辣椒中常見產(chǎn)毒性真菌的裸磁珠-多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法

辣椒中常見產(chǎn)毒性真菌的裸磁珠-多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法金燕;張薇薇;王溯源;葉正茂;張立實(shí);裴曉方【摘要】ObjectiveToestablishamethodfordetecting3commontoxigenicmolds(Aspergillus,Penicillium,andFusarium)basedonnon-modifiedmagneticbeadscoupledwithmultiplereal-timePCR(NMB-multipleqPCR).MethodsTheprimersandgenus-specificprobesweredesignedbasedontherDNAsequencestodevelopamultiplereal-timePCRusingnon-modifiedmagneticbeadtoenrichmentoffungalspores.Thesensitivity,specificityandrepeatabilityofthisassaywereevaluated.ResultsThedetectionlimitofthisassayforspikedsampleswas104CFU/g,demonstratinga10-foldgreaterdetectionsensitivityofthisassaythanthatofreal-timePCR.TheNMB-multipleqPCRassayalsoshowedgoodspecificityandreproducibilityandyieldedcomparableresultswiththosebytraditionalcolonycountingmethodforspikedsamples(P>0.05).ConclusionNMB-multipleqPCRassayweestablishedallowsrapidandsensitivedetectionofcommonmycotoxigenicfungiinpaprika.%目的：將多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與裸磁珠富集技術(shù)聯(lián)用，建立辣椒樣品中常見3類（曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬）產(chǎn)毒性真菌的快速定量檢測方法。方法根據(jù)真菌核糖體RNA（rDNA）基因序列選擇真菌廣譜引物及屬特異性探針，聯(lián)用裸磁珠富集技術(shù)，建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，并評價(jià)所建方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性和一致性。結(jié)果裸磁珠-多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏度高，與本研究優(yōu)化后的普通實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比提高了10倍，是原報(bào)道的100倍，直接檢測辣椒樣品中3類產(chǎn)毒性真菌的檢出限均可達(dá)103CFU/ml，即104CFU/g，且特異性良好（與非目標(biāo)菌無交叉反應(yīng)）、重復(fù)性良好（CV<1.5%），該方法模擬檢37h（7~14d）。結(jié)論構(gòu)PCR3【期刊名稱】《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》【年(卷),期】2015(000)001【總頁數(shù)】6頁(P23-28)【關(guān)鍵詞】產(chǎn)毒性真菌;裸磁珠富集;多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR;辣椒模型【作者】金燕;張薇薇;王溯源;葉正茂;張立實(shí);裴曉方【作者單位】四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，四川成都610041;成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610500;四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，四川成都610041;四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，四川成都610041;四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，四川成都610041;食品安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041;四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系，四川成都610041;食品安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041【正文語種】中文常見產(chǎn)毒性真菌，如曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和鐮刀菌屬（Fusarium），可在適當(dāng)條件下繁殖并產(chǎn)生有毒次級代謝產(chǎn)物真菌毒素，這些毒素已發(fā)現(xiàn)400多種，可致急、慢性中毒并存在“三致”（致癌、致畸、致突變）危害［1］。我國辣椒等香辛料受真菌及其毒素的污染情況嚴(yán)重，辣椒中真菌污染量可達(dá)103～106CFU/g，其優(yōu)勢菌主要為曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬真菌［2-5］，產(chǎn)生的真菌毒素如黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）和伏馬菌素（fumonisin，F(xiàn)B）等在香辛料中普遍存在，須對其進(jìn)行及時(shí)的預(yù)防和控制，許多國家及國際組織為此制定了真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)［6-7］。然而，對于真菌毒素危害的預(yù)防不能僅針對真菌毒素本身，對于產(chǎn)毒性真菌的監(jiān)測也同樣重要。傳統(tǒng)真菌定量檢測方法為計(jì)數(shù)培養(yǎng)法［8］，產(chǎn)毒性真菌鑒定則需要進(jìn)行分離鏡檢［9］，操作繁瑣費(fèi)時(shí)且依賴經(jīng)驗(yàn)，培養(yǎng)鑒定時(shí)間長達(dá)7～14d，存在嚴(yán)重滯后性，無法對污染進(jìn)行及時(shí)預(yù)警，因此迫切需要建立產(chǎn)毒性真菌快速定量檢測的方法。裸磁珠（non-modifiedmagneticbeads，NMB）具有在磁場中非特異性富集的特性，目前利用裸磁珠對細(xì)菌進(jìn)行富集的研究已有不少［10-12］，但針對真菌進(jìn)行富集的研究仍未見報(bào)道。因此本研究擬將裸磁珠與多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（multipleqPCR）技術(shù)聯(lián)用，利用裸磁珠富集能力提高方法檢出限，建立辣椒中常見三類產(chǎn)毒性真菌裸磁珠-多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（NMB-MultipleqPCR）的快速檢測方法，為辣椒等香辛料中常見產(chǎn)毒性真菌污染的監(jiān)測提供更為高效的技術(shù)方法。菌株與培養(yǎng)基本研究所使用標(biāo)準(zhǔn)菌株由廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司、中國普通微生物保藏中心提供及四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系保存，食品分離菌株由本研究前期調(diào)查獲得（表1），所用察氏、沙氏瓊脂、LB及麥康凱培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。材料與儀器樣品辣椒粉購自成都市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，真菌基因組DNA提取試劑盒購自BioFlux公司，10×ReactionBuffer、TaqDNApolymerase及pGM-T載體試劑盒購自TIANGEN公司，dNTPs購自Roche公司，引物由Invitrogen公司合成，TaqMan探針由上海生工公司合成，PCR擴(kuò)增儀為S1000ThermalCycler（Bio-Rad）。方法孢子懸液至無菌試管中充分振蕩，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)［13］并用生理鹽水調(diào)節(jié)所需孢子懸液濃度。稱取滅菌辣椒粉25g，加入225ml無菌生理鹽水中均質(zhì)2min，制備為辣椒均質(zhì)液［8］。取1ml孢子懸液加入9ml上述均質(zhì)液，混勻后制備為模擬樣品懸液。［14］，利用化學(xué)沉降法制備所需的裸磁珠［15］。將50μl濃度為100μg/μl裸磁珠加入1ml懸液中，在室溫下緩慢振蕩吸附1min。用磁分離架分離棄上清后，按真菌DNA提取試劑盒相關(guān)說明操作。提取的模板于-20℃保存?zhèn)溆?。非磁珠吸附法提取的模板僅取1ml懸液按試劑盒相關(guān)說明操作。rDNATranscribedSpacer，ITS）1ITSR）3TaqMan（ASPP，青霉PENPFUSP）［16］進(jìn)行擴(kuò)增（2）。MultipleqPCR體系 建立并優(yōu)化如下擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer4.0μldNTP（10mmol/L）0.4μl、Mg2+（25mmol/L）2.4μl、引物及探針（10μmol/L）各0.8μl、TaqDNA聚合酶（2.5U/μl）0.8μl、模板1.0μl、ddH2O7.4μl，共20μl；反應(yīng)參數(shù)為：95℃，5min；95℃，30s；65℃，1min，共50個(gè)循環(huán)，退火階段采集熒光信號。NMB-MultipleqPCR以pGM-T載體試劑盒說明制備重組質(zhì)粒，分別提取鑒定后曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌107-100copies/MultipleqPCR檢測三類真菌重組質(zhì)粒模板的檢出限并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別制備含曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬孢子的模擬樣品懸液以磁珠吸附法提取模板，并10NMB-MultipleqPCR非磁珠法取的模板做為對照評價(jià)磁珠富集效果。模板的準(zhǔn)確濃度以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法確定。NMB-MultipleqPCR1-1qPCRNMB-MultipleqPCR重復(fù)性評價(jià)根據(jù)檢出限及線性范圍檢測結(jié)果，對33定，評價(jià)方法的重復(fù)性。NMB-MultipleqPCR與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法一致性評價(jià)制備濃度為107CFU/ml曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬孢子懸液并進(jìn)行混合，將該混合懸液適當(dāng)稀釋加入6NMB-MultipleqPCRqPCR2.1 NMB-MultipleqPCR對鑒定后的曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬三種重組質(zhì)粒梯度模板進(jìn)行MultipleqPCR擴(kuò)增，Ct值≤35為陽性。結(jié)果顯示，對于曲霉、青霉和鐮刀菌其檢出限分別為1.02×102copies/反應(yīng)，1.04×102copies/反應(yīng)和1.05×102copies/反應(yīng)（圖1）。重組質(zhì)粒的回歸方程分別為：曲霉屬：Y=-3.264lg（X）+38.920，R2=0.990（1.02×102～1.02×107copies/反應(yīng)）青霉屬：Y=-3.602lg（X）+41.870，R2=0.992（1.04×102～1.04×107copies/反應(yīng)）鐮刀菌屬：Y=-3.484lg（X）+41.150，R2=0.995（1.05×102～1.05×107copies/反應(yīng)）對模擬曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬污染的辣椒樣品，進(jìn)行NMB-MultipleqPCR擴(kuò)增，Ct值≤35為陽性。結(jié)果顯示，對于3類產(chǎn)毒性真菌其檢出限分別為曲霉屬1.8×103CFU/ml，青霉屬1.6×103CFU/ml和鐮刀菌1.4×103CFU/ml，見圖2。模擬樣品的回歸方程分別為：曲霉屬：Y=-3.324lg（X）+47.102，R2=0.972（1.8×103～1.8×106CFU/ml）青霉屬：Y=-3.402lg（X）+47.607，R2=0.995（1.6×103～1.6×106CFU/ml）鐮刀菌屬：Y=-3.496lg（X）+48.519，R2=0.999（1.4×103～1.4×106CFU/ml）對非磁珠法提取的模擬污染樣品模板進(jìn)行multipleqPCR擴(kuò)增，Ct值≤35為陽性。結(jié)果顯示，對于3類產(chǎn)毒性真菌其檢出限分別為曲霉屬1.4×104CFU/ml，青霉屬1.1×104CFU/ml和鐮刀菌屬1.6×104CFU/ml，檢出限僅為NMB-MultipleqPCR方法的1/10，說明裸磁珠對于懸液中的真菌具有富集作用，能提高M(jìn)ultipleqPCR方法檢測靈敏度（圖3）。NMB-MultipleqPCR根據(jù)表1-1中的菌株信息，對6種細(xì)菌27種真菌進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增，Ct值≤35為陽性。結(jié)果顯示，所選引物、曲霉屬探針ASPP、青霉屬探針PENP及鐮刀菌屬探針FUSP特異性良好，與非目標(biāo)菌不存在交叉反應(yīng)（圖4）。NMB-MultipleqPCR根據(jù)方法檢出限的檢測結(jié)果，分別對不同濃度（103、104、106CFU/ml）的曲霉、3：3NMB-MultipleqPCR檢測的變異系數(shù)均小于1.5%，在允許誤差范圍內(nèi)。說明該方法對高、中、低不同濃度的模板均具有較好的重復(fù)性（3）。NMB-MultipleqPCR對三類產(chǎn)毒真菌混合污染的6份模擬辣椒樣品同時(shí)進(jìn)行NMB-MultipleqPCR以及標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法的檢測。將標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法的結(jié)果與NMB-MultipleqPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行l(wèi)og變換后，用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示對于三種菌屬的計(jì)數(shù)結(jié)果，兩種方法的檢測結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（曲霉屬t=-0.193，P＞0.05；青霉屬t=2.315，P＞0.05；鐮刀菌屬t=-0.387，P＞0.05）。建立常見產(chǎn)毒真菌的快速定量檢測方法，可為產(chǎn)毒真菌的有效監(jiān)測提供技術(shù)手段，利于從源頭上預(yù)防和控制真菌毒素的危害。目前產(chǎn)毒真菌快速檢測主要應(yīng)用基于PCR的檢測技術(shù)［16-19］，但大多研究僅針對某些特定產(chǎn)毒真菌，對常見多種產(chǎn)毒真菌同時(shí)進(jìn)行快速檢測的研究卻不多。Suanthie等［11］報(bào)道了針對曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬的multipleqPCR，并成功應(yīng)用于玉米發(fā)酵液中，但該方法能否應(yīng)用于辣椒等香辛料的固體樣品仍然未知。另一方面，PCR技術(shù)檢測真菌的靈敏度還有待進(jìn)一步提高，在Suanthie等的研究中，樣品中的真菌檢出限僅為106CFU/g，而其他學(xué)者報(bào)道真菌純培養(yǎng)物的檢出限也僅為103～104CFU/反應(yīng)。針對這一問題，本研究利用裸磁珠對懸液中真菌的富集及對multipleqPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了方法靈敏度的提高，檢出限可達(dá)103CFU/ml，即104CFU/g辣椒樣品（國家農(nóng)業(yè)部無公害香辛料霉菌總數(shù)的限量標(biāo)準(zhǔn)為104CFU/g［20］），因此該方法可應(yīng)用于香辛料中產(chǎn)毒性真菌的快速檢測并及時(shí)指示污染。同時(shí)該方法特異性和重復(fù)性良好，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，無需純培養(yǎng)，全程7h內(nèi)即可獲得結(jié)果，大大縮短了檢測時(shí)間。FAM、HEXCy5，但研究中發(fā)現(xiàn)，HEXPCRHEXRFU40001000道不符，以上問題將在日后研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。本文首次將裸磁珠技術(shù)應(yīng)用于真菌的分離富集并與多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR聯(lián)用，建立了對曲霉屬、青霉屬以及鐮刀菌屬三類常見產(chǎn)毒真菌進(jìn)行定量檢測的裸磁珠-多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并成功應(yīng)用于辣椒模擬樣品，檢出限可達(dá)104CFU/g，可望用于香辛料中常見產(chǎn)毒性真菌的監(jiān)測，具有潛在應(yīng)用價(jià)值?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】［1］RenardA，GómezDP，Egea-CortinesM，etal.ApplicationofwholegenomeamplificationandquantitativePCRfordetectionandquantificationofspoilageyeastsinorangejuice［J］.IntJFoodMicrobiol，2008，126（1）:195-201.［2］樊竹青，查衛(wèi)華，謝 維，等.思茅農(nóng)貿(mào)市場干花椒，干辣椒中青霉，曲霉含量的調(diào)查［思茅師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2002，18（3）:64-6.［3］張加春，王權(quán)飛，張灼.昆明市售辣椒面中真菌污染調(diào)查［J］.菌物系統(tǒng)，1998，17（3）:284-5.［4］劉蓉，徐池.三種辛辣調(diào)料真菌菌種分析［J］.四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，17（1）:1-2.［5］張文華，張國輝，楊秀麗，等.貴州糊辣椒真菌分離鑒定與污染狀況初步分析［J］.中國調(diào)味品，2014，39（4）:85-8.［6］李新穎，石英.國際香辛料真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀［J］.中國調(diào)味品，2006，12:9-16.［7］施敬文，韓偉，顧鳴.香辛料中多種生物毒素的污染狀況調(diào)查［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2003，13（5）:589-92.［8］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.15-2010，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.［9］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.16-2003，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.［10］楊柳，蘇明權(quán)，岳喬紅，等.裸磁粒子對常見食源菌吸附效果的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，16（5）:1381-3.［11］［J］.醫(yī)學(xué)，2006，33（1）:4-11.［12］孫飛龍，張周梅，馬軍.Fe3O4納米磁顆粒的制備及其對水中細(xì)菌富集的初步研究［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26（10）:90-2.［13］李愛華，岳思君，馬海濱.真菌孢子三種計(jì)數(shù)方法相關(guān)性的探討［J］.微生物學(xué)雜志，2006，26（2）:107-10.［14］ZuoH，XieZ，DingX，etal.Anovelmagneticcapture-multiplexPCRassayforthesimultaneousdetectionofthreefoodbornepathogens［J］.QualityAssuranceSafetyCropsFoods，2011，3（4）:212-20.［15］漆紅蘭.磁性微粒的制備方法和研究進(jìn)展［J］.生命的化學(xué)，2002，22（6）:586-9.［16］SuanthieY，CousinMA，WoloshukCP.Multipl