DNA重組技術(shù)的基本工具正式

基因工程專題1每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實現(xiàn)了細菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達。這些性狀的表達與我們學過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用基因工程的產(chǎn)物什么叫基因工程？基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰母拍罨蚬こ痰母拍睿夯蚬こ蹋纸蠨NA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳特性?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導入→表達問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達爾文提出生物進化論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路早期基基礎(chǔ)理理論摩爾根根證明基因在在染色色體上上，并提提出基基因的的連鎖互互換定定律?；A(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論艾弗里里證明DNA是遺遺傳物物質(zhì)，DNA可可從一一種生生物個個體轉(zhuǎn)移到另一一種生生物個個體。?；A(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論沃森、克里克克提出DNA的雙螺旋旋結(jié)構(gòu)構(gòu)模型。?；A(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論梅塞爾爾松、斯塔爾爾證明DNA的半保留留復制制基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論克里克克等提出出中心法法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復制基礎(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基礎(chǔ)理理論1963年年尼倫伯伯格和馬太破譯編編碼氨氨基酸酸的遺傳密密碼，1966年霍拉納納用實驗驗加以以證明明?；A(chǔ)理理論和和技術(shù)術(shù)發(fā)展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路1)基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移載載體的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)2)工工具酶酶的發(fā)發(fā)現(xiàn)3)DNA合成成和測測序技技術(shù)的的發(fā)明明4)DNA體體外重重組的的實現(xiàn)現(xiàn)5)重重組DNA表達達實驗驗的成成功6)第第一一例例轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因動動物物問問世世7)PCR技技術(shù)術(shù)的的發(fā)發(fā)明明解決決培培育育抗抗蟲蟲棉棉的的關(guān)關(guān)鍵鍵步步驟驟需需要要哪哪些些工工具具？？“分分子子手手術(shù)術(shù)刀刀””————限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞“分分子子縫縫合合針針””————DNA連連接接酶酶“分分子子運運輸輸車車””————基基因因進進入入受受體體細細胞胞的的載體體1.1、、DNA重重組組技技術(shù)術(shù)的的基基本本工工具具一、、限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶————““分分子子手手術(shù)術(shù)刀刀””1.主要要來來源源：：⒉種類類與與命命名名：：⒊作用用特特點點：：4.限制制酶酶識識別別序序列列5.作用用結(jié)結(jié)果果：：識別別雙雙鏈鏈DNA分分子子的的某某種種特定定核苷苷酸酸序序列列，，并并且且使使每每條條鏈鏈中中特定定部部位位的兩兩個個核核苷苷酸酸之之間間的的磷酸酸二二酯酯鍵鍵斷開開。。主要要從從原原核核生生物物中中分分離離純純化化產(chǎn)生生黏黏性性末末端端或或平平末末端端Goon大多多數(shù)數(shù)限限制制酶酶的的識識別別序序列列由由6個個核核苷苷酸酸組組成成少數(shù)數(shù)的的識識別別序序列列由由4、、5或或8個個核核苷苷酸酸組組成成尋根根問問底底你能推測限制制酶存在于原原核生物中的的作用是是什什么嗎？原核生物易受受自然界外源源DNA的入入侵，但生物在長長期的進化過過程中形成了了一套完善的的防御機制，，以防止外來來病原物的侵侵害。限制酶就是細菌的一一種防御性工具，當外源DNA侵入時，，會利用限制制酶將外源DNA切割掉，以保證自自身的安全。。所以，限制制酶在原核生生物中主要起起到切割外源源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。Goback⒉種類與命名名：現(xiàn)在已經(jīng)從約約300種微微生物中分離離出了約4000種限制制性內(nèi)切酶(限制酶)。。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習：流感嗜嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離離到3種限制制酶，則分別別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ磷酸二酯鍵T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+O限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶酶與DNA解解旋酶的區(qū)別別切割特定的核核苷酸序列的的磷酸二酯鍵鍵將DNA兩條條鏈的氫鍵打打開形成兩條條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶酶與DNA水水解酶的區(qū)別別切割特定的核核苷酸序列的的磷酸二酯鍵鍵，形成片段段的DNA.切割磷酸二酯酯鍵，形成單單個的脫氧核核苷酸。Goback限制酶的識別別序列：能被限制性內(nèi)內(nèi)切酶特異性性識別的切割割部位都具有有回文序列：在切割部位，，一條鏈正向讀的堿基順序序與另一條鏈鏈反向讀的順序完全全一致。GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端重復演示Goback什么叫黏性末末端？被限制酶切開開的DNA兩兩條單鏈的切切口，帶有幾幾個伸出的核苷酸酸，它們之間正正好互補配對，這樣的切口口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平平末端要想獲得某個個特定性狀的的基因必須要要用限制酶切切幾個切口？？可產(chǎn)生幾個個黏性(平)末端？要切兩個切口口，產(chǎn)生四個個黏性(平)末端。如果把兩種來來源不同的DNA用同一一種限制酶來來切割，會怎怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者者的黏性(平平)末端黏合起來，就似乎乎可以合成重重組的DNA分子了。思考?……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混混合將不同種來源源的DNA片片段連接起來來生物A基因片片段生物B基因片片段……GAATTC……………CTTAAG………酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一種DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點尋根問底DNA連接酶酶與DNA聚聚合酶是一回回事嗎?為什什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的的核酸片段上上，形成磷酸酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片片段之間形成磷酸二酯酯鍵2)以一條DNA鏈鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯酯鍵連接成一條互互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時時連接起來，不需要模板可把黏性末端端之間的縫隙“縫合””起來，E·coliDNA連連接酶或或T4DNA連接酶酶即恢復被限制酶酶切開的兩個個核苷酸之間間的磷酸二酯酯鍵T4DNA連接酶酶還可把平末端之間的的縫隙“縫合合”起來，但效率率較低T4DNA連接酶酶二、“分子縫縫合針”———DNA連接酶①作用:把切下來的DNA片段拼拼接成新的DNA，即將將脫氧核糖和磷磷酸連接起來.②作用原理：：催化磷酸二酯酯鍵形成③類型：類型E·coliDNA連接酶酶T4DNA連接酶酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別三、“分子運運輸車”———基因進入入受體細胞的的載體⒈載體需要的的條件：⑴有1~多個個限限制制酶酶切切點點⑵對對受受體體細細胞胞無無害害⑶導導入入基基因因能在在受受體體細細胞胞中中復復制制、、表表達達⑷有某某些些標標記記基基因因，，便便于于篩篩選選⒉常常用用運運載載體體：：⑴細細菌菌的的質(zhì)質(zhì)粒粒⑵λ噬噬菌菌體體衍衍生生物物或某某些些動動植植物物病病毒毒⑶假假如如目目的的基基因因?qū)肴胧苁荏w體細細胞胞后后不不能能復復制制或或不不能能轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄，，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因生生物物能能有有預預想想的的效效果果嗎嗎？？⑴作作為為分分子子運運輸輸車車————載載體體，，如如果果沒沒有有切切割割位位點點將將會會怎怎樣樣？？⑵霍霍亂亂菌菌的的質(zhì)質(zhì)粒粒多多個個限限制制酶酶切切點點，，你你會會用用它它來來做做分分子子運運輸輸車車嗎嗎？？⑷目目的的基基因因有有沒沒有有進進入入受受體體細細胞胞，，如如何何去去發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)？？常用用的的載載體體：：質(zhì)質(zhì)粒粒能復復制制并并帶帶著著插插入入的的目目的的基基因因一一起起復復制制有切切割割位位點點有標標記記基基因因的的存存在在，，可可用用含含氨氨芐芐青青霉霉素素的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基鑒鑒別別思考考與與探探究究P7（（2））為什什么么限限制制酶酶不不剪剪切切細細菌菌本本身身的的DNA？？通過過長長期期的的進進化化，，細細菌菌中中含含有有某某種種限限制制酶酶的的細細胞胞，，其其DNA分分子子中中或或者者不具具備備這種種限限制制酶酶的的識別別切切割割序序列列；或或者者通通過過甲甲基基化化酶酶將甲甲基基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到所所識別別序序列列的堿堿基基上上，，使使限制制酶酶不不能能將將其其切切開開。這這樣樣，，盡盡管管細細菌菌中中含含有有某某種種限限制制酶酶也也不不會會使使自自身身的的DNA被被切切斷斷，，并并且且可可以以防防止止外外源源DNA的的入入侵侵。。3、、天天然然的的DNA分分子子可可以以直直接接用用做做基基因因工工程程載載體體嗎嗎？？為為什什么么？？提示示：：基因因工工程程中中作作為為載載體體使使用用的的DNA分分子子很很多多都都是是質(zhì)質(zhì)粒粒（（plasmid）），，即即獨獨立立于于細細菌菌擬擬核核染染色色體體DNA之之外外的的一一種種可可以以自自我我復復制制、、雙雙鏈鏈閉閉環(huán)環(huán)的的裸裸露露的的DNA分分子子。。是否否任任何何質(zhì)質(zhì)粒粒都都可可以以作作為為基基因因工工程程載載體體使使用用呢呢？？不是，作作為基因因工程使使用的載載體必需需滿足以以下條件件：思考與探探究P71）載載體DNA必需需有一個或多多個限制制酶的切割位位點，以以便目的的基因可可以插入入到載體體上去。。這些供供目的基基因插入入的限制制酶的切切點所處處的位置置，還必必須是在質(zhì)粒本本身需要要的基因因片段之之外，這樣才才不至于于因目的的基因的的插入而而失活。。2）載載體DNA必需需具備自我復制制的能力力，或整合合到受體體染色體體DNA上隨染染色體DNA的的復制而同同步復制制。3）載載體DNA必需需帶有標記記基因，以便重重組后進進行重組組子的篩篩選。4）載載體DNA必需需是安全的的，不會對對受體細細胞有害害，或不不能進入入到除受受體細胞胞外的其其他生物物細胞中中去。5）載載體DNA分子子大小應(yīng)適適合，以便提提取和在在體外進進行操作作，太大大就不便便操作。。實際上自