血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳課件

血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆针娪镜幕驹?，了解電泳儀、電泳槽的基本結(jié)構(gòu)與功能。熟悉電泳的基本過程與定量方法。熟悉血清電泳在臨床診斷的作用。實(shí)驗(yàn)原理—PH＜PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，移向負(fù)極PH＝PI時(shí)，蛋白質(zhì)不帶電荷PH＞PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，移向正極遷移率：是指單位電場(chǎng)強(qiáng)度是離子運(yùn)動(dòng)的速度，也稱電泳度。醋酸纖維素薄膜電泳：以醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；伞⒋姿崂w維素溶于丙酮等有機(jī)溶液中，可涂布形成均一細(xì)密的微孔薄膜，厚度約0.1~0.15mm。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在同一高于其等電點(diǎn)的PH值緩沖液中，他們都帶負(fù)電荷，但電荷數(shù)量不同。同時(shí)，各種蛋白質(zhì)的分子大小不一，所以在同一電場(chǎng)的電泳遷移率不同。在醋酸纖維素膜上可分為五條區(qū)帶。電泳遷移率最大的是白蛋白，其后依次為α1、α2、β和γ球蛋白。染色后經(jīng)透明處理可直接在光密度計(jì)上掃描定量。實(shí)驗(yàn)器材與試劑器材電泳槽、電泳儀、脫色搖床、染缸、濾紙、醋酸纖維素薄膜、點(diǎn)樣器

DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-3型電泳箱試劑：電極緩沖液：巴比妥緩沖液（PH8.5~8.7、I=0.06）:稱取巴比妥2.21g、巴比妥鈉12.36g于500ml蒸餾水中，加熱溶解，待冷卻至室溫后，用蒸餾水補(bǔ)足至1L。染色液：氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B0.1g，溶于無水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml、甘油0.5ml，使溶解，然后將磺柳酸2.5g溶于少量蒸餾水中，加入前液，再以蒸餾水補(bǔ)足至100ml。實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)備：將巴比妥緩沖液加入電泳槽的電極室內(nèi)，是正負(fù)極室的吖液面等高，電泳支架寬度正好適合醋纖薄膜的長(zhǎng)度，用四層紗布或?yàn)V紙做鹽橋，一端浸入緩沖液中，一端搭在支架上。浸膜：先于膜條無光澤面距一端1.5cm處用鉛筆輕劃一直線（點(diǎn)樣線），再將薄膜無光澤面向下浸泡于巴比妥緩沖液中，浸透為止（約10~20min）。當(dāng)膜條無可見的白斑或點(diǎn)狀的不透明區(qū)時(shí)，取出，將薄膜無光澤面向上，平放于干凈濾紙，薄膜上再放一張干凈濾紙輕輕吸去多余的緩沖液。點(diǎn)樣:用滴管吸取待測(cè)血清一滴于玻璃片上，用點(diǎn)樣器或?qū)?.5cm的X光軟片末端處蘸取少許樣品，垂直輕印（迅速均勻）到薄膜點(diǎn)樣線上，使血清完全滲透到薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗徐均勻的直線。（注：點(diǎn)樣量不宜過多?。┻@是關(guān)鍵步驟，印章法加樣時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。點(diǎn)樣前可先在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣。平衡：將膜條無光澤面向下置于電泳槽支架上，點(diǎn)樣端靠近負(fù)極，薄膜兩端要緊貼紗布或?yàn)V紙，中間平直懸空，加蓋密封，平衡5分鐘。電泳：將電泳槽正負(fù)極與電源正負(fù)極接好。開啟電源，調(diào)節(jié)電流密度為0.5mA/cm,如有10條寬2cm的膜條，其總寬度為20cm,應(yīng)使用電流強(qiáng)度為20cm*0.5mA/cm=10mA。電壓15V/cm。通電50分鐘左右，使電泳區(qū)帶展開3~3.5cm。關(guān)閉電源。染色：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5~10min（以蛋白帶染透為止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景無色為止。漂洗液可回收。計(jì)算公式：各組分蛋白質(zhì)%=Ax/At*100（Ax:各組分蛋白質(zhì)的吸光度。At:各組分蛋白質(zhì)吸光度的總合。）各組分蛋白質(zhì)的絕對(duì)濃度（g/L）＝血清總蛋白（g/L）*各組分蛋白質(zhì)的百分濃度（％）注意事項(xiàng):每次電泳時(shí)應(yīng)交換電極可使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖溶液的正負(fù)離子相互交換，使緩沖液的pH值維持在一定水平。每使用十次最好將緩沖液棄去。電泳槽兩側(cè)的緩沖液面應(yīng)保持同一水平面，否則通過薄膜時(shí)有虹吸現(xiàn)象，將會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的電泳速度電泳失敗的原因:①電泳圖不完整;②蛋白組分分離不佳；③染色后蛋白質(zhì)中間著色淺；④薄膜透明不完全；⑤透明膜上有氣泡。臨床意義血清蛋白通過醋酸纖維素薄膜電泳，通?？梢苑蛛x得到（Alb）、α、β、γ-球蛋白。正常人血清中各種蛋白組分的濃度差別較大，所以在許多病理情況系會(huì)發(fā)生細(xì)微的變化，往往沒有特意的臨床診斷價(jià)值。分析各種疾病的電泳分析結(jié)果，可看出顯著變化。血漿蛋白的主要功能:

維持血漿膠體滲透壓

調(diào)節(jié)血漿pH值,維持酸堿平衡

運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì),代謝物,激素,藥物及金屬離子等免疫作用

血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳在臨床上常用于分析血、尿等樣品中的蛋白質(zhì)，供臨床上診斷肝、腎等疾病參考。肝炎:白蛋白,a1-球蛋