DNA的提取方法簡介

會計學1DNA的提取方法簡介第1頁/共17頁第2頁/共17頁1、核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

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天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA及無機離子等，從中分離DNA。DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時，常用此法分離這兩種核蛋白。第4頁/共17頁細菌有堅硬的細胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種：①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學試劑法：用SDS處理細胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。

2.細胞的破碎第5頁/共17頁由于高等動物DNA主要存在于細胞核與線粒體中，所以提取時有兩個困難（高等植物與此類似）：①破碎細胞難；從處死動物?分離組織器宮到破碎細胞費時長。在此時期間DNA可能會被DNase降解，而動物組織：特別是肌肉組織很難破碎,即使是較易破碎的肝?腎等組織也往往使用組織勻漿器，易造成DNA斷裂。②分子量大，一般比細菌的大2—3個數(shù)量級，比病毒的大4—5個數(shù)量。對不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當?shù)姆蛛x提取方法。第6頁/共17頁3.DNA提取的幾種方法(1).濃鹽法利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M氯納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來.也可用0.15MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.以稀鹽酸溶液提取DNA時,加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA.第7頁/共17頁（2）.陰離子去污劑法:用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài).第8頁/共17頁（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66%?80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.第9頁/共17頁二.從豬脾中提取DNA第10頁/共17頁1.操作步驟:取鮮豬脾,去脂、血,稱取10g,用預冷的1×SSC溶液洗2次，剪碎。按睥：1×SSC=1;5W/V加入50ml預冷的1×SSC，用高速組織搗碎機破碎8次,每次5秒,中間間隔30秒。將勻漿液放在燒杯中，于冰鹽浴中冷卻30分鐘。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。充掉上清。沉淀物中再加2倍體積的1×SSC攪勻，離心，棄上清，重復2次。將所得沉淀懸于5倍體積的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA溶液中。邊攪拌邊漫漫滴加5%SDS最終濃度達1%為止。然后加入固體氯化鈉使其最終濃度達1mol/L，繼續(xù)攪60分鐘，以確保氯化鈉全溶。所得混合液倒入磨口塞的錐形瓶中，加入同體積氯仿—異戊醇，激烈振蕩20分鐘，4000r離心20分鐘，上層水相取出后倒入燒杯，以同積氯仿—異戊醇重復去蛋白2次。取出水相于燒杯中，逐漸加入2倍體積95%乙醇，玻棒攪動，DNA纖維繞于璃玻棒上后擠干，用70%乙醇洗DNA纖維2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并擠干。第11頁/共17頁2.實驗材料，儀器和試劑：（1）

實驗材料：新鮮豬脾：（2）儀器：量筒：1×10、3×100燒杯：2×100，2×250；磨口錐形瓶：1×250、1×500；吸管：1×1、1×10；滴管、玻棒、離心機、電動攪拌器、臺秤、剪刀、鑷子。（3）

試劑：①

20×SSC：175.2gNaCL，88.2g檸檬酸鈉?2H2O，PH=7.0加水至1000ml；②

1×SSC，0.1×SSC由①做相應的稀釋得來；③

NaCL-Na2EDTA液：8.77gNaCL，3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸餾水中，用固體NaOH調(diào)PH=8后定容至1000；④

5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中；⑤

氯仿-異戊醇=24：1（體積比）⑥其他:95%乙醇，鹽冰.數(shù)據(jù):DNA重,產(chǎn)率:

待測液中測得的核酸μg數(shù)DNA%=×100

待測液中制品的μg數(shù)第12頁/共17頁二苯胺顯色法測定DNA含量強酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，脫氧核糖與嘧啶核苷酸。其中2ˊ脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為ω―羥基―γ―酮基戊醛，此物與二苯胺反應生成藍色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400μg范圍內(nèi)光密度與DNA濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛可提高靈敏度，而且其他化合物的干擾也顯著降低。當樣品含少量RNA時不影響測定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生物芳香，羥基醛都能與二苯胺形成各種有色物質(zhì)，干擾測定。第13頁/共17頁１、二苯胺試劑：使用前稱取0.8g二苯胺（需在70%乙醇試劑中重結(jié)晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml過氯酸（60%以上），混勻待用，臨用前加入0.8ml1.6%乙醛溶液，所配試劑應為無色。每組需56ml共需2800ml２、DNA標準溶液：（須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標準DNA以0.01NNAOH配成200微克／毫升的標準液。每組需12ml共需600ml３、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。共需70ml４、(測樣品液：準確稱取豬脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克／毫升的溶液。每組需4ml

共需200ml第14頁/共17頁操作方法：

1.DNA標準曲線的制定：

取10支試管，分成2組，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA標準溶液。添加蒸餾水，使之都成為2ml。另取2只試管，各加2ml蒸餾水作為對照。然后各加入4ml二苯胺試劑，混勻。于60恒溫水浴中保溫1h，冷卻后于595nm處進行比色測定。取兩管平均值，以DNA濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.制品的測定：

取2支試管，各加2ml待測