DNA重組的基本技術(shù)

高中生物選修3

現(xiàn)代生物科技專題專題1基因工程基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

DNA是遺傳物質(zhì)的證明DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立遺傳密碼的破譯基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)工具酶的發(fā)明DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世PCR技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論技術(shù)發(fā)明1.什么叫基因？思考討論？3.遺傳信息是如何表達(dá)的？

2.基因、DNA、染色體之間是怎樣的關(guān)系？（1）原核生物的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)※1.基因的結(jié)構(gòu)能夠轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的信使RNA，進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，也就是說能夠編碼蛋白質(zhì)不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)①非編碼區(qū)：②編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)下游編碼區(qū)上游RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控遺傳信息的表達(dá)原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)

③RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)：RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游④啟動(dòng)子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能引導(dǎo)RNA聚合酶與正確的基因部位結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄從起點(diǎn)開始，沿編碼區(qū)進(jìn)行。⑤終止子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游（2）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA?！駜?nèi)含子:●外顯子:編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)信使RNA成熟的信使RNA真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核核細(xì)細(xì)胞胞與與真真核核細(xì)細(xì)胞胞的的基基因因結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)比比較較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是連續(xù)的。沒有內(nèi)含子和外顯子編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。有內(nèi)含子和外顯子相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成的。非編碼區(qū)都有啟動(dòng)子、終止子和RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？※2基因因表表達(dá)達(dá)的的調(diào)調(diào)控控原核核生生物物基基因因表表達(dá)達(dá)的的調(diào)調(diào)控控乳糖糖代代謝謝基基因因表表達(dá)達(dá)調(diào)調(diào)控控圖圖解解：：(存存在在葡葡萄萄糖糖時(shí)時(shí))ＲＰＯlacZlacYlacA調(diào)節(jié)節(jié)基基因因啟動(dòng)動(dòng)子子操縱縱基基因因結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因因RNA聚聚合合酶酶信使使RNA轉(zhuǎn)錄錄翻譯譯阻抑抑物物與與操縱縱基基因因結(jié)合合，，結(jié)結(jié)構(gòu)基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄受受阻阻．．阻抑抑物物原核核生生物物基基因因表表達(dá)達(dá)的的調(diào)調(diào)控控乳糖糖代代謝謝基基因因表表達(dá)達(dá)調(diào)調(diào)控控圖圖解解：：(只只存存在在乳乳糖糖時(shí)時(shí))ＲＰＯlacZlacYlacA調(diào)節(jié)節(jié)基基因因啟動(dòng)動(dòng)子子操縱縱基基因因結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因因RNA聚聚合合酶酶信使使RNA轉(zhuǎn)錄錄翻譯譯阻抑抑物物與與乳乳糖糖結(jié)結(jié)合合后后構(gòu)構(gòu)象象發(fā)發(fā)生生了了改改變變，，因因而而不不能能與與操操縱縱基基因因結(jié)結(jié)合合，，使使得得結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因因進(jìn)進(jìn)行行轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄。。阻抑抑物物乳糖糖轉(zhuǎn)錄錄半乳乳糖糖苷苷酶酶酶酶基因因工工程程產(chǎn)產(chǎn)品品抗蟲害的玉米轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)基因鮭魚轉(zhuǎn)黃黃瓜瓜抗抗青青枯枯病病基基因因的的甜甜椒椒乳汁汁中中含含有有人人生生長長激激素素的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因牛牛(阿阿根根廷廷)資料位于費(fèi)城托托馬斯·杰杰斐遜大學(xué)學(xué)的希拉里里和她的同同事成功地地將人體狂狂犬病抗體體的DNA譯碼移入入煙草作物物中。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因煙草作物物可以產(chǎn)生生一種人體體蛋白質(zhì)，，而這種物物質(zhì)能抗擊擊致命性的的狂犬病病病毒?；蚬こ痰牡亩x：理論基礎(chǔ)：：基本原理：：1.不同生生物的基因因結(jié)構(gòu)上具具有一定的的相似性：：（1）基因因的基本單單位相同（2）具有有相同的堿堿基互補(bǔ)配配對原則（3）都是是雙螺旋結(jié)結(jié)構(gòu)2.不同生生物共用一一套密碼子子?；蛑亟M基因工程是是指按照人人們的愿望望，進(jìn)行嚴(yán)嚴(yán)格的設(shè)計(jì)計(jì)，通過體體外DNA重組和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因等技技術(shù)，賦予予生物以新新的遺傳特特性，創(chuàng)造造出更符合合人們需要要的新的生生物類型和和生物產(chǎn)品品。基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技技術(shù)或DNA重組技技術(shù)生物體外基因因DNA分子水水平剪切→重組→→導(dǎo)入→表達(dá)達(dá)人類需要的基基因產(chǎn)物基因工程培育育抗蟲棉的簡要過程：：普通棉花(無無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿桿菌提取抗蟲基因棉花細(xì)胞(含抗蟲基因因)抗蟲棉(有毒蛋白)上述培育抗蟲蟲棉的關(guān)鍵步步驟是什么？？重組DNA導(dǎo)入形成基因工程培育育抗蟲棉的關(guān)關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：：抗蟲基因從蘇蘇云金芽孢桿桿菌細(xì)胞內(nèi)提提取出來關(guān)鍵步驟二：：形成重組DNA關(guān)鍵步驟三：：重組DNA導(dǎo)導(dǎo)入受體(棉棉花)細(xì)胞基因工程培育育抗蟲棉的關(guān)關(guān)鍵步驟需要要哪些工具？？1.1DNA重組技術(shù)的的基本工具關(guān)鍵步驟一的的工具：關(guān)鍵步驟二的的工具：關(guān)鍵步驟三的的工具：分子手術(shù)刀——限制性內(nèi)切切酶分子縫合針——DNA連接接酶分子運(yùn)輸車——運(yùn)載體一、“分子手手術(shù)刀”———限制性核核酸內(nèi)切酶（（限制酶）1.來源：主主要來自于原原核生物，如如：大腸桿菌菌細(xì)胞內(nèi)可分分離出EcoRI限制酶※限制酶在原原核生物中的的作用原核生物容易易受到自然界界外源DNA的入侵，但但是，生物在在長期的進(jìn)化化過程中形成成了一套完善善的防御機(jī)制制，以防止外外來病原物的的侵害。限制制酶就是細(xì)菌菌的一種防御御性工具，當(dāng)當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)會(huì)利用限制酶酶將外源DNA切割掉，，以保證自身身的安全。所所以，限制酶酶在原核生物物中主要起到到切割外源DNA、使之失失效，從而達(dá)達(dá)到保護(hù)自身身的目的。含有某種限制制酶的細(xì)胞，，其DNA分分子中或者不不具備這種限限制酶的識(shí)別別切割序列，，或者通過甲甲基化酶將甲甲基轉(zhuǎn)移到所所識(shí)別序列的的堿基上，使使限制酶不能能將其切開。。在細(xì)菌體內(nèi)與與相伴存在的的修飾酶（甲甲基化酶）共共同構(gòu)成細(xì)菌菌的限制－修修飾體系，起起限制外來DNA、保護(hù)護(hù)自身DNA的作用一、“分子手手術(shù)刀”———限制性核核酸內(nèi)切酶（（限制酶）1.來源：主主要來自于原原核生物，如如：大腸桿菌菌細(xì)胞內(nèi)可分分離出EcoRI限制酶2.作用：識(shí)識(shí)別特定的核核苷酸序列并并水解特定的的兩個(gè)核苷酸酸之間的磷酸酸二酯鍵。大大多數(shù)限制酶酶能夠識(shí)別的的序列均為6個(gè)核苷酸（（個(gè)別4、5、8）(1)限制酶酶識(shí)別序列的的特點(diǎn)限制酶所識(shí)別別的序列，無無論是6個(gè)堿堿基還是4個(gè)個(gè)堿基，都可可以找到一條條中心軸線，，以中軸線雙雙側(cè)的DNA上堿基呈反反向?qū)ΨQ，重重復(fù)排列。如：：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC(2)切切點(diǎn)點(diǎn)：：AATTGCCTTAAG※與與DNA酶酶有有什什么么區(qū)區(qū)別別？？磷酸酸二二酯酯鍵鍵●實(shí)質(zhì)質(zhì)：：DNA酶酶：：不不特特異異性性識(shí)識(shí)別別序序列列水水解解DNA●水解解產(chǎn)產(chǎn)物物：：DNA酶酶：：限制制酶酶：：DNA片片段段基本本單單位位————脫脫氧氧核核苷苷酸酸能識(shí)識(shí)別別和和切切割割雙雙鏈鏈DNA分分子子特特異異序序列列的的核核酸酸水水解解酶酶限制制酶酶：：重播播3.作作用用結(jié)結(jié)果果：：切切割割DNA分分子子產(chǎn)產(chǎn)生生兩兩種種類類型型的的末末端端：：黏黏性性末末端端和和平平末末端端(1)黏黏性性末末端端被限限制制酶酶切切開開的的DNA兩兩條條單鏈鏈的的切切口口，帶帶有有幾幾個(gè)個(gè)伸出出的的核核苷苷酸酸，他他們們之之間間正正好好互補(bǔ)補(bǔ)配配對對，這這樣樣的的切切口口叫叫黏性性末末端端。DNA被被限限制制酶酶切切斷斷后后有有兩兩個(gè)個(gè)反反向向互互補(bǔ)補(bǔ)的的““黏黏性性末末端端””。。被被同同一一種種限限制制切切斷斷的的幾幾個(gè)個(gè)DNA具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端，，能能夠夠通通過過互互補(bǔ)補(bǔ)進(jìn)進(jìn)行行配配對對。。(2)平平末末端端在識(shí)識(shí)別別順順序序的的對對稱稱軸軸上上，，對對雙雙鏈鏈DNA同同時(shí)時(shí)切切割割。。4.舉舉例例：：EcoRI限限制制酶酶能能識(shí)識(shí)別別GAATTC序序列列，，并并在在G和和A之之間間切切開開限制制酶酶要想想獲獲得得某某個(gè)個(gè)特特定定性性狀狀的的基基因因必必須須要要用用限限制制酶酶切切幾幾個(gè)個(gè)切切口口？？可可產(chǎn)產(chǎn)生生幾幾個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端？？要切切兩兩個(gè)個(gè)切切口口，，產(chǎn)產(chǎn)生生四四個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端。。如果果把把兩兩種種來來源源不不同同的的DNA用用同同一一種種限限制制酶酶來來切切割割，，會(huì)會(huì)怎怎樣樣呢呢？？會(huì)產(chǎn)產(chǎn)生生相同同的的黏黏性性末末端端，然然后后讓讓兩兩者者的的黏黏性性末末端端黏合合起來來，，就就可可以以重組組的的DNA分分子子了。。思考考※限限制制酶酶的的命命名名●第一一個(gè)個(gè)字字母母（（大大寫寫、、斜斜體體））該該酶酶的的微微生生物物屬屬名名●第二二、、三三個(gè)個(gè)字字母母（（小小寫寫、、斜斜體體））代代表表微微生生物物種種名名●第四個(gè)字字母（斜斜體）代代表表寄主菌菌的株或或型●用羅馬數(shù)數(shù)碼I、、II、、III等區(qū)分分同一株株具有有不同特特異性的的酶例流感感嗜血桿桿菌中三三個(gè)酶的的命名：：

Haemophilusinfluenzaed屬屬名名種種名株株系HindIIIIIIHindIHindIIHindIII※限制酶酶的分類根根據(jù)限制制酶的識(shí)識(shí)別切割割特性、、催化條條件及是是否具有有修飾酶酶活性可可分為：：I型II型型III型型1.I型型限制酶酶

屬于于復(fù)合功功能酶，，兼有修修飾和切切割DNA兩種種特性。。功能核酸內(nèi)切切酶甲甲基化酶酶

ATP酶DNA解旋酶酶2.III型酶酶

與I型酶特特性類似似，也有有甲基化化功能，，但無ATP酶酶和DNA解旋旋酶活力力。在在DNA鏈上有有特異位位點(diǎn)切割割，其切切割位點(diǎn)點(diǎn)在識(shí)別別位點(diǎn)以以外。3.II型酶（（1）II型酶的識(shí)識(shí)別識(shí)識(shí)別序序列一般為為4-6個(gè)個(gè)堿基對，，通常是反反轉(zhuǎn)重復(fù)順順序，具有有180oo的旋轉(zhuǎn)對對稱性。（（2）II型酶的的切割功能能★5’端黏性性末端（cohesiveend)在在識(shí)識(shí)別順序的的雙側(cè)末端端切割DNA雙鏈，，于對稱軸軸的5’末末端切割。?！ば阅┒恕?’端黏性性末端在在識(shí)別順序序的雙側(cè)末末端切割DNA雙鏈鏈，于對稱稱軸的3’’末端切割割。※少數(shù)有特殊殊性質(zhì)的酶酶<1>異源同工酶酶（isoschizomer）定定義義：來來源不不同但能識(shí)識(shí)別和切割割同一位點(diǎn)點(diǎn)的酶。

5’CCGG3’3’GGCC5’

5’CCGG3’3’GGCC5’HpaII、MspI<2>同尾酶（isocaudarner)為為識(shí)識(shí)別與切割割順序相互互有關(guān)的酶酶。有有些些限制酶的的識(shí)別序列列包含在另另一些限制制酶的識(shí)別別順序之中中酶酶來源源不同，但但它們作用用后能產(chǎn)生生相同的粘粘性末端。。5’GGATCC3’3’CCTAGG5’5’AGATCC3’3’CCTAGA5’BamHIBagII5’GGATCC3’3’CCTAGG5’DNA連接酶酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G同種限制酶切割二、“分子縫縫合針”———DNA連接接酶DNA連接酶酶可把黏性末末端之間的縫隙“縫合””起來，恢復(fù)被被限制酶切開開的兩個(gè)核苷苷酸之間的磷磷酸二酯鍵，，形成重組的的DNA分子子。1.作用：將將互補(bǔ)配對的的兩個(gè)黏性末末端連接起來來，使之成為為一個(gè)重組的的DNA分子子DNA連接酶酶與DNA聚聚合酶一樣嗎嗎？為什么？？2.作用結(jié)果果：

在切口口處催化形成成磷酸二酯鍵鍵。切口：DNA分子糖-磷磷酸主鍵的破破壞。

缺口口：DNA分分子中核苷酸酸缺失。切口口：：DNA5’’磷磷酸酸基基與與3’’羥羥基基之之間間的的縫縫隙隙注意意：：DNA連連接接酶酶只只能能作作用用于于雙雙鏈鏈DNA分分子子而而不不能將將二二個(gè)個(gè)單單鏈鏈DNA分分子子連連接接。。（1））從從大大腸腸桿桿菌菌中中分分離離得得到到：：E.coliDNA連連接接酶酶，，只只能能將將雙雙鏈鏈DNA片片段段互互補(bǔ)補(bǔ)的的粘粘性性末末端端之之間間連連接接。。（2））從從T4噬菌菌體體中中分分離離到到：：T4DNA連連接接酶酶，，既既可可以以““縫縫合合””雙雙鏈鏈DNA片片段段互互補(bǔ)補(bǔ)的的粘粘性性末末端端，，又又可可以以““縫縫合合””雙雙鏈鏈DNA片片段段的的平平末末端端，，但但連連接接平平末末端端之之間間的的效效率率比比較較低低。。3.分分類類（（酶酶的的來來源源））T4噬菌菌體體DNA連連接接酶酶大大腸腸桿桿菌菌DNA連連接接酶酶※T4噬菌菌體DNA連接接酶連接接帶粘性性末端DNA分分子的效效率遠(yuǎn)高高于連接接平末端端的DNA分子子※連接反應(yīng)應(yīng)需要ATP提提供能量量。外源基因因(如抗抗蟲基因因)怎樣樣才能導(dǎo)導(dǎo)入受體體細(xì)胞(如棉花花細(xì)胞)？導(dǎo)入過程程需要運(yùn)運(yùn)輸工具具——運(yùn)運(yùn)載體。。運(yùn)載體的的作用有有哪些？？作用一：：作為運(yùn)運(yùn)載工具具，將外外源基因因(抗蟲蟲基因)轉(zhuǎn)移到到受體細(xì)細(xì)胞(棉棉花細(xì)胞胞)中去去。作用二：：利用運(yùn)運(yùn)載體在在受體細(xì)細(xì)胞(棉棉花細(xì)胞胞)內(nèi)，，對外源源基因(抗蟲基基因)進(jìn)進(jìn)行大量量復(fù)制。。作為運(yùn)載載體必須須具備哪哪些條件件？1）能夠夠在宿主主細(xì)胞中中復(fù)制并并穩(wěn)定地地保存。。2）載體體DNA必須有有一個(gè)或或多個(gè)限限制酶切切點(diǎn)，以以便目的的基因插插入到載載體上去去。3）具有有某些標(biāo)標(biāo)記基因因，便于于進(jìn)行篩篩選。如抗菌素素的抗性性基因、、產(chǎn)物具具有顏色色反應(yīng)的的基因等等。載體DNA必須須是安全全的,不不會(huì)對受受體細(xì)胞胞有害;5)載載體DNA分分子大小小應(yīng)適合合,以便便提取和和在體外外進(jìn)行操操作,太太大就不不便操作作.三、基因因的載體體——““分子運(yùn)運(yùn)輸車””2.載體體必須具具備的條條件：（1）能能夠在宿宿主細(xì)胞胞中復(fù)制制并穩(wěn)定定地保存存；（2）具具有多個(gè)個(gè)限制酶酶切點(diǎn)，，以便與與外源基基因連接接；（3）具具有某些些標(biāo)記基基因，便便于進(jìn)行行篩選。。（如抗抗菌素的的抗性基基因、產(chǎn)產(chǎn)物具有有顏色反反應(yīng)的基基因等））（4）對對受體細(xì)細(xì)胞無害害（5）載載體DNA分子子大小應(yīng)應(yīng)適合1.載體體的作用用：（1）將將外源基基因轉(zhuǎn)移移到受體體細(xì)胞中中去。（2）利利用運(yùn)載載體在受受體細(xì)胞胞內(nèi)，對對外源基基因進(jìn)行行大量復(fù)復(fù)制。3.常用用的載體體有：質(zhì)粒，λλ噬菌體體的衍生生物，動(dòng)動(dòng)植物病病毒等4.質(zhì)粒?！蚬こ坛套畛Ｓ糜玫?/p>