～6個數(shù)量級）激發(fā)光（340nm）與發(fā)射光（613nm）相差大，易分開激發(fā)光譜寬（增加激發(fā)能）、發(fā)射光譜窄（降低本底熒光）熒光標(biāo)記相對比活性高第十六頁，共18頁。時間分辨(fēnbiàn)熒光免疫測定技術(shù)類型固相雙位點夾心(jiāxīn)法固相抗原競爭法固相抗體競爭法第十七頁，共18頁。熒光(yíngguāng)偏振免疫測定原理熒光素標(biāo)記的物質(zhì)分子(fēnzǐ)量越小，運動越快，被偏振光激發(fā)后，發(fā)射的偏振熒光越弱，反之在反應(yīng)體系中，待測抗原、熒光素標(biāo)記抗原競爭結(jié)合相應(yīng)抗體，待測抗原濃度高，