李建華老師課件

液相色譜儀日常維護(hù)及維修上海市藥檢所化學(xué)室李建華液相色譜儀結(jié)構(gòu)組成流動相脫氣機泵進(jìn)樣器柱溫箱柱后衍生化裝置檢測器流動相試劑有機相：光學(xué)純或HPLC級水：必須是新鮮的去離子水其它試劑：分析純或更高注意：使用前均用相應(yīng)的濾膜濾過（≤0.45μm）溶劑使用注意點濾膜聚四氟乙烯膜-雙相尼龍66膜可過水和大多數(shù)有機溶劑醋酸纖維素濾膜適用于水性溶液（尤其是蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相關(guān)樣品）再生纖維素濾膜適用于水溶性生物樣品和有機溶劑。注意：1.水膜和有機濾膜千萬不可混用！??！

2.分別濾過的水相與有機相的混合。

液相常用的溶劑過濾裝置溶劑過濾器檢查溶劑過濾器清洗垂熔玻璃濾器：不銹鋼燒結(jié)濾器：可用超聲清洗流動相脫氣脫氣作用脫氣方式原理：1.低壓脫氣

2.氦氣脫氣

3.超聲波脫氣流動相脫氣作用流動相脫氣方式1．低壓脫氣法電磁攪拌水泵抽空，可同時加溫或向溶劑吹氮。由于抽空和加溫都會導(dǎo)致溶劑蒸發(fā)，對二元或多元洗脫液的組成會有影響，故此法適用于單一組成的洗脫液。2．氦氣脫氣法將氦氣通過一圓筒過濾器通入沖洗劑中，在o．5ks／cm2壓力下保持10一15min，用氦氣的小氣泡將溶于溶劑中的空氣帶出。此法簡單方便，適用于所有洗脫液，只是氦氣較貴。3．超聲波脫氣法將洗脫液瓶置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)超聲脫氣。一般500m1溶液約需20一30min。此法方便，適于采用。三種脫氣方式比較

脫氣方式脫氣效果能否在線對基線漂移影響氦氣脫氣好能噪音較低，易基線漂移超聲脫氣一般（需加真空）不適合/真空脫氣較好能噪音、基線漂移均較小在線脫氣應(yīng)用細(xì)節(jié)氦氣脫氣：氦氣起始流速一般設(shè)置30ml/min左右，維持時間根據(jù)流動相體積來確定，分析時維持流速一般設(shè)置5ml/min左右。真空在線脫氣：脫氣機每個通道的流動相相對固定，這樣可避免相互干擾。更換溶劑排液要充分，并且要注意脫氣機最大流速。真空脫氣機聯(lián)接真空脫氣機工作原理脫氣機維護(hù)溶劑過濾器清洗溶劑更換不用通道溶劑更換或封堵排液時要根據(jù)脫氣機類型選擇流速、時間。注意：由于大部分連接頭和芯子都是塑料的，擰緊時千萬不可太用力。脫氣機故障脫氣機故障原因判斷真空泵故障：短接真空泵進(jìn)、出口管路真空腔漏連接密封性溶劑半透膜破裂泵分類：1.作用原理

2.輸液方式

應(yīng)用：單元泵多元泵：1.低壓混合：比例閥

2.高壓混合：混合器液相色譜的溶劑輸送系統(tǒng)溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓、高壓混合比較低壓混合四元泵工作原理低壓混合四元泵結(jié)構(gòu)Agilent1100泵結(jié)構(gòu)密封墊沖洗裝置密封墊沖洗應(yīng)用泵應(yīng)用細(xì)節(jié)使用的流動相要與泵的壓縮因子配對。特別是用梯度混合時。對四元泵比例閥來說,密度大的流動相放下方（常規(guī)是水相溶劑應(yīng)放在下方,有機溶劑放在上方）。二元或四元泵的沖程調(diào)小可獲得較好的混合效果，但會影響密封墊壽命。梯度或比例閥的準(zhǔn)確性可測定。泵維護(hù)泵維護(hù)不同用途時溶劑選擇目的溶劑注釋安裝后異丙醇排除系統(tǒng)中空氣效果最好正相與反相間轉(zhuǎn)換異丙醇與兩相溶劑互溶性均較好安裝后甲醇或乙醇如沒有異丙醇，可代替（第二種選擇）使用緩沖液后沖洗系統(tǒng)重蒸水再溶解緩沖液結(jié)晶效果最好更換溶劑后（反相）重蒸水防止緩沖液結(jié)晶析出正相密封墊安裝后異丙醇-己烷（5：95）潤濕效果好液相泵后常用在線過濾器帶可更換濾芯的在線過濾器圖例樣品過濾器溶劑過濾器過濾器元件泵維護(hù)多通道梯度閥進(jìn)、出口單向閥清洗出口過濾閥清洗或更換SealWash的清洗及密封墊更換泵密封墊更換石英柱塞桿清潔、更換維護(hù)信息密封圈拆洗泵密封圈更換泵密封圈更換注意點：1.柱塞用牙膏棉球擦洗一下。2.密封圈在甲醇中浸泡5分鐘用專用工具安裝。3.泵座用水清洗一下。4.密封圈（注意不同類型）密封墊磨合常見泵故障和診斷多通道梯度閥漏泵前出現(xiàn)氣泡壓力不穩(wěn)泵不出流動相（松開purge閥）進(jìn)、出口單向閥漏或堵塞壓力高泵壓力不正常原因氣泡進(jìn)、出口單向閥故障密封墊或柱塞桿磨損管路滲漏或堵塞比例閥故障壓力傳感器故障比例閥混合鹽濃度太高進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器：1.墊塞進(jìn)樣

2.閥進(jìn)樣自動進(jìn)樣器：ManualInjectorValves-SixPortFixedLoopToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromPumpToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnCommonProblemsImpropersyringesizeortypeValveBlockageInjection-portleakageSamplecarryoverCross-portleaks

手動進(jìn)樣閥手動進(jìn)樣閥FrontViewInjectRearViewLoad-InjectSampleLoop手動進(jìn)樣器操作原理手動進(jìn)樣器操作原理手動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器：六通閥進(jìn)樣順序：INJ時插針，LOAD時注射，再加INJ時運行排空管翹起高度要與針口平行六通閥接口最好用Rheodyne專用接頭，減少死體積若用定量管來定量，則多進(jìn)樣（定量管體積1.5倍以上）轉(zhuǎn)子密封圈若漏，可先將三個定位螺絲擰緊5-10度（如無效再更換轉(zhuǎn)子）在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途，否則過高的壓力在柱頭上引起損壞。六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。

六通閥的使用手動進(jìn)樣器維護(hù)防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，。手動進(jìn)樣器維護(hù)手動進(jìn)樣器維護(hù)手動進(jìn)樣器維護(hù)轉(zhuǎn)子密封墊選擇Agilent1100自動進(jìn)樣器工作原理Agilent1100自動進(jìn)樣器工作原理自動進(jìn)樣條件優(yōu)化進(jìn)樣污染處理進(jìn)樣污染處理自動進(jìn)樣器維護(hù)進(jìn)樣座與針外壁要在診斷中的changeneedle狀態(tài)下，用水棉球及異丙醇棉球擦洗。若常用緩沖溶液，計量泵內(nèi)的柱塞與密封圈，六通閥上的定子與轉(zhuǎn)子密封圈要定期清洗。若六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈有劃痕，可將三個固定螺絲各擰緊5到10度。機械部分要保持清潔，若有灰塵需取出機械臂，除塵并加稀牛油。定量環(huán)要在Configure中定義，如100ul、500ul、900ul、1500ul。自動進(jìn)樣器維護(hù)更換針及針座更換轉(zhuǎn)子密封圈轉(zhuǎn)子密封圈磨損判斷：自動進(jìn)樣器常見故障柱溫箱連接頭、管線預(yù)熱器柱溫箱色譜柱HPLC連接用的接頭零死體積接頭不能使用的接頭HPLC常用的色譜柱接頭0.090in.0.130in.0.090in.0.170in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090in.0.080in.TroubleshootingLCFittings,PartII.J.W.DolanandP.Upchurch.LC/GCMagazine6:788(1988)連接管線

柱溫箱維護(hù)進(jìn)出柱溫箱的管路一定要嵌入槽口內(nèi)，以免折斷管路。予熱器要定期清洗，以防污染及堵塞。拆卸柱子要用兩個板手，以免毛細(xì)管折斷。使用peek管，要注意壓力不要超過200bar，否則管子會彈出。溫度設(shè)置比室溫低時，要注意有水冷凝析出。色譜柱分類預(yù)柱：分析柱預(yù)柱液相色譜的預(yù)柱按其安裝位置可分為兩種。一種是安裝在泵和注射器之間，目的是使校免受腐蝕性的或受污染了的流動相的損害。腐蝕性的流動相逐漸溶解預(yù)柱卞的硅膠填料，使其在到達(dá)分析柱之前就已變得飽和．因此不損害分析拄。另一方面，預(yù)柱可用來收集流動相中的痕量雜質(zhì)。在注射口前收集雜質(zhì)比在注射口后〔往前)收集雜質(zhì)好，因為在后一種情況下，有可能改變柱的選擇性或產(chǎn)生鬼峰-在有梯度系統(tǒng)的情況下，這種預(yù)柱可放在泵的出口，混合槽的前面，達(dá)一類預(yù)拄的填料部宜有一定的容量并易于填充。另一種預(yù)柱安裝在注射口和分析柱之間，這種預(yù)柱主要用來防止臟的樣品和已損壞的墊或其它材料進(jìn)入分析柱。這種預(yù)柱是要通過樣品的，所以與第一種不同，要求較高，它必須填充得很好，柱效較高，并且在功能上能和分析往匹配。另外，不管是和注射口的聯(lián)接還是和分析柱的聯(lián)接，都要注意盡量減少死體積，因為它是分析柱的一個延伸。預(yù)柱和保護(hù)柱由泵輸送的流動相預(yù)柱進(jìn)樣器保護(hù)柱分析柱至檢測器截留或濃縮柱

色譜柱的安裝What’sneeded:Therightconnectorstoavoidanyfutureleak.GuardcolumntoprotectthemaincolumnTherighttools

標(biāo)準(zhǔn)不銹鋼分析柱CapillaryS.S.FilterFrit2umPoreSizeColumnPackingAuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired)

卡套柱：帶可重復(fù)使用的末端接頭和一體化的保護(hù)柱柱芯無保護(hù)卡套柱芯有保護(hù)卡套柱芯帶Techtron卡套柱芯的Zorbax保護(hù)柱?Techtron柱芯含一體化的濾芯min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160BDSODSHypersil250-2mmwithintegratedGuardColumnBDSODSHypersil250-2mmwithoutGuardColumn2mm內(nèi)徑卡套柱有和無保護(hù)柱的比較高效液相色譜柱發(fā)展史19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10μm的無定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5～10μm球形硅膠。90年代早期，粒徑為5μm的高純硅膠，即所謂的B型硅膠被發(fā)展，并成為這個行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種B型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了3μm或3.5μm的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于2μm的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機和有機雜化硅膠。目前，市場上流行的分析用的HPLC硅膠基質(zhì)填料主要為B型硅膠。硅膠基質(zhì)材料目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。高機械強度和高的比表面積?？衫弥苯拥膹V泛的表面鍵合反應(yīng)來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。重現(xiàn)性好。pH適用范圍為pH2－8。具有容易導(dǎo)致強堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。聚合物基質(zhì)材料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。

pH穩(wěn)定性好：pH1－13。可以在很寬的范圍內(nèi)進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等pH條件下對強堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。分離效率相對硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好硅膠外形球形硅膠:現(xiàn)代HPLC填料粒徑小(5μm,3μm,<2μm)重現(xiàn)性好穩(wěn)定性好分離效率高無定型硅膠:最初的HPLC填料粒徑>5μm柱床穩(wěn)定性差比表面積較小價格便宜硅膠純度硅膠純度對強極性化合物的分離最重要。以前的純度較低的硅膠（稱為A型硅膠）,A型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。純度高、酸性較弱的硅膠(稱為B型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。硅膠純度M+表面金屬能與螯合化合物絡(luò)合MSiOH內(nèi)部的金屬對表面硅羥基具有活化作用強酸性A型硅膠C18B型硅膠C18硅膠孔徑孔徑作用和效能<60nm對HPLC分析沒有用，會引起峰形拖尾和較低的分離效率60–150nm對小分子的分離效果理想(MW<4,000to130,000),例如藥物分子、傳統(tǒng)的中藥和小分子的縮氨酸300–1,000nm對大分子的分離效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm對聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子硅膠粒徑粒徑作用和效能5μm目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3–3.5μm常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑<2μm常應(yīng)用于超快速分離，highthroughput,分離度高7–10μm常用于半制備色譜柱10–20μm常用于制備色譜柱HPLC色譜柱結(jié)構(gòu)類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20鍵合相鍵合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱<5%,正相:20%;

硅膠、-NH2、-CN其它(手性柱,離子交換柱):10%反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18和C8在反相色譜終應(yīng)用得最為廣泛。封尾封尾是用如三甲基硅烷等小分子與鍵合了C18以后的硅膠進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)。由于硅烷相對很大的體積，使得C18和其它鍵合相在發(fā)生鍵合反應(yīng)時只能覆蓋不到硅膠表面的50%。硅膠表面未被鍵合的酸性硅羥基將會與被分析物相互作用，特別是在中性條件下會對強堿性化合物產(chǎn)生嚴(yán)重的峰形拖尾。封尾工藝使得表面殘余的硅羥基被進(jìn)一步的消除，為小分子所取代。封尾工藝能促使色譜柱對極性和堿性化合物的分離具有良好的峰形?，F(xiàn)代高效液相色譜柱的要求超純B型球形硅膠——峰形好、柱效高。不能有使色譜性能降低的直徑小于50?的微孔。粒徑尺寸從3μm到10μm——能滿足從分析到制備色譜規(guī)模的需求。色譜柱柱床裝填好——使用壽命長、柱效高。封尾徹底——峰形好、使用壽命長。批與批之間得重現(xiàn)性好。不同的相具有不同的選擇性——能更好的實現(xiàn)分離。鍵合相化學(xué)穩(wěn)定好——適用的pH范圍廣,使用壽命長。色譜柱I.常見的問題，癥狀，及解決辦法-基線漂移/噪音-峰形-壓力變化-保留值變動II.預(yù)防性維護(hù)/良好的操作-在線裝置-樣品制備操作的限度III.再生/修復(fù)受損的色譜柱-物理阻塞化學(xué)改變I.常見的問題色譜柱的故障診斷--基線噪音可能的原因:檢測器的流動池變臟檢測器光源老化，能量不穩(wěn)如果是周期性的，可能是由于泵的脈動溫度對檢測器的影響氣泡經(jīng)過檢測器造成的波動Time(min.)電子放大線路不穩(wěn)定流動相溶劑未徹底脫氣色譜柱故障診斷--基線漂移電子線路不穩(wěn)定檢測器預(yù)熱時間不夠進(jìn)樣器中殘留，硬件與流動相不相容，如Peek材料與不合適的有機溶劑合用可能的原因梯度洗脫流動相不干凈溫度波動(對示差折光檢測器影響更大)流動相與色譜柱未達(dá)到平衡系統(tǒng)中污染物流失(硬件的化學(xué)兼容性)色譜柱故障診斷--鬼峰鬼峰-是指在未進(jìn)樣時也能出現(xiàn)的色譜峰20%-100%MeOH未進(jìn)樣601530150371517原因-流動相不干凈，尤其是弱極性流動相，RPC中水的純度比甲醇影響更大。-樣品的交叉污染(表明回收率降低)色譜柱故障診斷--峰形問題雙峰正常峰雙峰色譜柱柱床塌陷，出現(xiàn)死體積可能的原因：色譜柱柱床塌陷，出現(xiàn)死體積過濾片部分堵塞兩個組分共同流出，形成一個峰樣品溶劑不匹配色譜柱故障診斷--峰形問題所有的峰都變寬柱效降低，柱床塌陷進(jìn)樣體積(質(zhì)量)過大流動相黏度太大有些峰變寬上一次進(jìn)樣時未洗脫出來的峰峰變寬樣品溶劑與流動相不匹配樣品分子量太大，如蛋白質(zhì)或聚合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，即反應(yīng)峰色譜柱故障診斷--峰形問題峰拖尾對稱系數(shù)>1.2NormalTailingNormalTailing可能的原因:有些峰拖尾二次保留效應(yīng)，殘留的硅羥基影響在大峰的尾部有小峰流出柱頭處有交叉污染金屬影響所有的峰都拖尾柱外效應(yīng)柱已損壞樣品量或溶劑不合適柱過載，偶爾發(fā)生吸附曲線是反langmuir型色譜柱故障診斷--峰形問題可能的原因柱過載，偶爾發(fā)生小峰在大峰前流出NormalFronting伸舌峰對稱系數(shù)<0.9樣品溶劑不合適柱床塌陷柱過濾片部分堵塞色譜柱故障診斷--峰形問題負(fù)峰可能的原因：樣品吸光度比流動相低當(dāng)樣品溶劑通過色譜柱時干擾了系統(tǒng)的平衡示差折光檢測器常有的現(xiàn)象色譜柱故障診斷--峰變寬柱外體積增加*

進(jìn)樣口到柱、柱到檢測器之間使用內(nèi)徑小而短的毛細(xì)管連接*

確定所有的管路連接均采用了合適的接頭，接頭越少越好，接頭與連接管孔徑應(yīng)匹配*

使用體積小的檢測池*

進(jìn)樣體積盡量小柱外體積1.縮小連接管的內(nèi)徑和長度2.連接管的長度和內(nèi)徑盡量小進(jìn)樣體積不要超載使用合適體積的流動池E.C.V=Vinj.+Vtubing+VcellI.未進(jìn)樣的情況下柱壓不斷增加-泵密封-流動相中有顆粒-流動相的溶解度-流動相不穩(wěn)定(聚合反應(yīng))-柱內(nèi)形成死體積(與實驗條件有關(guān))II.

進(jìn)樣后柱壓增加-樣品中的顆粒-

樣品不溶于流動相-樣品中的組分與固定相發(fā)生不可逆鍵合色譜柱故障診斷--柱壓變化I.所有峰向低保留值漂移(酸,堿,中性化合物)-鍵合相流失-流動相不穩(wěn)定(較少見)-溶劑傳輸系統(tǒng)(流量)II.所有峰向高保留值漂移-在水/有機溶劑混合體系中有機溶劑流失-

色譜柱變化(較少見)-溶劑傳輸系統(tǒng)(流量)III.離子型化合物峰改變保留值-流動相中揮發(fā)性組分逸出(離子強度,pH改變)-

柱變化(鍵合相變化或污染)色譜柱故障診斷--保留值漂移I.與流動相有關(guān)的問題-將新制備的與陳舊的流動相比較 ·pH ·電導(dǎo)率 ·色譜測試II.與色譜柱有關(guān)的問題-測試新柱-

用標(biāo)準(zhǔn)樣品測試當(dāng)前的色譜柱-“清洗”色譜柱后再測試-考慮樣品基質(zhì)的影響以及色譜柱穩(wěn)定時采用的條件

色譜柱故障診斷--保留值漂移為什么色譜柱會失去作用?部分原因是色譜柱塞板或柱床被堵塞——導(dǎo)致色譜柱背壓上升、峰形拖尾和柱效下降。吸附了樣品雜質(zhì)——導(dǎo)致柱效下降、選擇性和保留時間改變。色譜柱沒裝填好——導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。物理損傷或受熱引起的缺口——導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。對硅膠基質(zhì)或鍵合相的化學(xué)腐蝕——導(dǎo)致選擇性變?nèi)?、峰形拖尾、保留能力下降（或?qū)A性化合物的保留能力增強）。操作條件流動相對色譜柱壽命的影響普通鍵合StableBond穩(wěn)定鍵合低pH(1-3)-由于酸催化水解導(dǎo)致鍵合相的流失*H3O+*

易水解的硅氧鍵操作條件流動相對色譜柱壽命的影響鍵合相水解速度隨溫度的升高而加大StableBondCN(二異丙基苯基CN)普通鍵合CN(二甲基丙基CN)低pH的淋洗液高溫(60C)操作條件流動相對色譜柱壽命的影響普通鍵合EclipseXDB(ExtraDenselyBonded超高密度鍵合)高pH(7-14)-硅膠溶解pH升高溫度升高磷酸鹽>硼酸鹽>有機溶劑溶解速度增加隨:柱壓升高

檢查有無色譜柱時的壓力：應(yīng)分段檢查；大多數(shù)情況下問題出在系統(tǒng)和保護(hù)柱上。

如果確定是色譜柱的壓力高：

沖洗柱–-除去柱污染物；大分子化合物；從樣品和緩沖溶液帶來的污染物

反沖柱壓力高----清洗柱入口濾片（20%硝酸水溶液--水）

色譜柱的清洗

以下溶劑每種至少25

mL（25cmx4.6mm)反相色譜柱的沖洗用比流動相強度大的溶劑

不含鹽的流動相100%甲醇100%乙腈75%乙腈:25%異丙醇100%異丙醇

100%二氯甲烷*100%正己烷**WhenusingeitherHexaneorMethyleneChloridethecolumnmustbeflushedwithIsopropanolbeforereturningtoyourreversed-phasemobilephase.色譜柱的清洗

每種溶劑至少用50mL；

50%甲醇:50%氯仿

100%乙酸乙酯；100%所用流動相（正己烷等）正相流動相的選擇——增強溶劑的強度在色譜柱安裝前、后測試壓力差如果柱兩端的反壓很高，反接色譜柱，再用10-20倍柱體積的流動相沖洗柱體后，再測試壓力差如果出現(xiàn)沉淀，(如：蛋白質(zhì)凝聚，細(xì)胞物，聚合物)設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如0.1%TFA/80%乙腈,6M鹽酸胍,THF,HFIP等清洗以除去堵塞物若仍無效，應(yīng)考慮更換過濾片色譜柱的修復(fù)和再生----物理性阻塞柱進(jìn)樣口濾片密封墊圈柱體FemaleEndFittingMaleEndFitting操作注意事項：帶手套填料不能變干不要接觸色譜柱體加熱填料會被擠出不要擰得過緊色譜柱故障診斷—更換進(jìn)樣口濾芯由于鍵合相水解或硅膠溶解而造成的色譜柱填料變化是不可逆的由于污染而產(chǎn)生的色譜柱變化可以通過適當(dāng)?shù)南辞迨怪迯?fù)梯度洗脫的方式(水->強有機溶劑)通常最有效低pH流動相,如0.1%TFA或0.01MH3PO4,也是有效的適當(dāng)升高溫度也有幫助(60-80°C)色譜柱的修復(fù)和再生----化學(xué)變化-I某些溶液，如6M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白質(zhì)的沉積某些填料(XDB,有機聚合物)，可使用高pH水/有機溶液，如：0.01MNaOH溶于50%異丙醇/水溶液。

硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時間(15-30min)。色譜柱的修復(fù)和再生----化學(xué)變化-II例子：4.6mmIDx15cmZorbax300SB-C18流速:1mL/min;溫度:~80°CA:0.1%TFA水溶液B:0.1%TFA乙腈溶液100%Afor30min.;0-100%Bover30min.;Hold100%Bfor30min.,Returnto100%Ain5min.重復(fù)3次色譜柱日常維護(hù)(1)每日開機時，流速和柱壓要逐漸增加，突然迅速增加，會使柱床受到?jīng)_擊，引起紊亂，產(chǎn)生空隙。(2)在注射樣品前要使色譜系統(tǒng)平衡，是否平衡可由基線加以判斷。(3)在注射樣品前，用手摸一下色譜系統(tǒng)的各個接頭，通常由此能發(fā)現(xiàn)柱是否有漏；漏得不嚴(yán)重時，可以用皮膚是否有冷感加以判斷?？諝鈺穆┛p進(jìn)入系統(tǒng)引起基線漂移，影響峰高和峰面積的重復(fù)性。

(4)不要把柱接頭擰得太緊。上得過緊容易損壞接頭螺紋，引起滲漏。擰螺絲時使用的扳手應(yīng)短一些，不宜太長。色譜柱日常維護(hù)(5)不要把柱子放在有氣流的地方或直接放在強光下，氣流和陽光都會使柱子產(chǎn)生溫度梯度，造成基線漂移，如果懷疑基線漂移是由溫度梯度引起的，可以設(shè)法使柱子絕熱或恒溫，也可用布(或毛巾)把柱和接頭包起來。

(6)如果儀器用來做常規(guī)分拆，樣品種類有限，但分析次數(shù)很多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。

(7)如果所注射的樣品會污染柱子，可以用合適的溶劑(幾百毫升)慢慢沖洗柱子過夜，第二天早晨再用流動相重新平衡校子(約30分鐘)。(8)在因裝卸、更換、貯存等而挪動柱子時，動作要輕，不要使其受到碰撞，以免柱床因震動產(chǎn)生空隙或通道。(9)柱要加標(biāo)簽，新舊分開，不要放在溫度變化很大的地方。當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉；色譜柱維護(hù)色譜柱的良好使用規(guī)范

溶劑使用前必須過濾避免使用高粘度的溶劑作為流動相運輸中變干了的色譜柱，使用時要完全浸濕了解樣品溶劑對溶解度及分離的影響進(jìn)樣樣品要提純，如果樣品中含有無需考慮而保留強的組分時,必須進(jìn)行前處理嚴(yán)格控制進(jìn)樣量清楚了解色譜柱填料適用的:pH范圍，溫度，化學(xué)適應(yīng)性色譜柱的良好使用規(guī)范

當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈避免操作不當(dāng)損壞色譜柱,如:猛敲,跌落或過緊擰接頭定期用強極性溶劑沖洗色譜柱使用新鮮的水溶液,要注意使用生物穩(wěn)定劑,如疊氮化鈉每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗舴治鲋L期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉柱子維護(hù)卸下柱子和入口接頭，可看到接頭孔隙。如果柱頭孔隙深度小于1厘米，可以來用下述局部重裝的辦法，否則，柱應(yīng)當(dāng)完全重裝或更換。柱入口局部重裝時采用的填料可以和柱內(nèi)原有填料一樣，也可以用玻璃珠。粒子大于20微米的可以用敲打充填法干裝。如果小于20微米則要用合適的溶劑配成淤漿，淤漿逐次加入，每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填滿后，用一把刮刀將續(xù)料刮乎．更換柱入口接頭，把柱重新接到液相色譜系統(tǒng)中，慢慢地增加流速和系統(tǒng)壓力，直到操作上限為止。讓相當(dāng)于l0一20倍柱體積的流動相通過柱子，然后逐漸降低柱流速，并使壓力降為零，再把柱子卸下來，并卸下入口接頭，觀察柱的入口，此時孔隙應(yīng)當(dāng)減小，但是由于新加入的填料在系統(tǒng)的操作壓力下壓縮柱頭，孔隙不可能一次就被全部充滿。重復(fù)上述局部至裝過程，直到柱上加不進(jìn)更多的粒子為止。一旦柱子填充完畢，可加進(jìn)混合樣品，測定柱子的性能是否已經(jīng)改善。柱維護(hù)對于嚴(yán)重污染的反相住，也可采用這樣的辦法：用泵依次打入水—甲醇-二氯甲烷-己烷，然后把此順序倒過來再打一遍，最后到水，不接檢測器。如果分析類脂化合物，也可使用易溶解油脂的溶劑．如50ml二氯甲烷．然后是50毫升甲醇。其它有