Elisa原理及應(yīng)用解讀

會(huì)計(jì)學(xué)1Elisa原理及應(yīng)用解讀內(nèi)容一.Elisa的發(fā)展二.ELISA的定義三.ELISA的原理四.ELISA的基本方法五.ELISA的應(yīng)用六.ELISA類別七.ELISA的特點(diǎn)八.ELISA實(shí)驗(yàn)中使用的儀器第1頁/共17頁一.Elisa的發(fā)展

免疫標(biāo)記技術(shù)免疫熒光技術(shù)（IFA）放射免疫測(cè)定法（RIA）免疫酶測(cè)定法（EIA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶免疫組化法第2頁/共17頁二.ELISA的定義

是一類常用的免疫酶技術(shù)，將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，用酶標(biāo)記抗原或抗體，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，檢測(cè)液體中未知抗體或抗原的方法。第3頁/共17頁三.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。第4頁/共17頁在ELISA方法中有三個(gè)必要的試劑：固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）酶反應(yīng)的底物（顯色劑）第5頁/共17頁酶底物顯色反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420第6頁/共17頁四.ELISA的基本方法基本實(shí)驗(yàn)流程：微孔板包被抗體加樣品(抗原)孵育洗滌加酶聯(lián)二抗(辣根過氧化物酶)孵育洗滌孵育加終止液(硫酸溶液)加底物(鄰苯二胺)顯色比色第7頁/共17頁四.ELISA的基本方法包被抗體的酶標(biāo)反應(yīng)板加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去未結(jié)合的其他物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行抗原的定性或定量測(cè)定第8頁/共17頁五.ELISA的應(yīng)用ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍概括為四個(gè)方面：免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位研究抗酶抗體的合成顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份

第9頁/共17頁六.ELISA類別

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法，主要類型有：雙抗體夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法親和素-生物素-ELISA法第10頁/共17頁雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，先將已知抗體連接在固相載體上，待測(cè)抗原與抗體結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體原成正比。第11頁/共17頁間接法

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。第12頁/共17頁競(jìng)爭(zhēng)法

當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。第13頁/共17頁七.ELISA的特點(diǎn)：靈敏度高：ELISA測(cè)定法的靈敏度來自作為報(bào)告基團(tuán)的酶。由于酶的催化效率很高，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。特異性高：ELISA的特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果