DNA的粗提取與鑒定

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA的粗提取與鑒定.ppt一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）提取DNA的方法1.提取生物大分子的基本思路

選用一定的物理或化學(xué)方法，分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子2.提取DNA的基本思路提取DNA，去除其他成分利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異第1頁(yè)/共22頁(yè)⑴DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀；或者讓其他成分溶解，DNA析出3.DNA等大分子的理化性質(zhì)⑵DNA不溶于酒精溶液⑶DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性第2頁(yè)/共22頁(yè)DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。⑵DNA不溶于酒精溶液⑶DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性①蛋白酶——水解蛋白質(zhì)，

對(duì)DNA沒(méi)有影響②高溫——大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃

而DNA在80℃以上才會(huì)變性③洗滌劑——溶解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)

但對(duì)DNA沒(méi)有影響第3頁(yè)/共22頁(yè)第4頁(yè)/共22頁(yè)試劑：（二）DNA的鑒定條件：二苯胺沸水浴條件下，

DNA遇二苯胺被染成藍(lán)色沸水浴現(xiàn)象：第5頁(yè)/共22頁(yè)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液（三）除去濾液中的雜質(zhì)(純化)（四）

DNA的析出與鑒定二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第6頁(yè)/共22頁(yè)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取從下列材料中選取2～3種原則：菜花、香蕉、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜；魚(yú)卵、豬肝、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌選用DNA含量相對(duì)較高的組織第7頁(yè)/共22頁(yè)（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞2、植物細(xì)胞——容易破碎——需要溶解細(xì)胞膜雞血細(xì)胞溶液：加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，

過(guò)濾后收集濾液想一想：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分大量進(jìn)入血細(xì)胞，使血細(xì)胞脹裂；加上攪拌作用，加速雞血細(xì)胞細(xì)胞膜、核膜破裂，

從而釋放出DNA①加入一定的洗滌劑和食鹽②充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液想一想：洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？洗滌劑——離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，利于DNA釋放食鹽——NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中第8頁(yè)/共22頁(yè)經(jīng)研磨可破碎細(xì)胞壁，使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放。若研磨不充分，會(huì)使提取的DNA量變少，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理討論：濾液/研磨液中可能含有哪些成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？第9頁(yè)/共22頁(yè)方法步驟

加入物質(zhì)

目的

1.制備雞血細(xì)胞液

檸檬酸鈉溶液

①

2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì)

20m1蒸餾水

②幻燈片18

3.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA

2mo1／L的NaCI溶液40mL

③幻燈片18

4.析出含DNA的黏稠物

蒸餾水

④

5.濾取含DNA的黏稠物

⑤

6.將DNA的黏稠物再溶解

2mol／L的NaCl溶液20mL

⑥

7.過(guò)濾含DNA的NaCl溶液

⑦

8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA

冷卻的95％的酒精50mL

⑧幻燈片18

A:(1)向試管中加入2mol/L的NaCl溶液5mL

(2)加入DNA

(3)4

mL二苯胺試劑

9.DNA的鑒定

B:(1)

(2)4mL二苯胺試劑

⑨

⑷混勻后，置于沸水浴中加熱5min向試管中加入2mol/L的NaCl溶液5mL⑷混勻后，置于沸水浴中加熱5min第10頁(yè)/共22頁(yè)1.DNA的溶解性2.DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性（三）除去濾液中的雜質(zhì)第11頁(yè)/共22頁(yè)討論：方案二與方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，使提取的DNA

與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三：利用DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，

使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離第12頁(yè)/共22頁(yè)（四）DNA的析出與鑒定與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)95％)，靜置2－3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物

——粗提取DNA用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出第13頁(yè)/共22頁(yè)第14頁(yè)/共22頁(yè)2.DNA的鑒定⑴向兩支試管中分別加入2mol/LNaCl

溶液5ml⑵其中一支試管中加入DNA絲狀物⑶各加入二苯胺試劑4ml⑷混勻后，置于沸水浴中加熱5min⑸待冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化觀察現(xiàn)象：溶解絲狀物的溶液變?yōu)樗{(lán)色第15頁(yè)/共22頁(yè)①加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固②加速血細(xì)胞破裂

③溶解DNA

④使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大限度地釋出

⑤使含DNA的黏稠物被留在紗布上⑥使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中⑦除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)⑧提取DNA⑨A出現(xiàn)藍(lán)色B無(wú)變化第16頁(yè)/共22頁(yè)觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備四、課題成果評(píng)價(jià)（一）是否提取出了DNA第17頁(yè)/共22頁(yè)練習(xí)1、請(qǐng)解釋提取DNA的實(shí)驗(yàn)操作中主要的步驟的目的。．答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。第18頁(yè)/共22頁(yè)2、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取DNA一樣容易嗎？答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)椋cDNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。第19頁(yè)/共22頁(yè)2.實(shí)驗(yàn)中NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol／L和0.14mol／L對(duì)DNA有何影響?1.在DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是()。A.稀釋血液、沖洗樣品B.使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出C.使血細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量D.使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA答：B答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出第20頁(yè)/共2