清華物理學(xué)課件-生物物理

俺怎么越看越象乒乒乓乓，不要扔西紅柿～～～-_-b俺們的進(jìn)山全家福，hohoCOOHNH2每一種離子的分布都滿足Boltzmann分布函數(shù)第i種離子densityprofile:(x)i=ie-Zie(x)/kT接近表面處(x=0)：oi=ie-Zieo/kT其中：Zi為第i種離子的離子價(jià)(x):

electrostaticpotentialatxo為表面電勢(x=0處的(x))e為電子電荷i為第i種離子的體濃度7.生物膜的離體研究生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質(zhì)體方法脂單分子層技術(shù)Langmuir膜

兼性分子在空氣與水的界面上形成的單分子層。Langmuir-Blodgett(LB)膜

氣/液界面單層膜轉(zhuǎn)移到固體表面上形成的薄膜(單層或多層)。典型的能形成LB膜的分子：硬脂酸分子(兼性分子)的結(jié)構(gòu)及模型空氣水脂單分子層技術(shù)Langmuir膜的鋪展將要鋪展單層膜的兼性分子溶于適當(dāng)?shù)囊讚]發(fā)性有機(jī)溶劑中，滴加在適當(dāng)?shù)膩喯嗌?，待有機(jī)溶劑揮發(fā)掉以后，在亞相表面就懸浮著一層兼性分子。脂單分子層技術(shù)氣液界面上Langmuir膜制備裝置示意圖脂單分子層技術(shù)LB膜制備裝置示意圖垂直提拉法制備LB膜將單層膜保持在一定的壓力下，用事先處理好的固體載片沿著垂直方向緩慢地伸入和提拉出亞相，單層膜就會(huì)被連續(xù)地轉(zhuǎn)移到固體表面上。疏水襯底提拉(左)妾水襯底提拉(右)水平提拉法制備LB膜

將表面經(jīng)過疏水化處理的載片水平地放在亞相表面，使單層膜吸附轉(zhuǎn)移到載片表面。脂單分子層技術(shù)表面壓由于氣/液(如水)界面單分子層的存在，使液相的表面張力由0

降低為

，定義表面壓為=0-脂單分子層技術(shù)單層膜的-A曲線在等溫條件下改變膜太平的擋片的位置，并記錄的變化。以對分子的平均面積作圖，得到單層膜的曲線(等溫線)。單分子層-A曲線(等溫線)示意圖G:氣相(二維理想氣體狀態(tài)方程：A=kT)L-G:氣相-液相共存L:液相(狀態(tài)方程：

(A-Ao)=kT)M:凝膠相-液相共存S:固相

由于單分子層除了層內(nèi)分子間的相互作用外還有層內(nèi)分子與底部亞相中的液體分子之間的相互作用，這就使得單層膜可能出現(xiàn)一些中間狀態(tài)，與這些中間狀態(tài)相似的三維空間的相態(tài)至今還未發(fā)現(xiàn)過。Idealizedisothermsofpressure()versusarea(A)relationshipofphospholipidmonolayersshowingdifferentphasesandcoexistenceregions.Pressure-AreaisothermsofmonolayersofDPPConwateratthetemperaturesindicated.使用單層膜檢測A40的插膜單層膜檢測A40與A28插膜的比較單層膜檢測膽固醇對A40插膜的影響單層膜檢測A40插膜的膜組分依賴性脂單分子層技術(shù)表面收集法測量界面蛋白濃度原理圖Wang等人設(shè)計(jì)了一套真空吸取的辦法(BiophysicalJ.83(2002)985-993)，待熒光標(biāo)記的蛋白達(dá)到插膜平衡之后，將部分單層膜連同粘著的體相溶液收集，然后通過熒光強(qiáng)度的測量確定界面蛋白濃度。

倒置式熒光顯微膜天平的結(jié)構(gòu)原理示意圖

脂單分子層技術(shù)熒光顯微鏡膜天平技術(shù)觀測脂膜的相分離和運(yùn)動(dòng)LB膜在生物學(xué)中的應(yīng)用(1)脂類之間及脂類/蛋白之間相互作用的研究-A曲線，-t曲線，熒光顯微膜太平

(2)配體與受體間的分子識(shí)別(3)膜的粘著與融合(4)蛋白質(zhì)的二維結(jié)晶化(5)生物傳感器和生物芯片Two-dimensionalcrystallizationofavidinonbiotinylatedlipidmonolayers生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質(zhì)體方法固態(tài)支撐膜四種不同類型的固體表面支撐膜(A)支撐脂雙層與固體表面間由一層約1nm厚度的超薄水層分隔；(B)支撐雙層的內(nèi)層與固體表面通過靜電作用或共價(jià)鍵直接結(jié)合；(C)支撐雙層與固體表面間由一層超薄的軟多聚化合物分隔；(D)在固體表面先藕聯(lián)上超薄的多聚物層（如dextran），然后再通過共價(jià)藕聯(lián)將蛋白與多聚物結(jié)合在一起形成蛋白支撐膜。

制備支撐雙水分子層的3種方法(1993)a)LB技術(shù)b)SUV在親水襯底上融合c)SUV在疏水脂單層表面融合固態(tài)支撐膜固態(tài)支撐膜固體襯底表面生物功能化的方法如果要固定多聚物，如Dextran，可以先在表面上沉積一層帶有功能頭基（如環(huán)氧基，氨基，腈基）的長鏈表面活性劑單層膜和乙醇，乙醇的目的是使表面親水化，以防非特異性的蛋白吸附。通過活化的酯（如琥珀酰胺），將其結(jié)合到脂質(zhì)或聚合物鏈上，而蛋白上則化合上氨基，氨基與活化脂間結(jié)合將蛋白固定。這種方法很適合固定抗原表位或Fab片斷。在鎳或銅離子存在的情況下，NTA(Nitrilotriaceticacid)與寡聚組氨酸可以形成穩(wěn)定的鰲合物。利用此原理，制備鰲合脂質(zhì)NTA-lipid，在二價(jià)離子（如Ni2+,Cu2+）存在時(shí)鰲合脂質(zhì)與含有寡聚Histine的蛋白能結(jié)合。

全內(nèi)反射熒光技術(shù)Schematicillustrationofcontrolledassemblyofbiotin-lipidcontainingmonolayer/avidin/biotin-ssDNAcomplexonsolidsupport(a)andtherelatedSPRspectra(b).Supportedmembranesas“phantomcells”Incorporationofchargedlipids,gangliosides,andreceptorsintosupportedbilayersallowcontrolofelectrostatic,polymer-induced,andlock-keyforces(Science271(1996)43-48)

RICMvisualizationofaDMPCvesiclecontaining1mol%biotin-labeledlipidasthereceptorinteractingwithasurfacecoveredbystreptavidin.Theformationofadhesionplaquesiscausedbyinterplayofthestrongattractionbetweenreceptorsandtherepulsiveundulationforces.生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質(zhì)體方法為什么叫“黑脂膜”？顯微觀察磷脂成膜情況Schematicrepresentationoftheexperimentalset-upfortheformationofBLMbypaintingafilmoflipidonaholeonTefloncup.測量參數(shù)：電阻電容制備BLM的脂溶液

為了要模擬生物膜的脂組分，故BLM是從需要模擬的組織器官提取磷脂或鞘脂的。用得較多的有從腦組織提取的脂，葉綠粒抽提物，膽固醇，氧化膽固醇以及純的PC，PE，PS等。

BLM制備液一般應(yīng)將高度純化的磷脂溶于碳?xì)淙軇绻锿椋镣?，苯，氯仿或乙醇等。有時(shí)也用鯊烯作溶劑，因?yàn)轷徬?huì)在BLM形成過程中被排擠出來，使BLM成為無溶劑的BLM。這種BLM更接近自然生物膜的基架。一般情況下溶劑碳?xì)滏溤贑6一CI16間較適宜，它們在室溫時(shí)都是液態(tài)，極少溶于水。BLM制備液中如含有雜質(zhì)就不易鋪制出BLM。

對稱BLM的鋪制

實(shí)驗(yàn)槽中間以聚四氯乙烯作為隔板（BLM支持物），隔板中間開一小圓孔，面積一般不要超過0.25平方厘米。

槽內(nèi)放上適當(dāng)?shù)木彌_溶液，把小孔浸沒。然后把一滴BLM制備液加到隔板的小孔下方（用毛刷或微量注射器）。由于聚四氯乙烯具有良好的親脂疏水性，故脂較容易附在小孔四周，并擴(kuò)展過整個(gè)小孔，隨后脂滴的中間部分慢慢變薄，最后成為雙分子層，而沿著小孔四周則積有較厚的脂層，成為一個(gè)圈，它對BLM起支持作用，這一圈稱P－G邊界（Plateau－Gibbsborder）。脂滴在小孔中形成雙分子層脂膜是一個(gè)自發(fā)的漸變過程。通過光學(xué)或電學(xué)的方法可以驗(yàn)證雙分子層是否已經(jīng)形成。

毛刷法鋪制對稱BLM

TheformationofBLMbyapposingtwomonolayersonahydrophobicpartitionbyraisingtheleveloftheaqueousphaseonwhichamonolayerhasbeenformed.

不對稱BLM的制備(1)由單層合成雙層的BLM鋪制法隔板固定而使兩側(cè)溶液液面移動(dòng)的方法：使兩個(gè)可以同步推進(jìn)的注射器與聚四氟乙烯隔板兩側(cè)的溶液連通并使左右液面保持在同一水平上。同步推進(jìn)注射器，使兩側(cè)液面升至小孔下方2－3毫米處。在兩側(cè)溶液面上分別滴加BLM制備液，BLM制備液在液面擴(kuò)展為單分子層，此時(shí)再使二注射器同步推進(jìn)，使二側(cè)面上升經(jīng)小孔而達(dá)小孔上方2－3毫米處方才停止。當(dāng)二側(cè)脂單層上升經(jīng)過小孔時(shí)，合而形成脂雙層。如果脂溶劑是易揮發(fā)的，這樣形成的BLM還能做到不含脂溶劑。另一相似的方法是使聚四氟乙烯隔板可以上下移動(dòng)，但仍能保證左右兩側(cè)之間有良好的絕緣性。鋪制時(shí)先將隔板向上提起，使小孔上升至液面之上，將BLM制備液分別滴在左右兩側(cè)的水面上．脂即在水面上擴(kuò)展為脂單分子層。如果在兩側(cè)水面上鋪展不同的脂，則兩邊的單分子層就不對稱。然后將隔板向下移，當(dāng)隔板的小孔移到液面下時(shí)，很自然地在小孔上就形成了雙分子脂層。鋪成的BLM并不是靜止不動(dòng)的，雙層的脂分子是流動(dòng)的，兩側(cè)不同的脂分子在P－G邊界中會(huì)混合在一起，而P－G邊界中的脂分子是會(huì)同雙分子層中的脂分子通過流動(dòng)而進(jìn)行交換的，最后在BLM中的脂也就不可能保持不對稱了。但是這種方法可以確保BLM兩側(cè)溶液不會(huì)混合，因而可以進(jìn)行膜兩側(cè)溶液不對稱時(shí)的各種研究。TheformationofBLMbyapposingtwomonolayersonthetipofamicropipettebyfirstremovingthetipfromtheaqueousphaseonwhichamonolayerispresent,andthenreinsertingthetipthroughthemonolayer.不對稱BLM的制備(2)

在濾紙的微孔中形成BLM

在顯微鏡下觀察濾紙，可以看到上面有許多微孔。有人把濾紙先用脂浸泡，然后取出晾干，這樣濾紙就具有親脂疏水特性。用這種脂處理過的濾紙放在聚四氟乙烯隔板的部位取代聚四氟乙烯隔板（當(dāng)然要有特別設(shè)計(jì)的夾具，把濾紙夾在左右二室之間）。然后用前面介紹的方法鋪制BLM，實(shí)踐證明在濾紙的許多小孔上都形成了BLM，只是每個(gè)BLM的面積小，但是許多小面積的BLM加起來就比單個(gè)“大”孔上鋪成的BLM還大。生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質(zhì)體方法Temperatureinducedshapechangesofvesicles(1990).

(a)Transitionofavesiclefromabiconcaveshape(center)toaninvaginated(stomatocyte)shape(leftside)atdecreasingtemperatureandtoabuddedshape(rightside)atincreasingtemperature.Shapesofvesicles(orcells)onthebasisofthebilayercouplinghypothesismodel(1983):Thedifferentcellshapescanbeexplainedintermsoftwoparameters:1)thereducedvolumev=v/vs:theratiooftheactualvolumeofthecelltothatofasphere,2)therelativeareadifference=(A0-Ai)/(A0,s-Ai,s)

whereA0andAiaretheareasoftheouterandinnerleafletofthemembraneandwhereA0,sandAi,sarethecorrespondingvaluesofthesphere.Shapetransformationofgiantvesicletriggeredbytemperaturechanges.Thetransitionsarecompletelyreversible!

Phasecontrastmicrographsofshapechangeofcompositeshell(1998).

DMPCvesiclecontaining2Mofactin(imageaandb)and7M(imagecandd)ofactin.脂質(zhì)體的類型：SUV：小單片層脂質(zhì)體(smallunilaminar-)MLV：多片層脂質(zhì)體(multilayer-)LUV:大單片層脂質(zhì)體(largeunilaminar-)

脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層組成的內(nèi)部為水相的閉合囊泡。SUV(小單層囊泡)的制備(1)：

方法一：將磷脂用氯仿溶解，通氮?dú)飧稍?，用真空泵或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器驅(qū)除殘留溶劑。加入所需的水相，使脂質(zhì)濃度在mM范圍。之后，懸浮液在探頭式或水浴式超聲儀中超聲至透明（溫度視脂質(zhì)而異，保持在相變溫度以上，但過高溫度時(shí)脂質(zhì)易氧化）。用探頭式時(shí)僅帶幾分鐘，用水浴式則右時(shí)長達(dá)2小時(shí)。雖然用水浴式費(fèi)時(shí)長，但此時(shí)超聲可在充氮?dú)獾拿荛]容器中進(jìn)行。用負(fù)染電鏡術(shù)，可檢驗(yàn)?zāi)遗莸拇笮?，其直徑下限可達(dá)20nm。實(shí)用中往往要加入膽固醇成分，此時(shí)直徑至少50nm。SUV(小單層囊泡)的制備(2):

第二種方法是將脂質(zhì)的乙醇溶液快速注入到緩沖液中，隨即自發(fā)地形成SUV。脂質(zhì)的最終濃度為3—30mM。所形成的囊泡直徑范圍為30-110nm，與脂質(zhì)的濃度有關(guān)。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是避免了超聲的損傷．且快速、簡單及溫和，但脂質(zhì)體的濃度相當(dāng)稀，需要進(jìn)一步濃縮，另一個(gè)缺點(diǎn)是高濃度的乙醇必須由隨后的純化階段去除。SUV(小單層囊泡)的制備(3):

方法三：將MLV的懸浮液以20，000磅／英寸的壓力，4℃時(shí)通過French濾器擠排。四次擠排后，94％囊泡的大小范圍為31.5－52.5納米。該法所得囊泡較超聲法的略大，能適用于各種脂質(zhì)。此外，操作簡單、重復(fù)性好，亦無超聲損傷。MLV(多層囊泡)的制備(1)：

根據(jù)Bangham的方法:

在100毫升圓底燒瓶中，用氯仿溶解10毫克含5摩爾％PA的eggPC，通氮?dú)馊コ确?，在燒瓶壁形成磷脂薄膜。將燒瓶置于真空中，過夜（或數(shù)小時(shí)）除去剩留的溶劑。然后加入所需的水溶液5毫升，脂質(zhì)水化數(shù)小時(shí)（相變溫度之上）。然后用旋渦混合器振搖，即得MLV的懸浮液。

MLV中各片層之間的間隔取決于VanderWaais吸引力和水化、靜電的排斥力之間的平衡。生理鹽濃度條件下，PC組成的MLV中各片層之間的間距約2.8納米。脂質(zhì)帶負(fù)電時(shí)，間距增加（特別是在低離子強(qiáng)度時(shí)）。制備中加酸性磷脂(如PA)的道理就在于此。

MLV適于包囊各種物質(zhì)，也適于各種脂膜。其制備法是所有脂質(zhì)體制備中最簡單的。缺點(diǎn)是大小分布很不均勻，包裹效率也不高。MLV(多層囊泡)的制備(2)：多層囊泡的脫水形成（脫水一再水化循環(huán)法)

0.1微摩爾磷脂用超聲分散于1毫升水中。將待包裹的物質(zhì)加入，通干燥的氮?dú)鈱⑺终舭l(fā)。在干燥的過程中，SUV被濃縮，彼此融合形成多片層的平板，因而將待包裹的物質(zhì)夾在諸片層之間。干燥畢，把濕棉花塞入試管或通以含水汽的氮?dú)饬鲙仔r(shí)以使脂質(zhì)再水化。此時(shí)，多片層膨潤，形成大的囊泡。從而俘獲大部分的溶質(zhì)。然后加入水，將混合物輕輕振蕩以分散脂質(zhì)囊泡。若再通過聚碳酸酯濾膜，則可分選大小。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是包裹效率極高，對DNA分子能達(dá)50％（10毫克脂質(zhì)包裹1毫克DNA)，也能有效地包裹蛋白質(zhì)。制備過程中酶的活性仍保持近90％。此外，適用于幾乎所有的磷脂。但該法易受水相中無機(jī)離子的影響，此外不太適用于包裹較小的分子。LUV(大單層囊泡)的制備(1):注入法將非極性溶劑中的脂質(zhì)溶液在使溶劑能揮發(fā)的條件下注入到水溶液中，溶液中脂質(zhì)即以薄膜的形式殘留在氣泡和液相的界面上。可以計(jì)算出，薄膜的組成僅是幾個(gè)脂雙層。當(dāng)氣泡通過水相上升時(shí)，片層分散后形成單片層的脂質(zhì)體。最后用聚碳酸酯濾膜分選大小。具體方法：4毫升戊烷或乙醚的脂質(zhì)溶液（1－2毫摩爾脂質(zhì)）緩慢地注入到4毫升、60℃的水相中（0.2毫升／分）。水相中緩慢地通氮?dú)馀菀源偈谷芤夯靹颍瑫r(shí)給空氣一溶液的界面上提供惰性環(huán)境、增加氣泡的大小，從而有利于單片層囊泡的形成。注入完全后，將脂質(zhì)體懸浮液通過聚碳酸酯濾膜以分選大小、去除凝聚體。然后，再用凝膠柱過濾（例如Sephadex。G－25或G－50，BiogelP－10）進(jìn)一步去除殘留的溶劑。注入法的好處是適用于各種脂質(zhì)，而且在1小時(shí)內(nèi)即可完成。主要的限制是最終的制劑相當(dāng)?。?一15毫摩爾），因而包裹效率低。該法能得直徑為150－250納米的LUV。LUV(大單層囊泡)的制備(2):反相蒸發(fā)法（REV）

Szoka等設(shè)計(jì)了另一種制備LUV的方法。該方法中，水一非極性溶劑混合液中的脂質(zhì)分子形成內(nèi)翻型微團(tuán)，此時(shí)脂質(zhì)的尾部插入非極性相，而頭部基團(tuán)包圍水滴。當(dāng)非極性溶劑在真空中蒸發(fā)后，微團(tuán)彼此結(jié)合，形成大的單片層的囊泡。典型制備時(shí)，66微克分子（50毫克）脂質(zhì)溶于3毫升乙醚，加入1毫升水相（PBS等緩沖液及待包物質(zhì)），通氮?dú)庀滤苁匠?－5分，直至混合物變?yōu)榍迤愕囊幌鄳腋∫夯蚓鶆虻娜榘咨海ǔ暫?0分內(nèi)水和油相不分離）。然后，移至旋轉(zhuǎn)蒸器中，用水泵抽氣驅(qū)除乙醚。當(dāng)大部分溶劑除去后，懸浮液呈凝膠狀，經(jīng)2－3次旋渦振蕩后再繼續(xù)減壓蒸發(fā)，直至得到均一的懸浮液．最后進(jìn)過孔直徑0.2微米的聚碳酸脂濾膜，即能得到大小校均勻的LUV。也可用透析或上Sepharose4B柱或離心等方法除去未包裹的物質(zhì)及殘留的有機(jī)溶劑。

REV法的優(yōu)點(diǎn)是：1.水相的包裹容積大（水相離子強(qiáng)度低時(shí)，如0.01摩爾NaCI，能達(dá)65％）；2.能包裹大的生物高分子，如鐵蛋白、25SRNA；3.制備過程中不受水溶性蛋白質(zhì)存在的影響，也不受磷脂種類的影響；4.水相容積從02毫升至10毫升都可以處理。主要的缺點(diǎn)是待包物質(zhì)暴露于有機(jī)溶劑中，且要經(jīng)短時(shí)間超聲，這樣可能導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的變性或DNA斷裂。LUV(大單層囊泡)的制備(3):去垢劑稀釋法將過量去垢劑(超過CMC)加入到膜懸浮液中直到因形成去垢劑-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)的混合微團(tuán)而變得澄清為止。此后緩慢降低去垢劑的濃度(如透析)，致使脂質(zhì)與膜蛋白形成囊泡狀膜結(jié)構(gòu)，這樣就能達(dá)到重組蛋白的作用。去垢劑如膽酸鹽、TritonX－100等用于脂質(zhì)體重組已取得很大成功。

現(xiàn)列舉典型的去垢劑一LUV法：eggPC和脫氧膽酸鹽混合成1毫升溶液（20微克分子脂質(zhì)：10微克分子去垢劑）。水浴超聲數(shù)分，最初的渾濁懸浮液即變?yōu)橥该鳡睿ㄒ蚧旌衔F(tuán)的形成）。然后用凝膠過濾除去脫氧膽酸鹽。囊泡的直徑約100納米，可認(rèn)為是小的LUV。俘獲容積為2－3升／摩爾。用該法已成功地包裹了細(xì)胞色素C和葡萄糖等。

去垢劑稀釋法已廣泛地應(yīng)用于膜蛋白脂質(zhì)體的重組。方法學(xué)上的限制是，透析時(shí)需幾小時(shí)甚至幾天才能完成；此外，如果被包裹的溶質(zhì)能夠通過透析膜，則包裹效率就非常低。LUV(大單層囊泡)的制備(4):SUV融合法1.鈣促融合法Panahadjonoulos等將負(fù)電荷磷脂的SUV和Ca2＋混和，再用EDTA螯合Ca2＋。當(dāng)Ca2＋與含PS的SUV相互作用時(shí)，囊泡首先凝聚形成沉淀，融合形成多片層結(jié)構(gòu)。而后用EDTA去除Ca2＋時(shí)，該片層結(jié)構(gòu)膨脹，形成大的單層囊泡。典型實(shí)驗(yàn)中，1－10毫摩爾不飽和PS用以制備SUV。加入足量的CaCI2，使Ca2＋／脂質(zhì)之比為1：2。此時(shí)SUV沉淀。然后，加入稍過量的EDTA，攪拌直至沉淀物形成LUV的透明懸浮液。這樣所形成的囊泡，能夠在相當(dāng)溫和的條件下包裹諸如病毒、核酸及鐵蛋白等結(jié)構(gòu)。俘獲容積約7升／摩爾，20毫摩爾脂質(zhì)懸浮液中包裹效率約10－15％。2.冰凍一融化一超聲法第二種融合方法是冰凍一融化一超聲的方法。典型步驟是，30毫克脂質(zhì)在1毫升緩沖液中超聲形成SUV。然后加進(jìn)待包物質(zhì)?；旌衔镌谝旱斜鶅?，然后再融化。冰凍一融化過程可根據(jù)情況一次或兩次。再在水浴中超聲30秒（超聲目的主要是用以分散聚集體）。最終所形成的囊泡對離子不易通透，俘獲容積約8升/摩爾。該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單且溫和，且可用于膜蛋白重組。然而，在有蔗糖、高濃度離子或有二價(jià)陽離子存在時(shí)效果不好。Threemethodsforreconstitution.(1)Lipidandproteinssolubilizedindetergentsaremixedandthenthedetergentisremovedbydialysis,dilution,orgelfiltration.(2)Delipidatedproteinscansometimesbespontaneouslyincorporatedintoapreformedbilayer.(3)Partiallydelipidatedproteinswithasmallamountofdetergentssometimesformdiscsthatcanfusewithpreformedvesicles(膽酸鹽法).重組脂質(zhì)體right-side-outvesicles:0.5MNa2PO4and0.1MMg+.inside-outvesicles:0.5MNa2PO4.redbloodcell紅細(xì)胞膜制備脂質(zhì)體生物膜的離體研究脂單層方法支撐脂雙層方法平面脂雙層(黑脂膜)方法脂質(zhì)體方法去污劑與膜的分離

對于生物膜結(jié)構(gòu)與功能的研究，通常需要將膜解聚成各種組分。抽提分析膜脂，一般使用有機(jī)溶劑。對于膜蛋白，有機(jī)溶劑也是可以使用的，但是許多蛋白在有機(jī)溶劑中容易變性，沉淀。因此，要針對不同類型的膜蛋白選擇不同的提取方法。溶解膜蛋白可以采用：螯合劑，改變離子強(qiáng)度和pH值，蛋白的變性劑（如脲、胍等），酶解等方法，但對于膜內(nèi)在蛋白，上述方法分離效果都不好，只能采用去污劑抽提的方法。Methodsforsolubilizationofmembraneproteins.Stepsusuallyinvolvedaresaltwash(whichremoveselectrostaticallyboundproteins)followedbysonicationordetergenttreatment,orsolubilizationinanorganicsolvent.用去污劑溶解膜內(nèi)在蛋白

搞清去垢劑溶解膜磷脂和膜蛋白的先后次序

Klingenberg實(shí)驗(yàn)室利用CAT(抑制劑)飽和的線粒體膜研究去垢劑對這種線粒體膜的作用機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去垢劑與蛋白的比例為1:1時(shí)，當(dāng)膜上的磷脂約有50％被溶解后，才開始觀察到CAT－蛋白復(fù)合體被溶解。因此，去垢劑對這種線粒體膜的作用，首先是磷脂被溶解，然后才是蛋白被溶解。由此可以設(shè)想，去垢劑單體分子首先“攻擊”磷脂的雙分子層，使脂的雙分子層變成松散，然后才作用于CAT－蛋白復(fù)合體上。Detergent的單體與團(tuán)粒在溶液中處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。由于單體分子不斷深入到磷脂雙層中，使團(tuán)粒不斷解離成單體。當(dāng)愈來愈多的去垢劑分子深入到脂雙層而形成復(fù)合的磷脂－去垢劑團(tuán)粒時(shí)，蛋白分子被包圍，最后被溶解下來。需要了解去污劑的性質(zhì)及其作用機(jī)理

純化鑒定膜蛋白，使用去污劑是必須的。在使用去污劑溶解的過程中，膜被破壞，蛋白與脂雙層以及細(xì)胞骨架之間的作用被去除，取而代之的是蛋白與去污劑之間的作用。蛋白被去污劑溶解后，膜蛋白就如同水溶性蛋白一樣可被進(jìn)一