生物化學與分子生物學實驗(終版)

生物化學實驗技術(shù)生物技術(shù)專業(yè)實驗室王小英實驗內(nèi)容生物化學實驗基本操作實驗一雙縮脲法測定血清蛋白質(zhì)含量實驗二血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測定1、掌握刻度吸量管及分光光度計的使用方法。2、掌握分光光度法測定物質(zhì)含量的方法。3、熟悉實驗室規(guī)則，實驗報告的書寫要求。4、了解分光光度法的基本原理和溶液的混勻方法。一、[實驗目的]生物化學實驗基本操作實驗前必須認真預習。不曠課、不遲到、不早退。進入實驗室要穿白大衣，嚴禁穿拖鞋進實驗室，嚴禁實驗室內(nèi)進食。自覺遵守實驗室紀律，保持實驗室安靜。不要隨意走動和擺弄與本次實驗無關(guān)的儀器和物品。認真按照實驗步驟和操作規(guī)程進行。詳細記錄實驗數(shù)據(jù)，實驗完畢及時整理實驗數(shù)據(jù)，并提交實驗報告。（一）實驗室規(guī)則要愛護儀器，使用貴重精密儀器應嚴格遵守操作規(guī)程。實驗完畢及時在儀器記錄本上登記，如儀器發(fā)生故障應立即報告指導老師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。實驗完畢后，個人必須整理自己的實驗臺面。值日生負責做好實驗室的衛(wèi)生，檢查并關(guān)好水、電、門、窗。（二）實驗報告要求及格式

實驗X實驗名稱【實驗目的】【實驗原理】【實驗步驟】【實驗結(jié)果】【結(jié)果分析與討論】（三）刻度吸管的使用1、規(guī)格：0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0（ml）2、使用方法：左手拿球，右手拿管，食指控制液體量，吸液，吸管稍傾斜，抹管尖后調(diào)整液體量。食指輕輕旋轉(zhuǎn)，放出液體。3、使用注意事項（1）選管：所用吸管規(guī)格最好應稍大于或等于所吸的液體量。（2）抹管尖：在吸血清、標準液時，應用濾紙抹去管外多余的液體。（3）吹管：刻度吸量管注明“吹”字的應吹出殘液。（4）讀數(shù)：液體彎液面的最低點、刻度線上緣與視線在同一水平上。（5）洗管：吸血清的吸管，應及時洗清。（四）溶液的混勻1、指彈法2、旋轉(zhuǎn)混勻法3、顛倒混勻法4、渦旋振蕩器混勻法5、玻棒攪拌混勻法（五）分光光度計是運用分光光度法（即比色法）測定物質(zhì)含量的一種裝置。分光光度法：是根據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收及光的吸收定律，對物質(zhì)進行定性、定量的分析方法。它的理論依據(jù)是Lambert-beer定律（1）透光率（T）和吸光度（A）I0＝Ia＋It用表示光線透過溶液的能力，稱為透光率(transmitance,T)透光率的負對數(shù)稱為吸光度（absorbance,A）1、分光光度法的原理

A＝＝－lgT＝（2）光的吸收定律――Lambert－Beer定律A=KCL定義：一束單色光通過介質(zhì)溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。A：為吸光度C：為溶液濃度L：為溶液層厚度K：為吸光系數(shù)2、定量分析方法（1）標準曲線法標準曲線（A-c曲線）（2）標準對比法（三管法）A樣＝K樣·c樣·L樣A標＝K標·c標·L標同臺儀器，相同厚度吸收池及同一波長測定，故

K樣＝K標，L樣＝L標，所以：光的互補示意圖3、選用何種單色光通過溶液?互補色光：兩種適當顏色的單色光按一定強度比例混合可成為白光，這兩種單色光稱為互補色光4、分光光度計的基本結(jié)構(gòu)：光源單色器吸收池檢測器指示器分光光度計的基本結(jié)構(gòu)圖5、722型分光光度計的操作方法接電源，開開關(guān)，預熱30分鐘（打開暗盒）；選波長，選擇開關(guān)置于“T”，“調(diào)0”點；盛空白，裝樣品，關(guān)暗盒，調(diào)“100%”；將選擇開關(guān)置于“A”，拉動拉桿，記讀數(shù)；取出比色杯，關(guān)上暗盒及開關(guān)，拔掉電源；6、注意事項（1）為了防止光電管疲勞，不測定時必須將比色槽暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長電管使用壽命。（2）手拿比色杯粗面，裝液量一般占比色杯體積的2/3～3/4；（3）本型儀器A值在0.1～0.8之間誤差較小，準確度較高。實驗一雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量P135一、實驗目的1、掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的原理及操作方法2、了解血清總蛋白測定的臨床意義二、實驗原理什么是肽鍵？什么是雙縮脲？O2NH2-C-NH2H2N-CO-NH-CO-NH2+NH2尿素雙縮脲（-CO-NH-）雙縮脲反應三、實驗步驟1、“三管法”，取中號試管3支，按下表加入試劑：加入物（mL）管號測定管標準管空白管待測溶液0.05——蛋白標準液—0.6—0.9%NaCl2.952.43.0雙縮脲試劑3.03.03.0

37℃保溫10分鐘，722-分光光度計540nm波長以空白管調(diào)節(jié)零點比色，記錄各管吸光度。2、待測溶液蛋白含量計算：例如，已知蛋白標準液蛋白質(zhì)含量為5mg/mL，則（標準管）蛋白含量為1mg/mL，計算待測溶液蛋白含量為：

×1mg/mL×60（稀釋倍數(shù)）

=mg/mL四、注意事項血清及標準液取量應準確（刻度吸管的使用注意事項）。須于顯色后30min內(nèi)測定。五、臨床意義正常成人血清總蛋白含量為：60-80g/L。血清總蛋白增高：（1）血液濃縮，導致總蛋白濃度相對增高；（2）血漿蛋白質(zhì)合成增加：主要見于球蛋白合成增加，如多發(fā)性骨髓瘤患者。血清總蛋白降低：（1）血液稀釋，導致總蛋白濃度相對降低；（2）消耗增加：如甲狀腺功能亢進，惡性腫瘤等。（3）蛋白質(zhì)丟失：如腎病綜合征病人大量蛋白從尿液中丟失。六、思考題蛋白質(zhì)測定的方法有哪些？請簡述其原理？實驗二血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定——賴氏法P148一、實驗目的1、掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性測定的基本原理及方法。2、了解血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定的臨床意義。ALT測定方法速率法手工法賴氏法（30min）金氏法（60min）穆氏法（60min）三種方法的測定原理、操作、試劑和采用溫度等方面均完全相同，只是酶與底物反應的時間與正常參考范圍不同。二、實驗原理丙氨酸-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸1、轉(zhuǎn)氨基作用2、顯色反應=505nm加入物(ml)測定空白管測定管血清0.10.1基質(zhì)緩沖液－0.5混勻后，置37℃保溫30min2,4二硝基苯肼溶液0.50.5基質(zhì)緩沖液0.5－混勻后，置37℃保溫20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.01、測定管及測定空白管的制備三、實驗步驟加入物(ml)試劑空白管標準管0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.10.12.0mmol/L丙酮酸標準液00.05基質(zhì)緩沖液0.500.452,4-二硝基苯肼溶液0.50.5混勻，37℃水浴20min0.4mol/LNaOH溶液5.05.02、標準管及試劑空白管的制備3、室溫放置5min，在波長505nm處以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。四、實驗結(jié)果【參考范圍】5～25卡門氏單位。

測定管吸光度測定空白管吸光度標準管吸光度試劑空白管吸光度=28（卡門氏單位）酶活力計算：不做標準曲線時，可以做28卡門氏單位的標準管，按下式計算：五、注意事項1、吸血清、標準液的量要準確。2、充分混勻使反應充分。3、酶促反應的時間要把控好。4、嚴重脂血癥、黃疸及溶