XXXXB第講基因工程第講概論

第二章

基因工程（Geneengineering）

1概論2要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌握基因工程的基本過程

3、熟悉工具酶和載體類型及應用

4、熟悉原核、真核細胞轉染、表

達的基本方法和類型。

5、熟悉基因工程產生的基礎和過程

(科研思維與方法）。6.設計一個基因克隆的程序。3參考書楚雍烈，現(xiàn)代生物技術（西安交通大學講義）Genecloning,T.A.Brown.基因工程原理，吳乃虎編著，科學出版社基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學出版社分子克隆實驗指南，J.Sambtook,EFFrish,TManiatis,金冬雁，黎孟楓等譯，科學出版社。4

生物技術的核心內容

基因工程（Geneengineering）DNA重組（recombinantDNAtechnology）基因操作（genemanipulation）基因克?。╣enecloning）分子克?。╩olecularcloning）DNA克?。―NAcloning）基因修飾（genemodification）

5基因工程的概念基因工程的意義基因工程的發(fā)展史理論上的六大發(fā)現(xiàn)技術上的六大進展發(fā)展過程中的重大事件基本步驟:兩個水平，六個階段內容提要6一、基因工程的概念

定義：

人們按照預定設計，在體外對不同來源DNA分子進行人工切割、連接、插入載體DNA分子，使遺傳物質重新組合、改造，經轉移、導入到原先不含有重組體的受體細胞，使之持續(xù)穩(wěn)定繁殖、目的基因擴增、表達，獲得人類所需的產品的工程。7WithRestrictionenzymesWithRestrictionenzymeswithDNAligaseenzyme(Genetictransformation)8基因工程的基本內涵

基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。體外重建、基因轉移和外源表達是重組DNA技術的三大環(huán)節(jié)。9基因工程的基本特征基因工程有兩個重要的特征：

一是可把來自任何生物的基因重組和轉移到與其毫無關系的任何其他受體細胞中，因此可以實現(xiàn)按照人們的愿望，改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀；

二是某一段DNA可在受體細胞內進行基因復制和表達，為準備大量純化的DNA片段提供了可能，拓寬了分子生物學的研究領域。10基因工程的的目的（1）獲得得目的基因因，DNA的提取、、純化和DNA分子子的克隆，，建立文庫。（2）制備備活性多肽肽產品：激激素、細胞胞因子子、多多肽藥物疫疫苗等，診斷和防治治疾疾病。（3）研究究基因結構、、功能等11二、基因工工程的重大大意義（1）重組組DNA技技術填平了了生物種屬屬間不不可逾越的的鴻溝?？缭教烊晃镂锓N屏障，，將原核和和真核生物物、植物和和動物，造造福人類，，在過去人人們難以置置信的事情情，現(xiàn)在已已成為現(xiàn)實實。12（2）重組組DNA技技術縮短了了進化時間間。遺傳和變異異是一對矛矛盾，遺傳傳賦予生物物種的穩(wěn)定定，變異賦賦予生物種種的進化。。在漫漫歷歷史長河中中，自然變變異的進化化時間是千千萬年，常常規(guī)育種亦亦要幾年；；而重組DNA技術術將進化時時間大大縮縮短至幾年年?；虿俨僮饔糜谟N，將縮縮短進化時時間，在解解決全世界界人民溫飽飽問題上將將發(fā)揮重要要作用。13（3）重組組DNA技技術使人類類能對生物物進進行行定向改造造重組DNA技術標志志著人類控控制和改造造生物的歷歷史已進入入一個新紀紀元。以重重組DNA技術培育育出抗真菌菌蔬菜為例例，幾丁質質是真菌細細胞的組分分之一，幾幾丁質酶能能水解幾丁丁質，美國國科學家將將幾丁質酶酶基因導入入西紅柿、、土豆、萵萵苣和甜菜菜中，正準準備大田試試驗，這一一技術將對對蔬菜抗真真菌感染具具有重要意意義。14（4）利用用重組DNA技術可可以在體外外大量擴增增、純化人人們感興趣趣的基因，，研究其結結構、功能能及調控機機制，從而而拓

寬了了分子生物物學的研究究領域。15（5）醫(yī)學學上應用更更為廣泛，，涉及各領領域正常人類生生命活動的的分子機制制；人人類各各種疾病發(fā)發(fā)生的分子子機理；人人類各種疾疾病如遺傳傳性疾病、、腫瘤、肥肥胖胖、心血管管疾病、傳傳染病等病病因的的查明、、診斷、治治療和預防防。藥藥物的研研發(fā)和生產產；疾疾病模型型的建立；；人人類的營養(yǎng)養(yǎng)、健康、、長壽和保保?。▉喗】担?617本課程的地地位：現(xiàn)代科技革革命高新技術生物技術基因工程基因克隆18基因工程不不是發(fā)現(xiàn)，，而是創(chuàng)造造。19改變傳統(tǒng)農農業(yè)概念讓植物生產產人體蛋白白質生產促性腺絨毛激素的矮牽牛20發(fā)光的水稻21只有想想不到到的沒有辦辦不到到的基因重組22第一節(jié)基因工程的的發(fā)生與發(fā)展展23一、基因工工程誕生的的理論基礎礎20世紀中中期分子遺遺傳學理論論的重大進進展六大發(fā)現(xiàn)：1．確定了了生物遺傳的物質質基礎是DNA肺炎鏈球菌菌光滑型和和粗糙型的的轉化試驗驗噬菌體DNA轉化實實驗24●1944年年，美國微微生物學家家Avery證明基基因就是DNA分子子，提出DNA是是遺傳信息息的載體。。252．DNA分子子雙螺旋結構構模型和半保留復制制DNA堿基基配對規(guī)律律和X衍射射研究DNA雙螺螺旋結構模模型。26273．生物遺遺傳的“中心法則則”解決了遺傳傳信息的流流向和遺傳傳性狀的相相互關系，，揭示了生生命遺傳信信息傳遞基基本規(guī)律。。自我復制，，遺傳信息息由親代傳傳給子代；；通過轉錄，，遺傳信息息傳給RNA；通過翻譯，，信息傳給給蛋白質和和酶；基因型決定定生物的表表型。DNARNAprotein28ReplicationReplicationTranscriptionReverseTranscriptionTranslation中心法則（thecentraldogma）29304．“操縱子””學說揭示了了基因表達達和和調控的概概念?；蚪M結構構基基因分分布基基因因表達基基因調控的的原理酶酶誘導的的本質315．破譯了了全部生物物遺傳密碼，確定了它在在生物界的的通用性性，人人類更加具具體地了解解遺遺傳信息表表達規(guī)律。。32遺傳密碼表表目錄33mRNA分分子上從5至3的方向,每3個核苷酸酸構建一個個密碼子，，編碼某一一特定氨基基酸或作為為蛋白質合合成的起始始、終止信信號，稱為為三聯(lián)體密碼(tripletcodon)，，也稱遺傳密密碼子(geneticcodon)。解決了信息語語言的對應關關系。34終止密碼：翻譯終止的密密碼，不代表表任何氨基酸酸。有3個：：UAA、UAG、UGA?代表氨基酸的的密碼：64?3=61起始密碼：AUG在mRNA起起始部位時為為起始密碼。。否，為Met密碼。密碼:43=64351)通用性性遺傳密碼具有有的特點從原核生物到到人類都使用用同一套遺傳傳密碼。已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例例外，如動物物細胞的線粒粒體、植物細細胞的葉綠體體。2)方向性性mRNA分子子上由起始密密碼AUG開開始，從5→3方向閱讀密碼碼子，直至終終止密碼。決定蛋白質分分子從N端→→C端的排列列順序。363)連續(xù)續(xù)性三聯(lián)體密碼連連續(xù)性表現(xiàn)為為中間無標點點，連續(xù)閱讀讀。mRNA開放放閱讀框架內內發(fā)生一個或或兩個堿基插插入或缺失，，可引起移碼突變(frameshiftmutation)。。374)簡并性性目錄即有多個密碼碼子特異地破破譯同一個氨氨基酸．遺傳密碼中，，除色氨酸和和甲硫氨酸僅僅對應一個密密碼子外，其其余氨基酸均均有一個以上上密碼子為其其編碼。385)擺動動性tRNA上反反密碼子的第1位堿基與mRNA密碼子的的第3位堿基配對時，，可以在一定定范圍內變動動，即并不嚴格遵循循堿基配對規(guī)律，這一現(xiàn)現(xiàn)象稱為擺動性。396、生物進化，基基因突變、獲得的性狀可可以遺傳到后代。40分子遺傳學理理論上的六大大進展解決了了生命現(xiàn)象的遺遺傳物質基礎礎（均是核酸酸）結構模型（同同類構件、雙雙螺旋）復制方式（相相似的機制））遺傳信息流動動方向（共同同的中心法則則）遺傳密碼（共共用一套相同同的密碼）表達和調控的的機理（類同同的方法）基因突變機理理、意義（變變異與進化））為基因工程技技術的誕生典典定了理論基基礎。理論上的可行行性。41二、分子遺傳傳學新方法是是基因工程的的技術基礎（六大技術）首當其沖的是是要解決：①如何自如如地得到目的的基因；②如何在體體外改造基因因，得到重組組體；③如何在體體外轉移重組組基因；直到20世紀紀70年代中中期，相繼出出現(xiàn)了幾項關鍵性技技術，夢想成成真。421．工具酶的的發(fā)現(xiàn)：DNA分子的的切割和連接接技術1970年Smith發(fā)發(fā)現(xiàn)了第一個個Ⅱ型限制性性核酸內切酶酶(restrictionendonuclease，，RE)HinfⅠ對DNA分子有特異地切切割作用。（手術刀剪））同年Khorana又發(fā)發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶酶（Ligase），能將DNA片片段連接在一一起。（縫紉機、漿漿糊）DNA、RNA聚合酶和和反轉錄酶等等合成酶。（復印機）構成了一個研研究DNA、、RNA分分子的工具酶箱。432、DNA片片段載體系統(tǒng)的構建目的基因、DNA片段不不能復制，也也易破壞。必必須連到具有有復制能力的的DNA分子子上。載體（vector)是能攜帶外源源DNA、能能自我復制的的小DNA分分子。最早發(fā)現(xiàn)的是是：質粒、噬噬菌體和病毒毒。443、大腸桿菌菌受體細胞系統(tǒng)統(tǒng)建立體外獲得的含含目的基因或或DNA片段段的重組體，，雖具有自我我復制的本能能，但沒有原原料、酶系統(tǒng)統(tǒng)和生命活力力。必須將其其安全轉移到到宿主細胞才才能進行增殖殖，賦予其““生命”。454、大腸桿菌菌DNA轉化體系建立1970年發(fā)發(fā)現(xiàn)氯化鈣處處理過的細胞胞易于吸收接接納外源DNA；1972年CohenC報道，質質粒DNA也也能被大腸桿桿菌吸收。而后發(fā)現(xiàn)經過過改造的質粒粒、噬菌體和和病毒都可以以攜帶目的DNA片段和和基因，經過過轉化大腸桿桿菌，建立該該基因的無性性繁殖系。465、DNA分析、鑒定技術酶切分析技術術（核酸分辨儀）核酸分子雜交交技術（核酸酸探測儀）序列分析（密密碼復讀機）生物信息學（（密碼破譯機）476、DNA分離、純化及及鑒定技術凝膠電泳：Agarose,PAGEgel離心技術層析技術印跡技術:Southernblot………..48技術上的可行性六大技術方法法的建立實際上的可操作性材料、實驗條條件、時空條條件、經經濟濟條件和政策策?；A方面的基基本條件（可能性+可行行性+可可操作性）具備，尚需需人的科學創(chuàng)新思維+艱艱苦的的實踐。才能得到創(chuàng)新新的發(fā)明、發(fā)發(fā)現(xiàn)和和成果。491970年，，MIT的的科學家率率先提出在體體外把不同來來源的遺傳物物質進行重組組的設想，但但遭到反對，，不予支持。。沒能進行試試驗。1972年，，Boyer等在發(fā)現(xiàn)現(xiàn)限制性核酸酸內切酶EcoRI的的基礎上，，開始了實驗驗。501972年Berg等人人使用EcoRI在體外外對猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別別酶消化，再再用T4DNA連接酶酶將兩種片段段連接起來，，得到SV40和λλDNA的的重組雜種DNA分子，率先完成了世世界上第一次次成功的DNA體外不同物種之間間的DNA重組組實驗（片段段重組）?；蚬こ痰拇蟠竽憞L試51基因工程的誕誕生1980年Nobel化化學獎1972年斯坦福大學學的PaulBerg小組完成了了首次體外重重組實驗。Berg的開創(chuàng)性實驗驗521973年Cohen成功地地進行了另一一個體外DNA重組實驗驗。分別把編碼卡卡那霉素和四四環(huán)素抗性基基因的兩種質質粒酶切、連連接，再將這這種重組的DNA分子轉轉化大腸桿菌菌，某些轉化化菌落具有既既抗卡那霉素素又抗四環(huán)素素的雙重抗體體特性。他的工作是世世界上第一次次成功的基因克隆實驗，并有基基因表達及新新的表型。標志著基因工工程的誕生。。53pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基基因DNA連接酶酶重組DNA分分子54培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌55后來又把非洲洲爪蟾核糖體體基因片段同同pSC101質粒重組組，轉化大腸腸桿菌，并在在菌體內成功功轉錄出相應應的mRNA。這是第一一次成功的基基因表達實驗驗。561974年，，首次實現(xiàn)異源源間基因重組組。把把小鼠鼠的生長激素素抑素基因在在大腸桿菌中中表達。571976年，，世界上第一個個基因公司在在美國成立，，“Genetech””注冊登記，，意味著基因因工程的實際際應用已跨入入商業(yè)運作的的門檻。生生物工程從此此進入產業(yè)化化。581978年，人類的第一個個基因被克隆隆。人生長激激素抑素基因因被重組到大大腸桿菌的質質粒DNA中中。1978-1979胰島素基因在在大腸桿菌中中表達。591982年1、把大白鼠鼠的生長激素素基因克隆、、轉移到小鼠鼠的受精卵內內，第一個個轉基因超級級鼠誕生。2、人胰島素素基因的cDNA被克克隆、成功表表達和開始成成為商品上市市?；虍a品有效效益、開始新新興產業(yè)。60三、基因工程程的基本步驟驟——兩個水水平，六個階階段61基因工程包括括分子和細胞胞兩個水平操操作分子水平操作作指的是基因因重組、克隆隆和表達的設設計與重組體體構建（即重重組DNA技技術）；細胞水平操作作則指轉化、、篩選和培養(yǎng)養(yǎng)工程菌或細細胞以及表達達產物的分離離純化過程。。621．分子水平平操作階段：：獲得含目的基基因的重組體體分子（亦稱稱重組子）。。本階段的操作作有三個主要要環(huán)節(jié)：（1）分離：提取、分分離含目的基基因的DNA分子和載體體DNA分子子，在分離提提取過程中，，注意質、量量，減少損傷傷。（（2）切割：選擇合適適的RE工具具酶，分別對對外源目的DNA分子和和載體DNA分子進行酶酶解切割。（（3））連接：用DNA連接酶，將將目的基因與與載體在體外外連接為一個個重組DNA分子，并進進行鑒定。63分離：目的基因的獲獲取需要克隆的DNA片段：：化學合成法cDNA文庫庫基因組DNA文庫聚合酶鏈式反反應64載體DNA的的選擇功能：為目的基因提提供進入受體體細胞的轉移能力。為目的基因提提供在受體細細胞中復制或整合能力。為目的基因提提供在受體細細胞中的表達能力。65限制性內切酶酶切切割：內切酶連接酶連接：DNA連接酶酶662.細胞水平平操作階段：：把含目的基因因的重組體導導入受體細菌菌或受體細胞胞，賦予其其“生命”讓讓其表達，獲獲得產品。本階段的操作作也有三個主主要環(huán)節(jié)。（1）轉移：利用DNA轉移技術術，把構建的的重組體導入入到受體菌或或受體細胞中中，獲得工程程菌或工程細細胞。

（2）篩選：利用核酸酸雜交，酶切切分析、PCR和表型特特征等技術，，篩選出已克克隆化的工程程菌/細胞。。（3）表達：大量培養(yǎng)養(yǎng)含重組體的的工程菌/細細胞，誘導其其表達，并對對表達產物進進行鑒定，提提取和純化。。67重組體的轉化化受體細胞轉移：含氨芐平板重組質粒感受態(tài)重組體68含氨芐平板連接目的基因基因載體連接酶轉化重組體克隆的的篩選與鑒定定篩選：宿主細胞69外源基因在宿宿主細胞中的的表達重組子目的基因的mRNA表達蛋白質大腸桿菌（E.coli）工程細胞表達：目的基因表達達產物的檢測測70重組DNA操操作一般步驟驟：（1）分離：提取和獲得得目的基因和載體DNA；（2）切割：分別對目的的基因和載體體DNA酶切；（3）連接：目的基因與與載體連接，，形成新的重組組DNA分分子；（