催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)抑制動(dòng)力學(xué)

催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)抑制動(dòng)力學(xué)第一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)單底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第三節(jié)多底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第四節(jié)別構(gòu)酶動(dòng)力學(xué)第五節(jié)pH和溫度對(duì)酶催化反應(yīng)速度的影響主要內(nèi)容第四章酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)抑制作用動(dòng)力學(xué)變性作用:破壞酶蛋白的次級(jí)鍵,部分或全部改變酶的三級(jí)結(jié)構(gòu);抑制作用:某些化學(xué)試劑不引起變性,但能使酶蛋白分子上某些必需基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化,引起酶活力降低或喪失;抑制劑:凡能降低酶催化反應(yīng)速度的物質(zhì)都稱之為.特性:與酶的必須基團(tuán)(包括活性基團(tuán)及輔基)結(jié)合；改變影響其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，引起酶反應(yīng)速度下降；它對(duì)酶有選擇性，不包括酶蛋白的水解及變性失活作用。研究意義：對(duì)生物機(jī)體代謝途徑、藥物作用機(jī)理、酶活性中心內(nèi)功能基團(tuán)性質(zhì)、酶構(gòu)象維持基團(tuán)性質(zhì)、底物專一性、酶作用機(jī)理等研究的促進(jìn)作用。第三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日抑制劑對(duì)酶活性的影響酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn):a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過(guò)渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。第四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日抑制類型分類

1、不可逆抑制作用(irreversibleinhibition)與時(shí)間有關(guān)指抑制劑與酶的活性中心發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，抑制劑共價(jià)地連接到酶分子的必需基團(tuán)上，阻礙了底物的結(jié)合或破壞了酶的催化基團(tuán)，不能用透析或稀釋的方法使酶活性恢復(fù)。不可逆抑制作用相當(dāng)于失活的酶濃度。

又分專一性和非專一性不可逆抑制兩類；前者和活性部位基團(tuán)反應(yīng)，后者和一類或幾類基團(tuán)反應(yīng)；區(qū)分不是絕對(duì)的；非專一性抑制劑用途更廣；第五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2、可逆抑制作用(reversibleinhibition)與時(shí)間無(wú)關(guān)；抑制劑與酶蛋白以解離平衡為基礎(chǔ),以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑制劑可以通過(guò)物理方法(如透析等)被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性,這種作用稱為可逆抑制作用。第六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日可逆與不可逆的區(qū)分(1),一定量抑制劑與酶溶液混合，預(yù)保溫后取不同量的混合液測(cè)定其初速，用反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖：區(qū)別（一）123v測(cè)定體系中的[E]不可逆,相當(dāng)減少[E]無(wú)抑制可逆抑制第七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日(2),抑制劑一定量，用不同酶濃度測(cè)活，同（1）作圖v[E]123區(qū)別（二）消除不可逆抑制劑不可逆可逆,斜率減小第八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日（3）抑制劑不同量，作初速度與酶濃度關(guān)系圖區(qū)別（三）v[E]Iv[E]II3I2I1I0I0I1I2I3消除不可逆抑制劑第九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日非專一性不可逆抑制非專一性不可逆抑制劑可對(duì)酶分子上每個(gè)結(jié)構(gòu)殘基進(jìn)行共價(jià)修飾而導(dǎo)致酶失活。這類抑制劑主要是一些修飾氨基酸殘基的化學(xué)試劑，可與氨基、羥基、胍基、酚羥基等反應(yīng)，如烷化巰基的碘代乙酸等，重金屬Hg2+、Pb2+、Cu2+、三價(jià)砷等。一、不可逆抑制作用第十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日（一）非專一性不可逆抑制劑1、?；噭?酸酐、乙酰咪唑等，作用基團(tuán)：氨基、羥基、酚基、巰基2、烷化試劑：帶有活潑鹵素原子，易烷化親核側(cè)鏈基團(tuán)，2，4-二硝基苯氟等，作用基團(tuán)：氨基、巰基、羧基、硫醚等；其中最主要的是含鹵素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰氨、鹵乙酰苯等。它們可使酶中巰基烷化，從而使酶失活。常用作鑒定酸中巰基的特殊試劑。

巰基酶

碘乙酸胺

失活的酶第十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日3、有機(jī)磷化合物：能與酶活直接相關(guān)的絲氨酸上的羥基結(jié)合，抑制蛋白酶與酯酶；例：抑制神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿酯酶，使乙酰膽堿不能分解而堆積引起神經(jīng)中毒，二戰(zhàn)中使用的毒氣DFP，有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑（敵百蟲(chóng)）:由于乙酰膽堿堆積，使神經(jīng)處于過(guò)渡興奮狀態(tài)，引起功能失調(diào)，導(dǎo)致中毒。如昆蟲(chóng)失去知覺(jué)而死亡；魚(yú)類失去波動(dòng)平衡致死；人、畜產(chǎn)生多種嚴(yán)重中毒癥狀以至死亡等。但對(duì)植物無(wú)害故可在農(nóng)業(yè)、林業(yè)上用作殺蟲(chóng)劑。(有機(jī)磷化合物有時(shí)可用含－CH＝NOH基的肟化物，或羥肟酸R－CHNOH化物將其從酶分子上取代下來(lái)，使酶恢復(fù)活性。故將此類化臺(tái)物稱為殺蟲(chóng)劑解毒劑，如常用的解磷啶（PAM）就是其中的一種。)第十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日非專一性不可逆抑制劑4、親電試劑：缺乏電子試劑，有氧化能力，四硝基甲烷作用基團(tuán)：酚基EOHCNO2O2NNO2NO2+EOHNO2第十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日非專一性不可逆抑制劑5、有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物：和巰基作用；(1)對(duì)氯汞苯甲酸;加入過(guò)量巰基化合物如半胱氨酸解除；E-SH+ClHgCOO-E-S-HgCOO-路易斯毒氣作用機(jī)制(2)三價(jià)有機(jī)砷與輔酶硫辛酸作用，抑制了丙酮酸氧化酶系統(tǒng)，可被過(guò)量雙巰基化合物如二巰基丙醇解除；第十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日非專一性不可逆抑制劑6、氧化還原劑：光敏劑氧化，作用于巰基、硫醚基、酚基等。還原劑有巰基乙醇等，作用于巰基。7,氰化物—與含鐵卟啉的酶中的Fe2+結(jié)合，使酶失活而阻抑細(xì)胞呼吸。木薯、苦杏仁、桃仁、白果等都含有氰化物，以及工業(yè)污水和試劑中的氰化物等進(jìn)入體內(nèi)，均可造成嚴(yán)重中毒。臨床上搶救氰化物中毒時(shí)，常先給注射亞硝酸鈉．使部分HbFe2+氧化生成HbFe3+，而奪取與細(xì)胞色素氧化酶（Cyta3）結(jié)合的CN-，生成HbFe3+－CN-，再注射硫代硫酸鈉，將由HbFe3+－CN-中的CN-逐步釋放，在肝臟硫氰生成酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)毒的硫氰化物，隨尿排出，從而解除其抑制。

第十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日8,重金屬—Ag+、Hg2+、Pb2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+等;在高濃度時(shí)可使酶蛋白變性失活，低濃度時(shí)可與酶蛋白的巰基、羧基和咪唑基作用而抑制酶活性。應(yīng)用金屬離子螯合劑如EDTA、半胱氨酸或焦磷酸鹽等將金用離子螯合，可解除其抑制，恢復(fù)酶活性。

9,青霉素—抗菌素類藥物，與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位Ser-OH共價(jià)結(jié)合，使酶失活。非專一性不可逆抑制劑第十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日10、生物自由基對(duì)酶類的作用自由基（Freeradical，F(xiàn)R）是指能獨(dú)立存在的含有一個(gè)或一個(gè)以上未配對(duì)電子（即外層軌道上具有奇數(shù)電子）的原子、原子團(tuán)、分子或離子。未配對(duì)電子的存在賦予自由基以順磁性和高度化學(xué)反應(yīng)活性的特點(diǎn)，且總有變?yōu)槌蓪?duì)電子的傾向，因而性質(zhì)極不穩(wěn)定，常易發(fā)生喪失或得到電子的氧化－還原反應(yīng)。其中作用最廣、研究最多的當(dāng)屬含氧自由基（或稱活性氧），過(guò)量自由基產(chǎn)生可造成機(jī)體細(xì)胞非特異性氧化損傷，如引起DNA堿基修飾、鏈斷裂、酶蛋白變性失活等，從而關(guān)聯(lián)到多種疾病病理生理過(guò)程。

非專一性不可逆抑制劑第十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日生物自由基對(duì)酶分子的不可逆抑制作用是廣泛的。例如，可修飾GSH-PX活性部位的一個(gè)巰基與其相鄰的Se元素，攻擊活性部位的－SH使之失活。在酶蛋白分子中，蛋氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸等最易受到自由基的攻擊而被氧化，這是由于它們具有不飽和性質(zhì)，如組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚羥基、色氨酸的吲哚基等。第十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日酶不可逆抑制動(dòng)力學(xué)判斷必需基團(tuán)性質(zhì)和數(shù)目建立于動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上,按偽一級(jí)反應(yīng)處理;方法核心:分別測(cè)定蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)中,基團(tuán)被修飾的反應(yīng)速度和蛋白質(zhì)失活的反應(yīng)速度,用半對(duì)數(shù)法比較兩者反應(yīng)速度常數(shù),判斷必需基團(tuán)性質(zhì)和數(shù)目。1,Ray-Koshland法1.00反應(yīng)時(shí)間/min“慢反應(yīng)“—NH2胰蛋白酶抑制活力“快反應(yīng)”—NH2相對(duì)變化第十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2，鄒氏作圖法以統(tǒng)計(jì)學(xué)為基礎(chǔ)，根據(jù)必需基團(tuán)與非必需基團(tuán)與試劑作用的反應(yīng)速度和其它性質(zhì)不同將化學(xué)修飾分六種：（1）修飾試劑僅作用于一類基團(tuán)且必需基團(tuán)與非必需基團(tuán)作用速度相等；（2）同類基團(tuán)中，必需基團(tuán)與非必需基團(tuán)作用速度相差很大；（3）同類基團(tuán)中，必需基團(tuán)與非必需基團(tuán)作用速度不等但相差不大；（4）必需基團(tuán)已全部被除修飾的酶分子尚有殘余活力aT;（5）同類基團(tuán)中保留其中之一即保有全部活力；（6）試劑作用于兩種不同側(cè)鏈基團(tuán)，二者均含有必需基團(tuán)；本是描述蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的化學(xué)修飾與其生物活性之間定量關(guān)系，也可用來(lái)判斷必需基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)量；第二十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日鄒氏作圖法判斷必需基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)量可通過(guò)測(cè)定酶活力降低程度和側(cè)鏈基團(tuán)被破壞程度之間的關(guān)系加以分析得出；鄒氏作圖法：(第（1）種情況例)測(cè)定不可逆抑制劑作用過(guò)程的酶活力剩余分?jǐn)?shù)a的同時(shí)測(cè)定某一種必需基團(tuán)的剩余分?jǐn)?shù)x；同類基團(tuán)有i個(gè)是必需的，若這些基團(tuán)反應(yīng)速度相等，只有那些i個(gè)必需基團(tuán)都沒(méi)有被破壞的酶才能保存活力取對(duì)數(shù)得：法一：剩余活力百分?jǐn)?shù)i次方根與基團(tuán)剩余百分?jǐn)?shù)作圖有直線關(guān)系，以lga對(duì)lgx作圖得一條直線，從而求出該必需基團(tuán)的數(shù)目。第二十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日法二：假設(shè)一系列i值，以a1/i~x作圖，能獲得直線的i即為必需基團(tuán)數(shù)目；xa1/i1010i=1i=2對(duì)羥基甲酰甲醛修飾牛胰核糖核酸酶第二十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日（二）專一性不可逆抑制作用根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，具有和底物類似的結(jié)構(gòu)，還帶有能和活性部位其它基團(tuán)結(jié)合的基團(tuán)，又稱親和標(biāo)記試劑；選擇性來(lái)源于與活性和非活性部位形成絡(luò)合物的解離常數(shù)比值；1、Ks型不可逆抑制第二十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日Ks型的判斷（1）化學(xué)計(jì)量，酶活全喪失；（2）底物、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑具保護(hù)作用；（3）使酶可逆失活，失活后即不與不可逆抑制劑作用。第二十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)用通過(guò)對(duì)酶蛋白親和標(biāo)記來(lái)研究酶活性中心結(jié)構(gòu)；原理：抑制劑上引入特殊光學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，而這些基團(tuán)可反應(yīng)酶分子局部微環(huán)境區(qū)的不同，稱之為“報(bào)告基團(tuán)”。第二十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日例：胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的底物與不可逆抑制劑比較。前者底物有一帶正電荷的側(cè)鏈，后者底物要求具一芳香性的側(cè)鏈；Ia（對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮）,IIa是抑制劑，Ib（對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰甲酯）,IIb是底物；Ia和IIa，Ib和IIb具相同結(jié)合基團(tuán)，不同的是Ia，IIa具一個(gè)活潑氯甲基，被羰基活化后可作為烷化劑與酶活性部位基團(tuán)作用。圖4-14.R—C—CHCl2R—C—CH3抑制劑底物第二十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2、Kcat型不可逆抑制劑根據(jù)酶催化過(guò)程設(shè)計(jì)；對(duì)酶作用機(jī)制有預(yù)了解；與底物相似的與酶結(jié)合和被酶催化反應(yīng)性質(zhì)，還具一個(gè)潛伏基團(tuán)；潛伏基團(tuán)活化與活性中心共價(jià)結(jié)合使之停留在此結(jié)合狀態(tài)，不能再分解生成產(chǎn)物，酶因而致“死”，此過(guò)程稱酶“自殺”失活作用。Ss為自殺性底物，Is為Ss被酶催化后的抑制物，過(guò)程如下：第二十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)：Ss單純與E結(jié)合還不能成為抑制劑，只有轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物I后Is后才可；Kcat越大生成產(chǎn)物數(shù)也越快，抑制作用越強(qiáng)；Kcat更重要??；（1）SS濃度越大抑制作用也越大呈一級(jí)反應(yīng)；（2）最適用pH與底物的一致；（3）SS過(guò)量時(shí)，酶量越多抑制作用越強(qiáng)；（4）SS本身無(wú)抑制活性，生成的Is是一種親和標(biāo)記的抑制劑；（5）必需基團(tuán)與Is化學(xué)計(jì)量關(guān)系是1：1；（6）真正的底物能競(jìng)爭(zhēng)性阻斷Ss的抑制作用。第二十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日例β-羥基癸酰硫酯脫水酶；催化羥基癸酰硫酯脫水并催化產(chǎn)生的β,γ順式和α，β反式雙鍵兩種化合物轉(zhuǎn)變；3，4-癸炔酰-N-乙酰半胱胺為其不可逆抑制劑，其炔基可轉(zhuǎn)化為具有連丙二烯結(jié)構(gòu)化合物，此化合物可烷化活性中心有關(guān)基團(tuán)；與黃素有關(guān)的單胺氧化酶和以哆醛為輔基的酶都能被有關(guān)炔類化合物以這種方式不可逆抑制。CH3—（CH2）5—C三C—CH2—C—SRECH3—（CH2）5—CH=C—CH—C—SREOOEnzNNH..不可逆失活H第二十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日醫(yī)學(xué)應(yīng)用酶不但可作出了為治療手段，同時(shí)也可作為靶子使致病菌或異常細(xì)胞中某些酶被特定化合物抑制失活，從而使病菌或異常細(xì)胞死亡；酶失活劑對(duì)人體有毒，而自殺底物與酶天然底物一樣對(duì)人體無(wú)毒，故有極高醫(yī)學(xué)價(jià)值！1，迫降靈是線粒體上單胺氧化酶自殺底物，腸道吸收的代謝產(chǎn)物酪胺在酶被“殺死”后進(jìn)入血液循環(huán)成為假神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致血壓下降；2，癲癇病的治療人腦中氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶破壞腦中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)氨基丁酸,導(dǎo)致癲癇病發(fā)作;乙烯代氨基丁酸可殺死該酶;此酶被殺死后,氨基丁酸量增高,腦中樞受抑,從而治療了此病.第三十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日二、可逆抑制作用可逆抑制劑與酶結(jié)合后產(chǎn)生的抑制過(guò)程可依米氏學(xué)說(shuō)加以推導(dǎo),定出其定量關(guān)系;可逆抑制的動(dòng)力學(xué)關(guān)系由抑制劑與酶的解離常數(shù)Ki和抑制劑的濃度決定。第三十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日一些重要的可逆抑制劑最重要的是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。如：磺胺藥、TMP、氨基葉酸等。用增加底物濃度的方法可以減弱抑制作用?；前匪幬锏淖饔脵C(jī)制：第三十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，可逆抑制分為以下幾種類型

競(jìng)爭(zhēng)性抑制（link)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(link)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(link)線性混合抑制(link)底物抑制(link)附：產(chǎn)物抑制(link)附：激活劑(link)(go)第三十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日(一)、競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(competitiveinhibition)某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。指抑制劑I和底物S對(duì)游離酶E的結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用，互相排斥。特征：1，結(jié)構(gòu)與正常底物相似；2，不形成EIS三聯(lián)復(fù)合物；3，一旦形成EI后，由于I缺少具反應(yīng)活性的基團(tuán)或位置不當(dāng)，形成死端復(fù)合物（dead-endcomplex）第三十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日竟?fàn)幮砸种谱饔玫睦永虹晁崦摎涿甘鼙嶂种啤１崾嵌人峄衔锱c琥珀酸結(jié)構(gòu)相似但兩個(gè)羧基間無(wú)法形成雙鍵無(wú)法完成后續(xù)反應(yīng)。第三十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日競(jìng)

爭(zhēng)

性

抑

制

圖

解第三十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日I:競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)推導(dǎo)根據(jù)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō):d[E]/dt=(k2+k-1)[ES]+k-3[EI]-(k1[S]+k3[I])[E]=0d[ES]/dt=k1[E][S]-(k2+k-1)[ES]=0由(1）得（4）由(2）得(3）將（3）代入（4）可得:（5）（1）（2）第三十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日又因?yàn)?v=k2[ES],Vm=k2[E0]將所有的項(xiàng)數(shù)換成[ES]項(xiàng)，代入相關(guān)式子可得:v/Vm=[ES]/[E0]=[ES]/([E]+[ES]+[EI]）(6-33）其中，Km=（k2+k-1）/k-1,Ki=k-3/k3(6-34)此即為競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程式，形式與米氏方程相同.故：第三十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日分析:（1）Ki是EI復(fù)合物的解離常數(shù)，Ki愈小，表示抑制強(qiáng)度越大，也稱抑制常數(shù)。

(2)Km（表觀)=Km(1+[I]/Ki)比米氏方程Km大，意味著酶與底物親和力減低。(3)Vm不變

第三十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日初速度方程忽略ES，EI，得：引入抑制劑濃度函數(shù)，則可得：做不同a的米氏方程，當(dāng)[S]趨于∞，V0趨于Vmax[S]vVmaxa=1無(wú)抑制a=2a=4[I]第四十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日總結(jié):抑制方程推導(dǎo)通用思路①總酶[E0]=[E]+[ES]+[EIS]+·····

即酶存在的不同形式之總和!②通過(guò)Ki、Ks等將酶的不同形式與[ES]掛勾！即[E]=x1[ES][EIS]=x2[ES]···最后得：[E0]=xn[ES]③根據(jù)酶催化速度通式條件：v0=k2[ES]Vm=k2[E0]

得：v0/Vm=[ES]/[E0]=xn

得：v=xn[Vm]④最后將結(jié)果化成與米氏方程相類似的結(jié)構(gòu)?。?！第四十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日II:曲線特征-雙倒數(shù)作圖法(一次作圖)將速度方程變雙倒數(shù)形式；1/v0~1/[S0]作圖，得一直線；斜率：aKm/Vmax縱截矩：1/Vmax橫截矩：-1/aKm由此得Vmax和Km1/v01/[S]1/vmax斜率=aKm/VmaxO-1/aKma=1無(wú)抑制a=2a=4第四十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)反應(yīng)的影響如圖6-6(a）、(b）第四十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km變大，酶促最大反應(yīng)速度不變。無(wú)抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑1/Vmax1/v1/s競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的動(dòng)力學(xué)特征第四十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日說(shuō)明：抑制劑與底物在酶上結(jié)合位點(diǎn)不同時(shí)也可產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，此情況為：底物或抑制劑與酶結(jié)合均會(huì)改變酶構(gòu)象使之不能形成三元復(fù)合物。見(jiàn)圖4-7所示。第四十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日III:抑制常數(shù)Ki確定1，根據(jù)表觀米氏常數(shù)計(jì)算。Km’[I]Km-Ki斜率=Km/Ki2，表觀米氏常數(shù)Km’對(duì)[I0]作圖法。第四十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日①先做不同I下雙倒數(shù)直線；得到不同I下一次作圖的斜率yi:②做y~I0，仍是直線；從該直線中可看出:斜率：Km/vmaxKi縱截矩：Km/vmax橫截矩：-Ki1/v01/[S]1/vmax斜率=aKm/VmaxO-1/aKma=1無(wú)抑制a=2a=4一次作圖(雙倒數(shù)作圖)3,二次作圖法斜率=Km/vmaxKi一次作圖斜率[I]Km/vmax-Ki二次作圖第四十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在下，雙倒數(shù)轉(zhuǎn)變形式：固定S，1/v0~[I0]作圖得一直線分析：[I0]=-Ki時(shí)，1/v0=1/Vmax,與[S0]無(wú)關(guān)。固定酶濃度，改變底物作幾條直線相交于一點(diǎn)（-Ki,1/Vmax)(即方程通過(guò)定點(diǎn)(-Ki,1/Vmax)!)[S1][S2]-Ki1/vmax[I]1/v0Dixon作圖確定競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑常數(shù)4-334，Dixon作圖法[Si]第四十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日Dixon作圖其它意義還可鑒定該抑制劑對(duì)酶的抑制類型。由式4-33知Dixon圖斜率:y=Km/VmaxKi[S0]做y~1/[So]直線過(guò)原點(diǎn)（二次圖）；因此一個(gè)抑制劑若作Dixon圖其斜率再作二次圖得到的直線過(guò)原點(diǎn)則說(shuō)明此抑制劑為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑?？膳c非競(jìng)爭(zhēng)性區(qū)分但不能與混合型抑制區(qū)分。y1/[S]第四十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日IV：非線性競(jìng)爭(zhēng)性抑制一、二次做圖均為直線，故稱線性競(jìng)爭(zhēng)性抑制；若抑制劑與酶活性中心結(jié)合數(shù)不止一個(gè)，則二次作圖不為線性；最簡(jiǎn)單情況，結(jié)合兩個(gè)時(shí)，二次作圖為拋物線，故稱拋物線競(jìng)爭(zhēng)性抑制；(back）Ki=k3/k-3=[E][I]/[EI];Ki’=[EI][I]/[Ei2]EI2k4k-4+I類似，抑制劑結(jié)位不同于底物結(jié)合位，但仍引起酶與底物親和力下降，是雙曲線競(jìng)爭(zhēng)性抑制。第五十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日（二）、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(noncompetitiveinhibition)酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競(jìng)爭(zhēng)與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。酶分子可以和抑制劑I結(jié)合，生成EI，也可和底物S結(jié)合，生成ES,可生成無(wú)活性的ETS.如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。第五十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日非競(jìng)爭(zhēng)性抑制圖解第五十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日反應(yīng)式僅討論抑制劑與酶催化部位或構(gòu)象變化影響到催化部位而導(dǎo)致酶活性之喪失情形而不影響到底物與酶之結(jié)合;線性非競(jìng)爭(zhēng)模型是最簡(jiǎn)單的情況,此時(shí)E+IEI及ES+IESI具相同解離常數(shù)Ki;第五十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)，可得:（4-37)可見(jiàn)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制影響到了最大反應(yīng)速度，使Vm下降，而Km不變。抑制劑的存在使總酶濃度下降故使Vmax下降;而抑制劑不影響底物與酶的結(jié)合能力,故Km不變。第五十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日[E][S]=Ks[ES][E]=Ks[ES]/[S][E][I]=Ki[EI][EI]=[E][I]/Ki=Ks[ES][I]/Ki[S][ES][I]=Ki[EIS][EIS]=[I][ES]/Ki又代入各項(xiàng)約去[ES]：I推導(dǎo):第五十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日附：形式化為:公式類似于順序機(jī)制(雙底物反應(yīng))第五十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日II：線性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制雙倒數(shù)方程曲線特征以1/v0~1/[S0]作圖；斜率：a’Km/vmax;縱截矩：a’/vmax;橫截矩：-1/Km;可得vmax,Km;不同抑制劑濃度作圖交于橫軸-1/Km處；這是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制特征。-1/Km斜率=a’Km/vmaxa’/vmax1/vo1/[S0]a’=1無(wú)抑制a’=2a’=4a’=1+[I]/Ki[I]第五十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響，如圖6-7(a)、(b)第五十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km不變，而Vmax減小。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制無(wú)抑制劑非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑-1/km1/v1/s第五十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日III：抑制常數(shù)Ki雙倒數(shù)一次作圖斜率y；(1)以1/v’max~[I0]作圖；為線性，橫軸截矩為-Ki①二次作圖法一次作圖截矩1/v’max[I]1/vmax斜率=1/vmaxKi-Ki二次作圖-1/Km斜率=a’Km/vmaxa’/vmax1/vo1/[S0]a’=1無(wú)抑制a’=2a’=4a’=1+[I]/Ki[I]一次作圖第六十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日(2)或以y=a’Km/vmax~[I0]也為線性，橫軸截矩為-Ki一次作圖斜率[I]Km/vmax斜率=Km/vmaxKi-Ki二次作圖-1/Km斜率=a’Km/vmaxa’/vmax1/vo1/[S0]a’=1無(wú)抑制a’=2a’=4a’=1+[I]/Ki[I]一次作圖第六十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日②Dixon作圖法確定Ki同樣，雙倒數(shù)方程化為：以1/v0~[I0]作圖；固定[E0]，[S0]；橫軸截矩-Ki；線性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制是一般非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特例；單底物酶促反應(yīng)中此實(shí)例較少，更多是不可逆抑制。[S1][S2]-Ki1/v0[I]back第六十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日(三）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用uncompetitiveinhibition抑制劑不能和游離酶結(jié)合，只和酶底物復(fù)合物ES結(jié)合成無(wú)活性的三元復(fù)合物ESI，也是說(shuō)S和E的結(jié)合不僅不排斥I,反而促進(jìn)了I和E的結(jié)合，在多元反應(yīng)體系中常見(jiàn)。此原因在于底物結(jié)合暴露了抑制劑結(jié)合部位或抑制劑與酶結(jié)合底物直接結(jié)合。第六十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日I：推導(dǎo)方程式:（Ks=Km）(6-36)可見(jiàn)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可使得Vm和Km都發(fā)生變化，相應(yīng)降低同一個(gè)倍數(shù)！第六十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日II：雙倒數(shù)方程及曲線特征令a’=1+[I0]/Ki；反競(jìng)爭(zhēng)性抑制雙倒方程：1/v0~1/[S0]作圖；直線，斜率Km/vmax;不同抑制劑濃度下斜率一樣故呈一簇平行線！此為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制特征！a’/vmax1/v01/[S]a’=1無(wú)抑制a’=1.5a’=2斜率Km/vmax[I]-K’m=-a’/Km第六十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日反競(jìng)爭(zhēng)性抑制對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響如圖6-8(a)(b)第六十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日反競(jìng)爭(zhēng)性抑制無(wú)抑制劑反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑1/1/[S]-1/km(1+[I]/ki)加入反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，使Km和Vmax均減小I增加第六十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日可逆抑制的動(dòng)力學(xué)比較抑制類型VmaxKm無(wú)抑制劑VmaxKm競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用不變變大非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用變小不變

反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用變小變小第六十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日III：抑制常數(shù)Ki也用二次作圖法（注：不是斜率y!)①在雙倒數(shù)圖中讀取1/v’max

，1/K’m

；②根據(jù)關(guān)系式：作1/v’max~[I0];作1/K’m~[I0];1/v’max1/vmax-Ki斜率=1/vmaxKi[I]1/K’max1/Kmax-Ki斜率=1/KmKi[I]back第六十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日（四）線性混合型抑制基本上與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑相似，但KsKs’KiKi’反應(yīng)式可表示如下:第七十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日(4-44）（Km=Ks）I:根據(jù)快速平衡學(xué)說(shuō)，可推導(dǎo)如下動(dòng)力學(xué)方程式:第七十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日II:雙倒數(shù)方程定義a=1+[I0]/Ki,a’=1+[I0]/K’i;則4-44為：雙倒方程為：1/v0~1/[S0]得直線；不同抑制劑濃度交于一點(diǎn)Ki<K’i,a’>a則交于第二象限，競(jìng)爭(zhēng)-非競(jìng)爭(zhēng)；Ki>K’i,a’<a則交于第三象限，非競(jìng)爭(zhēng)-反競(jìng)爭(zhēng)；-a’/aKm斜率=aKm/vmaxa=a’=1無(wú)抑制a’/vmaxa=1.5a’=1.25a=2.0a’=1.5[I]1/v01/[S]第七十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日混合型抑制劑對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響如圖6-9(a)(b)第七十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日III:抑制常數(shù)Ki,K’i①雙倒數(shù)一次作圖讀取數(shù)據(jù)；縱截矩1/v’max;

斜率aKm/vmax;②根據(jù)式子作圖：

1/v’max~[I0];

斜率y~[I0];由圖可見(jiàn),均為線性，橫軸截矩為-Ki’,-Ki-K’i1/v’