XXXX膠體金快速免疫診斷技術(shù)

ColloidalGoldLateral-FlowDiagnosticTechnology

膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)------閔微，研發(fā)部快速檢測(cè)快速檢測(cè)是一種廉價(jià)的、一次性的、基于膜的檢測(cè)方法，它能提供分析物存在于液體樣品的視覺證據(jù)。這種檢測(cè)可以以獨(dú)立的試紙條，也可以以裝在塑料盒中的形式進(jìn)行?？偟膩碚f，做此項(xiàng)檢測(cè)至少需要200ul的液體標(biāo)本，可在2至5分鐘內(nèi)完成。在臨床檢測(cè)中，樣品可能有尿、血液、血清、唾液或其他體液。在非臨床檢測(cè)中，樣本可能是由土壤、粉塵、植物或者食品制備的微量溶液，它們同樣可以直接應(yīng)用膜試紙條檢測(cè)。這種檢測(cè)方法無需儀器操作，可應(yīng)用于臨床、實(shí)驗(yàn)室、室外或者家庭——通常為無操作經(jīng)驗(yàn)人員使用。2快速膜檢測(cè)需求廣泛，可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域（見下表）。隨著靈敏度和特異性的提升，大量的潛在應(yīng)用可能是作為替代昂貴儀器檢測(cè)方法的低成本選擇。34為何使用金標(biāo)記早期的快速檢測(cè)使用有色膠乳形成可視信號(hào)，目前的某些檢測(cè)仍使用此手段。過去和現(xiàn)在，乳膠法一直是凝集反應(yīng)主要的標(biāo)記方法，這是因?yàn)樗诮Y(jié)合成分的存在下易于凝集。對(duì)于快速檢測(cè)而言，交聯(lián)物的穩(wěn)定性是避免假陽性的關(guān)鍵，而易于凝集可能就是其產(chǎn)生假陽性的主要問題。因?yàn)榫哂懈玫臐撛诜€(wěn)定性，20世紀(jì)80年代末，金標(biāo)記被引入膜快速檢測(cè)中。在適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)條件下，任何被精確大小的金顆粒都可以被重現(xiàn)性制造出來。不同的大小可用于不同的用途。其優(yōu)良的穩(wěn)定性、敏感性、精確性及可重復(fù)生產(chǎn)性等特點(diǎn)使得金適合于在快速檢測(cè)中的應(yīng)用。金本性屬惰性元素，被適當(dāng)加工可形成完整的球形顆粒。當(dāng)正確連接時(shí)，蛋白質(zhì)能牢固地結(jié)合在金顆粒表面，無論是液態(tài)或固態(tài)都能保持長久的穩(wěn)定性。而且，若是在制造過程中蛋白被精確固定，其與金交聯(lián)物的非特異性結(jié)合可被減至零。56膠體金技術(shù)起源及現(xiàn)狀起源1971年,Faulk和Taytor引入

7原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。8現(xiàn)狀層析法(Lateral-Flow)滲濾法(Through)免疫金銀染色法膠體金的作用:

指示劑910與常規(guī)診斷方法相比優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)快速：全部檢測(cè)過程僅需3-10分鐘。簡便：不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單，無需專業(yè)人員，攜帶方便，可隨時(shí)隨地進(jìn)行。廉價(jià)：單個(gè)測(cè)試條成本極低

可單份檢測(cè)：對(duì)標(biāo)本既能成批檢測(cè)，又可單份檢測(cè)，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。

穩(wěn)定性好：金標(biāo)試劑穩(wěn)定，可長期保存。

檢測(cè)標(biāo)本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種檢查定量問題靈敏度問題11技術(shù)應(yīng)應(yīng)用類別應(yīng)用領(lǐng)域檢測(cè)的物質(zhì)人類醫(yī)學(xué)各級(jí)醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染病（乙肝五項(xiàng),HIV,SARS等）標(biāo)志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站,商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染?。ㄇ萘鞲?獸瘟疫等）病毒（煙草花葉病毒、犬細(xì)小病毒等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測(cè)部門,研究機(jī)構(gòu)有害物質(zhì)超標(biāo)食品安全食品安全檢測(cè)中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素12膠體金金層析析法一個(gè)快快速檢檢測(cè)的的底層層一般般是硝硝酸纖纖維素素膜，，在它它上面面固定定了了檢測(cè)測(cè)蛋白白，通通常是是抗體體或抗抗原。。連連接著著膜的的是包包含有有干燥燥金標(biāo)標(biāo)的金金標(biāo)墊墊（通通常是是玻璃璃纖纖維））。對(duì)對(duì)于目目前大大多數(shù)數(shù)可做做的檢檢測(cè)項(xiàng)項(xiàng)目，，這種種結(jié)合合墊含含有吸吸附了了針對(duì)對(duì)待檢檢分析析品品的特特異性性抗體體或抗抗原的的金金粒子子。樣樣品墊墊通常常為紙紙質(zhì)質(zhì)，附附著著著結(jié)合合墊。。當(dāng)使使用樣樣品品墊時(shí)時(shí)，液液體樣樣品通通過毛毛細(xì)細(xì)擴(kuò)擴(kuò)散作作用穿穿移過過結(jié)合合墊墊，再再水化化金交交聯(lián)物物，使使待分分析析樣品品與交交聯(lián)物物相互互作用用。。然后后金交交聯(lián)物物與待待分析析樣樣品復(fù)復(fù)合物物轉(zhuǎn)移移至膜膜條帶帶上再再移向向蛋白白結(jié)合合物，，復(fù)合合物在在此處處被固固定后后以一一條細(xì)細(xì)細(xì)細(xì)的紅紅線的的形式式產(chǎn)生生明顯顯的信信號(hào)。。第二二條線線是控控制線線，由由余下下的金金交聯(lián)聯(lián)物形形成于于膜膜上，，表明明測(cè)試試完成成。13試紙條條組成成結(jié)構(gòu)構(gòu)測(cè)試線線（（T線）控制線線（C線）膠體金金墊吸水濾濾紙樣品墊墊NC膜（硝硝酸纖纖維素素膜））層析方方向PVC底板14層析法法技術(shù)術(shù)優(yōu)勢(shì)勢(shì):簡單\現(xiàn)場(chǎng)\快速1.打開包包裝取取出試試紙條條2.直接插入待待測(cè)樣品中中3.目測(cè)讀出結(jié)結(jié)果（3-10分鐘內(nèi)）15免疫層析法法檢測(cè)原理理分類介紹紹

（雙抗抗體夾心））（以HCG檢測(cè)為例））16免疫層析法法檢測(cè)原理理分類介紹紹

（競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)反應(yīng)）（以嗎啡檢檢測(cè)為例））17免疫層析法法檢測(cè)原理理分類介紹紹

（應(yīng)用用proteinA金標(biāo)）（以HIV檢測(cè)為例））膠體金滲濾濾法將蛋白質(zhì)抗抗原直接點(diǎn)點(diǎn)樣在硝酸酸纖維膜上上，在硝酸酸纖維膜下下墊有吸水水性強(qiáng)的墊墊料，即為為滲濾裝置置。在加抗抗原（抗體體）后，迅迅速加抗體體（抗原）），再加金金標(biāo)記第二二抗體，由由于有滲濾濾裝置，反反應(yīng)很快，，在數(shù)分鐘鐘內(nèi)即可顯顯出顏色反反應(yīng)。此方方法已成功功地應(yīng)用于于人的免疫疫缺陷病病病毒（HIV）的的檢查和人人血清中甲甲胎蛋白的的檢測(cè)。18膠體金銀染染色法膠體金銀染染色法（Dot－IGS／IGSS））是將斑點(diǎn)點(diǎn)ELISA與免疫疫膠體金結(jié)結(jié)合起來的的一種方法法。將蛋白白質(zhì)抗原直直接點(diǎn)樣在在硝酸纖維維膜上，與與特異性抗抗體反應(yīng)后后，再滴加加膠體金標(biāo)標(biāo)記的第二二抗體，結(jié)結(jié)果在抗原原抗體反應(yīng)應(yīng)處發(fā)生金金顆粒聚集集，形成肉肉眼可見的的紅色斑點(diǎn)點(diǎn)，此稱為為斑點(diǎn)免疫疫金染色法法（Dot－IGS）。此反反應(yīng)可通過過銀顯影液液增強(qiáng)，即即斑點(diǎn)金銀銀染色法（（Dot－－IGS／／IGSS）。1920膠體金免疫疫層析系統(tǒng)統(tǒng)技術(shù)路線21技術(shù)路線膠體金制備備技術(shù)標(biāo)記技術(shù)NC膜與溶液噴噴點(diǎn)膠體金墊與與溶液噴點(diǎn)點(diǎn)樣品墊吸水紙粘性底板干燥方法溶液體系分分析裝配\切條\包裝膠體金的制制備22制備原理所有的生產(chǎn)產(chǎn)方法都都是使用還還原劑提供供電子給溶溶液中帶帶正電荷的的金離子而而產(chǎn)生金金原子，如如下所示：：氯金酸＋還還原劑＝膠膠體金HAuCl4+e–=Au0通常使用的的還原劑包包括檸檬檬酸鈉、黃黃磷、硼氫氫化鈉、硫硫氰酸鈉鈉。2324根據(jù)不同的的制備方法法，可以制制備出直徑徑1－500nm的膠膠體金粒子子，但做為為免疫標(biāo)記記探針，其其直徑應(yīng)在在3-30nm范圍圍內(nèi)。在氯化金（（HAuCl4）水溶液中中加入還原原劑使之還還原并聚積積形成膠體體金粒子。。使用不同同種類、不不同劑量的的還原劑，，可以控制制所產(chǎn)生的的粒子大小小。即粒子子大小取決決于反應(yīng)溶溶液中最初初還原試劑劑和還原核核的數(shù)量。。還原劑濃濃度越高，，核濃度也也越高，氯氯化金的還還原也就從從更多的還還原中心開開始，因此此產(chǎn)生的膠膠體金粒子子數(shù)量越多多，但體積積也越小。。粒子直徑徑每增加一一倍，數(shù)量量減少為原原來的1/8。25以檸檬酸鈉鈉和單寧酸酸做還原劑劑，能夠制制備大小相相對(duì)一致、、直徑3～16nm的膠體體金。因此此一般膠體體金探針均均使用該方方法進(jìn)行。。但該方法法制備的膠膠體金粒子子直徑范圍圍較窄，而而且殘留的的多聚單寧寧酸殘基往往往干擾某某些蛋白與與金粒子的的結(jié)合。此此時(shí)在溶液液中添加0.1～0.2％的的H2O2能夠去除這這些殘基。。雙標(biāo)記或或制備5-10nm的膠膠體金時(shí)建建議使用該該方法。利用檸檬酸酸為還原劑劑，可以制制備12～～150nm直徑徑的膠體金金。但制備備大體積的的膠體金時(shí)時(shí)，膠體金金粒子的誤誤差也同時(shí)時(shí)增加。因因此做單標(biāo)記時(shí)，，建議使用用該方法制制備12-16nm直直徑的膠體體金。除了上述方方法外，也也可以用磷磷作為還原原劑來制備備5nm的的膠體金，，它避免了了單寧酸殘殘基的問題題，但所形形成的金粒粒子體積變變化較大。。磷易燃且且有毒，制制備的殘液液需進(jìn)一步步處理，故故該方法已已經(jīng)很少使使用。26白磷還原法法制備5nm膠膠體金取250ml三角瓶瓶一個(gè)，加加79ml雙蒸水水，1ml1%氯化金，，并用0.25MK2CO3將溶液調(diào)至至中性（pH7.0）。取0.2ml飽和和磷/乙醚醚溶液加到到1.5ml試管管中，再加加0.8ml乙醚醚，混勻。。取0.7ml加加入溶液（（1）中(磷有毒且且易燃，操操作請(qǐng)帶手手套，多余余的磷溶液液用CuSO4進(jìn)行中和)。室溫下輕輕輕搖勻15min，然后加加熱沸騰并并保持5min，，自然冷卻卻。27單寧酸/檸檬酸鈉鈉法制備3～16nm膠體體金取一250ml三角瓶瓶，加入79ml雙蒸水和和1ml1％氯氯化金，預(yù)預(yù)熱至60～70℃。取一50ml燒杯，加加入4ml1％％檸檬酸鈉鈉，然后根根據(jù)所制備備金粒子體體積大小加加入不同用用量的單寧寧酸及等量量的25mMK2CO3。預(yù)熱至60～70℃。K2CO3的作用是保保持溶液的的中性pH。因此此如果單寧寧酸的量少少于0.5ml時(shí)時(shí)，對(duì)pH的影響不不大，K2CO3可以省略。。將上兩種溶溶液迅速混混合并充分分混勻，加加熱至沸并并保溫10分鐘。。自然冷卻卻。28檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）45000342000445006412084701041016檸檬酸三鈉鈉法制備12-30nm膠膠體金(Frens,1973)取250ml三角瓶瓶一個(gè)，加加100ml雙蒸蒸水及1ml1%氯化金金，加熱沸沸騰；取不同量的的1%檸檬檬酸鈉加入入上述溶液液中?；靹騽?，再保持持沸騰30min，溶液顏顏色首先變變黑，再逐逐漸變紅，，粒子體積積較小時(shí)，，溶液呈桔桔紅色，而而粒子體積積較大時(shí)，，則顏色偏偏向紫色。。29檸檬酸鈉(ml)膠體金(nm)5 124 163 242.830制備高質(zhì)量量膠體金的的注意事項(xiàng)項(xiàng)（1）玻璃器器皿必須徹徹底清洗，，最好是經(jīng)經(jīng)過硅化處處理（1％％雙氯硅烷烷/氯仿浸浸泡1小時(shí)時(shí)，烘干））的玻璃器器皿，或用用第一次配配制的膠體體金穩(wěn)定的的玻璃器皿皿，再用雙雙餾水沖洗洗后使用。。否則影響響生物大分分子與金顆顆粒結(jié)合和和活化后金金顆粒的穩(wěn)穩(wěn)定性，不不能獲得預(yù)預(yù)期大小的的金顆粒。。（2）試劑劑配制必須須保持嚴(yán)格格的純凈，，所有試劑劑都必須使使用雙餾水水或三餾水水并去離子子后配制，，或者在臨臨用前將配配好的試劑劑經(jīng)超濾或或微孔濾膜膜（0.45μm））過濾，以以除去其中中的聚合物物和其它可可能混入的的雜質(zhì)。（3）配制制膠體金溶溶液的pH以中性（（pH7.2）較好好。（4）氯金金酸的質(zhì)量量要求上乘乘，雜質(zhì)少少。最好是是進(jìn)口的。。（5）氯金金酸配成1％水溶液液在4℃可可保持?jǐn)?shù)月月穩(wěn)定，由由于氯金酸酸易潮解，，因此在配配制時(shí)，最最好將整個(gè)個(gè)小包裝一一次性溶解解，暫時(shí)不用用的可以用用1.5ml試管分分裝為1ml保存存（-20℃）。30由于使用試試劑質(zhì)量及及其它方面面可能存在在的誤差，，以及制備備過程中的的其它問題題，膠體金金粒子的大大小及一致致性與理論論值可能有有偏差，因因此，在制制備完成后后必須進(jìn)行行鏡檢。如如出現(xiàn)粒子子體積偏差差太大，粒粒子凝聚，，粒子邊緣緣不清晰等等問題，須須重新制備備。膠體金溶液液最好保存存在4℃冰箱中；；也可保存存在室溫下下，一般可可保存1-2個(gè)月月。但決不不可保存在在0℃以下，否否則金粒子子發(fā)生凝聚聚。31蛋白-金復(fù)合體體的制備32必須了解蛋蛋白與膠體體金持久結(jié)結(jié)合的物理理及化學(xué)進(jìn)進(jìn)程，僅僅僅把交聯(lián)物物揉合到一一起，雖雖然成本低低廉且簡易易，卻通常常會(huì)導(dǎo)致聚聚集體的形形成。一種好的交交聯(lián)物表現(xiàn)現(xiàn)為蛋白吸吸附于金的的表面上，，與膠乳不不同的是，，蛋白是被被動(dòng)地吸吸附于交聯(lián)聯(lián)物表面，，因而不會(huì)會(huì)出現(xiàn)共價(jià)價(jià)結(jié)合。33一般認(rèn)為膠膠體金粒子子表面為一一層AuCl2，因此，粒粒子表面帶帶有負(fù)電荷荷，這種負(fù)負(fù)電荷粒子子之間相互互排斥，形形成穩(wěn)定懸懸浮的膠體體金溶液。。金顆粒表面面可以包被被一層生物物大分子（（如蛋白））來穩(wěn)定和和保護(hù)這些些粒子，以以免受外來來電解質(zhì)的的影響而相相互凝聚在在一起。膠膠體金粒子子對(duì)蛋白的的吸附作用用取決于pH值，這這是因蛋白白的凈電荷荷取決于溶溶液的pH值，在pH=pI時(shí)為中性性。由于在在pH=pI時(shí)蛋白白溶解度最最小，因此此這時(shí)它水水化程度最最小，最溶溶液吸附到到疏水的金金粒子表面面。但在實(shí)實(shí)際的膠體體金探針制制備中，一般膠體金金調(diào)整為pH=PI+0.5，這樣蛋白白帶正電，，有利于結(jié)結(jié)合更穩(wěn)定定。在接近蛋白白質(zhì)的等電電點(diǎn)或偏堿堿的條件下下，二者容容易形成牢牢固的結(jié)合合物。如果果膠體金的的pH值低低于蛋白質(zhì)質(zhì)的等電點(diǎn)點(diǎn)時(shí)，則會(huì)會(huì)聚集而失失去結(jié)合能能力。除此此以外膠體體金顆粒的的大小、離離子強(qiáng)度、、蛋白質(zhì)的的分子量等等都影響膠膠體金與蛋蛋白質(zhì)的結(jié)結(jié)合。34蛋白通過以以下機(jī)制于于幾秒之內(nèi)內(nèi)吸附于于金表面金粒子所帶帶負(fù)電荷與與蛋白內(nèi)內(nèi)氨基酸（（如賴氨酸酸）所帶帶陽性電荷荷的最初的的相互吸吸引蛋白通過某某些氨基酸酸殘基包包括色氨酸酸與金粒子子表面之之間的疏水水吸附作用用蛋白中的半半胱氨酸的的硫基與金金粒子間的的配價(jià)結(jié)合合35金顆粒大小小的選擇檢測(cè)信號(hào)是是由金顆粒粒聚集于測(cè)測(cè)試線或控控制線而出出現(xiàn)的信號(hào)號(hào)。這些粒粒子必須足足夠大到到能被看見見，粒子的的尺寸越大大，這些些粒子聚集集后就越容容易被看見見。隨著粒子尺尺寸的增大大，位阻現(xiàn)現(xiàn)象又成成了一個(gè)問問題。此外，這些些粒子的尺尺寸越大，，它們?cè)诩燃榷w積溶溶液中存在在的數(shù)量越越小。這種可見度度的需要與與位阻現(xiàn)象象之間的矛矛盾現(xiàn)象表表明，對(duì)于于大多數(shù)的的免疫檢測(cè)測(cè)應(yīng)用而而言，最適適的粒子大大小是40nm。在某些情情況下當(dāng)位位阻現(xiàn)象成成為較大問問題時(shí)（（如針對(duì)較較小的抗原原），20nm的粒子則更更為合適；；當(dāng)希望出出現(xiàn)更深顏顏色或當(dāng)分分子表面較較低的曲率率提高了抗抗原抗體分分子間的交交互作用，，較大一點(diǎn)點(diǎn)的粒子則則更為可取取。應(yīng)該由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)決定確定定多少顆粒粒大小能帶帶來高靈敏敏度、淺背背景色和高高穩(wěn)定性。。3637蛋白必須要要經(jīng)過前處處理（1）去除高高濃度的鹽鹽分，高濃濃度的鹽分分往往干擾擾蛋白與膠膠體金的吸吸附結(jié)合，，或?qū)е履z膠體金粒子子的凝聚，，這一步往往往采用低低濃度緩沖沖液中進(jìn)行行。（2）使蛋蛋白分子盡盡量分散為為單體，凍凍干蛋白或或高濃度蛋蛋白溶液中中蛋白分子子往往凝聚聚為多聚體體大分子，，可同時(shí)與與多個(gè)膠體體金粒子結(jié)結(jié)合，影響響標(biāo)記的靈靈敏度和定定量分析。。（3）使蛋蛋白具有適適當(dāng)?shù)姆肿幼恿?。蛋白白分子量過過?。?0kD）），形成的的金-蛋白復(fù)合合體往往是是不穩(wěn)定，，可短時(shí)間間內(nèi)失活。。而分子量量過大時(shí)，，被認(rèn)為影影響金-蛋白復(fù)合合體的靈敏敏度，特別別是已知蛋蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)與活性中中心的情況況下，去除除對(duì)活性武武影響的結(jié)結(jié)構(gòu)部分是是提高標(biāo)記記靈敏度，，延長金-蛋白復(fù)合合體壽命（（防止凝集集）的有效效辦法。把把分子量過過小的蛋白白與其它蛋蛋白（如BSA，牛牛血清蛋白白等）結(jié)合合后，能制制備出穩(wěn)定定性更佳的的金-蛋白復(fù)合合體。3839抗體Antibody來源差異:鼠抗,兔抗和羊抗抗種類差異:單抗,多抗腹水的處理理:飽和硫酸銨銨沉淀法特異性:親和層析柱柱濃度:濃縮溶解液:不含鹽,例如PB抗原抗體生生物原料抗原Antigen偶聯(lián)抗原物物質(zhì):BSA,OVA等毒品檢測(cè)來來源:合成抗原待標(biāo)記蛋蛋白溶液液的制備備將待標(biāo)記記蛋白預(yù)預(yù)先對(duì)0.005Mol/LpH7.0NaCl溶溶液中4℃透析過過夜，以以除去多多余的鹽鹽離子，，然后100000g4℃離心1h，去去除聚合合物。40確定膠體體金與蛋蛋白結(jié)合合的最佳佳pH值對(duì)于理化化性質(zhì)不不確定的的蛋白這這一步尤尤為重要要。過量量的蛋白白與不同同pH值值得膠體體金結(jié)合合后，只只有某一一特定pH值能能夠形成成結(jié)合最最穩(wěn)定的的金-蛋白復(fù)復(fù)合體。。在高濃濃度電解解質(zhì)（如如NaCl）作作用下不不會(huì)凝聚聚。不同同蛋白的的適宜pH范圍圍的寬窄窄大不相相同。一一般選擇擇最小適適宜pH值為最最佳pH值。但但有些金-蛋白復(fù)復(fù)合體的的實(shí)際情情況并不不完全如如此，最最穩(wěn)定金-蛋白復(fù)復(fù)合體并并不完全全代表活活性最好好。這要要靠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)驗(yàn)證。。這里需要要特別指指出的是是，使用用不同直直徑的膠膠體金與與同一蛋蛋白結(jié)合合時(shí)，除除了蛋白白量完全全不同外外，往往往最佳pH也有有一定變變化。41由于膠體體金溶液液可能損損壞pH計(jì)的的電板，，因此，，在調(diào)節(jié)節(jié)pH時(shí)時(shí)，采用用精密pH試紙紙測(cè)定為為宜。由于鹽類類成分能能影響金金溶膠對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)的吸附附，并可可使溶膠膠聚沉，，故致敏敏前應(yīng)先先對(duì)低離離子強(qiáng)度度的水透透析。必必須注意意，蛋白白質(zhì)溶液液應(yīng)絕對(duì)對(duì)澄清無無細(xì)小微微粒，否否則應(yīng)先先用微孔孔濾膜或或超速離離心除去去。一般情況況下應(yīng)避避免磷酸酸根離子子和硼酸酸根離子子的存在在，因?yàn)闉樗鼈兌级伎晌礁接陬w粒粒表面而而減弱膠膠體金對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)的吸附附。42蛋白質(zhì)最最適用量量的選擇擇加入蛋白白質(zhì)的量量不足以以穩(wěn)定膠膠體金的的各管，，均呈現(xiàn)現(xiàn)出由紅紅變藍(lán)的的聚沉現(xiàn)現(xiàn)象；而而加入蛋蛋白量達(dá)達(dá)到或超超過最低低穩(wěn)定量量的各管管仍保持持紅色不不變。以以穩(wěn)定1ml膠膠體金溶溶液紅色色不變的的最低蛋蛋白質(zhì)用用量，即即為該標(biāo)標(biāo)記蛋白白質(zhì)的最最低用量量，在實(shí)實(shí)際工作作中，可可適當(dāng)增增加10％～20％。。能夠形成成穩(wěn)定金-蛋白復(fù)復(fù)合體的的蛋白的的最小量量。如果果在制備備金-蛋白復(fù)復(fù)合體時(shí)時(shí)加入太太多的蛋蛋白，不不僅造成成浪費(fèi)，，而且更更為嚴(yán)重重的是容容易造成成金-蛋白復(fù)復(fù)合體凝凝聚，并并嚴(yán)重影影響標(biāo)記記活性。。因?yàn)榻?蛋白復(fù)復(fù)合體溶溶液中的的游離蛋蛋白容易易搶先與與標(biāo)記位位點(diǎn)結(jié)合合，起到到“封閉閉”（Blocking）作作用，而而標(biāo)記蛋白白標(biāo)記不不上。在在標(biāo)記位位點(diǎn)希少少、被標(biāo)標(biāo)記物含含量較少少的情況況下要特特別注意意。43膠體金標(biāo)標(biāo)記蛋白白的純化化超速離心心法：根根據(jù)膠體體金顆粒粒的大小小，標(biāo)記記蛋白的的種類及及穩(wěn)定劑劑的不同同選用不不同的離離心速度度和離心心時(shí)間。。凝膠過濾濾法：此此法只適適用于以以BSA作穩(wěn)定定劑的膠膠體金蛋蛋白結(jié)合合物的純純化。將將膠體金金蛋白結(jié)結(jié)合物裝裝入透析析袋，在在硅膠中中脫水濃濃縮至原原體積的的1/5～1/10。。再經(jīng)1500r/min離心20min。取取上清加加至SephacrylS-400（丙丙烯葡聚聚糖凝膠膠S-400））層析柱柱分別純純化。4445NC膜與溶液液噴點(diǎn)---NC膜NC膜的性能能NC膜的選擇擇爬速(135秒/4cm)對(duì)靈敏度度的影響響底襯的作作用不同膜廠廠家的產(chǎn)產(chǎn)品差異異(Whatman/S&S,Millipore,Sartorius)46NC膜與溶液液噴點(diǎn)---噴點(diǎn)溶液液Dispensing(噴點(diǎn)演示示:BIODOTXYZ系列噴點(diǎn)點(diǎn)儀器)C\T線溶液前前處理:1.過濾,0.2um孔徑濾膜膜2.離心1萬轉(zhuǎn)10分鐘噴點(diǎn)過程程頭尾去除除,噴點(diǎn)中的的報(bào)廢標(biāo)標(biāo)志C\T線噴點(diǎn)工工藝(BJQ3000噴頭)與接觸劃劃點(diǎn)(FL1000XY噴頭)工藝比較較4748膠體金墊墊與溶液液噴點(diǎn)膠體金墊墊1.材料選擇擇2.糖的作用用3.緩沖溶液液的作用用噴點(diǎn)法與與浸泡法法的比較較(AJQ3000噴頭)49樣品墊材料選擇擇各成分的的作用1.緩沖溶液液的作用用(PH)2.鹽的作用用3.大分子蛋蛋白BSA\PVP4.表面活性性劑Tween-20,TritonX-10050吸水紙吸水效率率紙的差異異51粘性底板板原理作用用供應(yīng)商的的選擇52干燥方法法Dry干燥方法法的比較較1.冷凍干燥燥法2.烘箱3.烘房溫濕度的的控制1.溫度對(duì)蛋蛋白的影影響2.濕度的控控制辦法法53溶液體系系分析各環(huán)節(jié)緩緩沖溶液液的選擇擇與統(tǒng)一一鹽的作用用表面活性性劑的作作用糖的作用用大分子蛋蛋白的作作用其他作用用物質(zhì)54裝配\切條\包裝裝配切條(演示:BIODOTCM4000切條機(jī))刀的維護(hù)護(hù)與清潔潔底板選擇擇(膠的影響響)包裝55發(fā)展方向向56標(biāo)記技術(shù)術(shù)的探索索順磁粒子子標(biāo)記、、量子點(diǎn)點(diǎn)標(biāo)記免疫反應(yīng)應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為電電子信號(hào)號(hào)模式57新的層析析模式58生物傳感感器59Thanks!9、靜夜四無鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。1月-231月-23Wednesday,January4,202310、雨中黃葉樹樹，燈下白頭頭人。。23:54:5323:54:5323:541/4/202311:54:53PM11、以以我我獨(dú)獨(dú)沈沈久久，，愧愧君君相相見見頻頻。。。。1月月-2323:54:5323:54Jan-2304-Jan-2312、故人江海別別，幾度隔山山川。。23:54:5323:54:5323:54Wednesday,January4,202313、乍見見翻疑疑夢(mèng)，，相悲悲各問問年。。。1月-231月-2323:54:5323:54:53January4,202314、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。04一月月202311:54:53下下午23:54:531月-2315、比不了了得就不不比，得得不到的的就不要要。。。。一月2311:54下下午1月-2323:54January4,202316、行動(dòng)出成果果，工作出財(cái)財(cái)富。。2023/1/423:54:5323:54:5304January202317、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時(shí)，你只只能或者最好好沿著以腳為為起點(diǎn)的射線線向前。。11:54:53下午午11:54下下午23:54:531月-239、沒沒有有失失敗敗，，只只有有暫暫時(shí)時(shí)停停止止成成功功??！。。1月月-231月月-23Wednesday,January4,202310、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有結(jié)結(jié)果果，，但但是是不不努努力力卻卻什什么么改改變變也也沒沒有有。。。。23:54:5323:54:5323:541/4/202311:54:53PM11、成功功就是是日復(fù)復(fù)一日日那一一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小小努力力的積積累。。。1月-2323:54:5323:54Jan-2304-Jan-2312、