MALDI-TOF-MS在女性生殖道惡性腫瘤診斷中的運用-中國腫瘤生物

MALDI-TOF-MS在女性生殖道惡性腫瘤診斷中的運用TheapplicationofMALDI-TOF-MSinthediagnosisofmalignanttumorofthefemalegenitaltract滕志淳綜述，傅芬審閱(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西南昌330006)［摘要］：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)作為一種新的質(zhì)譜技術(shù)成功檢測出許多與疾病相關(guān)的新型生物標記物。本文著重介紹了近年來運用MALDI-TOF-MS對宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌三大女性生殖道惡性腫瘤的早期篩查診斷的研究進展，并對于MALDI-TOF-MS不足之處進行了指正及展望。［關(guān)鍵詞］:MALDI-TOF-MS；女性生殖道惡性腫瘤；子宮內(nèi)膜癌；卵巢癌；宮頸癌［中圖分類號］:R737,3［文獻標志碼］:A ［文章編號］:由于經(jīng)濟發(fā)展與全民衛(wèi)生教育的不同步、環(huán)境惡化等因素的影響，女性生殖道惡性腫瘤，特別是排名前三位的宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌的發(fā)病率明顯提高。因此，尋找一種新型高敏感、高特異性且創(chuàng)傷小的檢測方法，在腫瘤早期篩查中進行推廣，從而實現(xiàn)疾病的早診斷、早治療，具有重大現(xiàn)實意義?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)是近些年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為熱門的質(zhì)譜技術(shù)川，目前已經(jīng)成功運用于篩選出與疾病相關(guān)的新型生物標記物，為臨床疾病的早期診斷和治療提供了良好的依據(jù)以及更為廣闊的空間。.MALDI-TOF-MS技術(shù)概況當個體發(fā)生疾病的時候，其自身組織、細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)成分也將隨之發(fā)生相應(yīng)改變。MALDI-TOF-MS技術(shù)主要就是通過快速分析細胞以及組織中的蛋白質(zhì)荷比的變化來了解細胞所產(chǎn)生的生物學(xué)變化⑵。將組織或細胞與等量的基質(zhì)混合構(gòu)成共晶體，經(jīng)激光照射，共晶體中的基質(zhì)將樣品解吸附并電離，生成帶有電荷的蛋白質(zhì)分子被引入飛行時間質(zhì)量分析器進行質(zhì)譜分析。由于離子的質(zhì)荷比與離子的飛行時間成正比，所以根據(jù)各個離子的檢測到的飛行時間可以出測定其分子質(zhì)量，并通過專用軟件分析，制定出特異的指紋圖譜3］。與傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)相比，MALDI-TOF-MS適用于混合物及生物大分子的軟電離，具有許多獨特的優(yōu)點：一、靈敏度高；二、準確度高，女Maurer等⑷將經(jīng)MALDI-TOF-MS分析獲得的頭頸部鱗癌的差異蛋白質(zhì)譜圖再次用于單盲測試，發(fā)現(xiàn)其準確率高達96.5%；三、制備樣品的要求低，過程簡單，樣品中允許有一定量的雜質(zhì)，如在預(yù)處理過程中加入的緩沖劑等濃度控制在一定范圍，可不必在分析前除去；四、檢測范圍廣，可測定相對分子質(zhì)量500~100000大小的多肽及蛋白；五、可以用于組織切片的直接分析，切片大小要求低，即使是將直徑只有幾毫米的組織切片放置在MALDI的靶板上，向組織樣品添加基質(zhì)后無需任何分離步驟，該組織的分子及空間分布信息即可快速通過質(zhì)譜分析獲得；六、檢測樣本多樣，可以是血清、血漿、尿液、腦脊液、乳頭抽吸液等臨床上可直接獲得的標本；七、兼容性好，可以與雙向電泳、液相色譜技術(shù)以及磁珠技術(shù)結(jié)合用于蛋白種類分析［5-6］；八、速度快，高通量檢測技術(shù)［7-8］。綜合以上的優(yōu)點，MALDI-TOF-MS技術(shù)更加適合用于臨床檢驗中的大量標本的檢測。.MALDI-TOF-MS技術(shù)與腫瘤檢測腫瘤的發(fā)生是多基因多步驟調(diào)控的結(jié)果。目前很多腫瘤缺乏早期準確的、特異性的診斷方法，大多數(shù)患者都是在出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀后，再通過影像學(xué)、血液分析、病理學(xué)檢查來診斷，延誤了最佳的治療時間，極大的降低了患者的存活率。研究發(fā)現(xiàn)，即使是無臨床癥狀的早期癌癥患者，其血液、尿液或者其他組織中的蛋白質(zhì)的種類或數(shù)量已悄然改變9］。通過早期篩查體液或組織的蛋白差異，及早發(fā)現(xiàn)隱性的腫瘤患者，將為腫瘤診治發(fā)揮重要作用。MALDI-TOF-MS技術(shù)諸多優(yōu)勢的展現(xiàn)，近年來國內(nèi)外有很多將其運用在一些癌癥研究上的成功案例，如乳腺癌口0］、食管鱗狀細胞癌［口］、胃癌［⑵、肺癌口引、肝癌口引、膀胱癌［⑸、前列腺癌［16］等。它可以快速檢測出癌癥患者體內(nèi)特異的蛋白表達，與臨床上直到患者出現(xiàn)相應(yīng)病理學(xué)改變才能運用影像學(xué)檢測出來相比，大大提前了診斷時間，提高了患者的生存期，節(jié)省了治療費用，被認為是一種潛在的早期診斷工具，并可以運用于預(yù)測制定患者特異性的療法、預(yù)見患者的治療效果以及是否有復(fù)發(fā)可能等方面。.MALDI-TOF-MS技術(shù)與女性生殖道惡性腫瘤檢測MALDI-TOF-MS在宮頸癌診斷中的運用宮頸癌作為最常見的女性生殖道惡性腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomaviruses，HPV)的持續(xù)感染有緊密聯(lián)系［⑺。但是，單獨檢測HPV缺乏診斷特異性，目前宮頸癌的診斷、治療效果及預(yù)后復(fù)發(fā)的評估主要依賴于腫瘤的臨床病理參數(shù)。隨著蛋白質(zhì)組診斷模式的發(fā)展，運用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測宮頸癌患者的特異多肽標志物，為新型早期診斷方法提供更多的選擇空間。Zhu等［18］采用二維凝膠電泳對10對宮頸癌患者的癌灶及癌旁正常組織蛋白進行分離，將差異表達的55個蛋白質(zhì)點通過MALDI-TOF-MS進行檢測，發(fā)現(xiàn)包含TYK2,S100A9和鋅指蛋白217在內(nèi)的24個蛋白質(zhì)在癌癥組織中高表達。另外，Song等［19］采用相同方法對宮頸癌與單純性子宮肌瘤患者的宮頸組織進行比較，發(fā)現(xiàn)20個在癌癥組異常表達上調(diào)的蛋白質(zhì)，經(jīng)RT-PCR、Westernblot、免疫組化學(xué)綜合檢測后，鎖定B-FABP、NCK-1、CDK4可能作為新的宮頸癌病理腫瘤標志物。以上研究結(jié)果表明，通過MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)癌癥患者活體組織中的異常蛋白具有實驗可行性。至于兩者實驗結(jié)果的差異，可能來源于實驗步驟中的差異或者試劑使用的不同，也可能出于MALDI-TOF-MS技術(shù)重現(xiàn)性還需改善的原因。值得指出的是，活體組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究雖然較為成熟，但臨床上取材較為艱難，檢測前處理較為繁復(fù)，不適于臨床早期的疾病篩查和診斷，血清蛋白質(zhì)組的研究漸漸開展開來。Liu等［20］通過PBSII-C蛋白芯片技術(shù)預(yù)處理了85例宮頸癌組及80例健康女性的血清標本，運用BiomarkerWizard系統(tǒng)分析獲得的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)兩組血清蛋白存在明顯差異，經(jīng)過篩選確定了3個相對分子質(zhì)量分別為3974、4175、5906的差異多肽和蛋白。運用這些多肽和蛋白將癌癥患者與健康人群分組的靈敏度達93.3%，特異性達95%。其中相對分子質(zhì)量5906的蛋白質(zhì)與Liu早期研究發(fā)現(xiàn)的差異蛋白（相對分子質(zhì)量5904.14）相近，這很可能是同一個蛋白質(zhì)，分子量差異可能與樣本預(yù)處理方式及分析統(tǒng)計軟件的不同有關(guān)，這也意味著一個新型潛在生物標記物的發(fā)現(xiàn)。此外，MALDI-TOF-MS還可以用于分析如四乙基銨（TEA）等特定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)等，幫助理解其誘導(dǎo)細胞毒性的機制，并提供潛在的癌癥生物標志物，這已經(jīng)在人宮頸癌細胞Hela中得到證實［21］。雖然MALDI-TOF-MS技術(shù)具有高效性，但是目前大量的研究都是建立在已知癌癥患者，且大多數(shù)是晚期癌癥患者的取樣或者已知腫瘤細胞的研究上，癌癥病人的數(shù)量及臨床分期的限制導(dǎo)致建立出的診斷模型缺乏廣泛性，因此暫無研究報道在對照組或者隨機取樣中檢測到隱性癌癥病人。繼續(xù)擴增樣本數(shù)量，研究早期宮頸癌的質(zhì)譜圖，將更有利于我們實現(xiàn)腫瘤早期診斷的目標。MALDI-TOF-MS在子宮內(nèi)膜癌診斷的運用分段診刮術(shù)是目前診斷子宮內(nèi)膜癌最常用、最有價值的檢查方法。但因診刮術(shù)屬于有創(chuàng)操作，并不屬于每年體檢常規(guī)項目，甚至很多已經(jīng)出現(xiàn)臨床癥狀的患者因懼怕其有創(chuàng)操作的風(fēng)險而拒絕或者不配合診刮，導(dǎo)致篩查工作的難以有效展開。MALDI-TOF-MS可以檢測固態(tài)、液態(tài)等多種形態(tài)的樣本，為尋求無創(chuàng)早期診斷的內(nèi)膜癌研究者提供了新的研究方法。Yang等［22］對21例惡性子宮內(nèi)膜及23例良性子宮內(nèi)膜組織蛋白進行分級分離，通過MALDI-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)兩組間存在差異性，其中CPN10在惡性子宮內(nèi)膜組織中高度表達，并用Westernblot及免疫組化等方法進一步證實。之后，Qiu等四］人利用MALDI-TOF-MS及ClinProTools軟件對比分析了子宮內(nèi)膜癌組（30例）及對照組（30例）的血清蛋白，確定在坐標pk14，1012.6及pk115,6052.9內(nèi)的2種蛋白質(zhì)有明顯差異表達，通過差異明顯的多肽和蛋白m/z2902.49、m/z5068.89、m/z6052.9和m/z7010.58建立的子宮內(nèi)膜癌診斷模型靈敏性達97.62%、特異性達100%，這證明了MALDI-TOF-MS在臨床診斷方面的優(yōu)勢可行性。其次，MALDI-TOF-MS的早期篩查可行性在分析子宮內(nèi)膜病變機制的實驗中獲得了肯定［24］。另外，Zhang等［25］通過MALDI-TOF-MS對比經(jīng)孕激素治療和未治療的子宮內(nèi)膜腺癌細胞株的蛋白差異，為孕激素分子機制的進一步調(diào)查提供了一定的實驗基礎(chǔ)，為子宮內(nèi)膜癌治療研究奠定了基礎(chǔ)，也為臨床選藥、評估病人療效以及藥物治療靶向提供實驗基礎(chǔ)。3.3MALDI-TOF-MS在卵巢癌診斷中的運用作為女性生殖器官惡性腫瘤中死亡率最高的卵巢癌，由于發(fā)病部位隱匿，早期癥狀非特異性，依靠目前雙合診檢查、CA-125及陰道超聲相結(jié)合的診斷方式，早期診斷的陽性率只有30%-45%［26］。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是臨床晚期，極大地減低了5年生存率。現(xiàn)在已有多項實驗將MALDI-TOF-MS運用于卵巢癌的早期診斷、治療以及預(yù)后判斷的研究中。Qiu等［27］人利用MB-WCX預(yù)處理20例卵巢癌患者及20例健康對照人群血清樣本后，質(zhì)譜分析并采集血清多肽指紋圖譜，采用ClinProTools軟件分析獲得了5個作為兩組分類的差異多肽和蛋白，質(zhì)荷比分別為m/z4648.21、m/z3886.1、m/z9066.38、m/z9294.03和m/z4254.71，其中前四個質(zhì)峰在癌癥組表達升高，后者在癌癥組表達降低。挑選其中質(zhì)荷比為m/z4648.21及m/z9294.03的多肽和蛋白質(zhì)建立卵巢癌血清診斷模型可以很好地將卵巢癌患者與健康對照者區(qū)分開來。Wu等［281人采用同法預(yù)處理40例卵巢癌患者及60例健康對照組的血清樣本，但在運用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測時，將質(zhì)量范圍擴大為1000~50000Da，并刪除小于2000Da的質(zhì)峰以排除誤差，獲得27個差異蛋白，選用其中表達上調(diào)明顯的m/z5486、m/z6440和m/z13720建立卵巢癌血清診斷模型辨別兩組患者，敏感性和特異性分別為90%、86.7%。以上兩人的實驗樣品預(yù)處理方法大致相同，但由于Wu實驗中相關(guān)參數(shù)的修改及優(yōu)化等處理，所獲得的差異蛋白也不盡相同。在未來擴大樣本例數(shù)、規(guī)范化的研究中，應(yīng)該注意保持實驗儀器參數(shù)設(shè)定的一致性，方便深入探討所獲得的差異蛋白與卵巢癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，其高表達是腫瘤細胞本身侵襲增殖的顯示，亦或者是本體細胞免疫反應(yīng)的表達，增加或減少這兩個蛋白質(zhì)在細胞中的表達，對臨床治療有無靶向作用提供依據(jù)。目前卵巢癌的化療主要是采用順伯及其類似化合物作為藥物，耐藥反應(yīng)往往是卵巢癌患者治療失敗的主要原因［29］。雖然一些基因，如GST-pi［30］、XIAPM、BCL-XL132^E與耐藥性卵巢癌顯示出一些相關(guān)性，但具體機制尚未達到普遍的共識。建立腫瘤抗化療耐藥相關(guān)分子的檢測將在腫瘤的治療方案的選擇中發(fā)揮重要作用。Zh0U等網(wǎng)基于先前的研究及順伯耐藥機制的研究，通過二維凝膠電泳、MALDI-TOF-MS和高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)MS聯(lián)合分析人類卵巢癌順伯耐藥細胞株(COC1/DDP),確定5個與順伯耐藥相關(guān)、顯著改變COC1/DDP親代細胞的差異蛋白點：角蛋白9,角蛋白1,dUTPase,ADCK4和絲切蛋白。且Zhou通過定量PCR和Westernblotting等方法進一步驗證了以上蛋白質(zhì)的異常表達。Li等［34］通過MALDI-TOF-MS對人類上皮性卵巢癌耐藥細胞株的22個蛋白質(zhì)點進行分析，其中16個蛋白質(zhì)表達了強度不同的特異性，并且確定了絲切蛋白1在紫杉醇抗性中發(fā)揮重要作用。以上兩組實驗對于絲切蛋白的耐藥影響有共同的結(jié)果，為卵巢癌耐藥機制的研究奠定了基礎(chǔ)，也為臨床選藥、評估病人療效以及藥物治療靶向提供實驗基礎(chǔ)。另外，食療作為新型的輔助治療的手段越來越被人們所推崇。AjayP等閡通過MALDI-TOF-MS檢測越蔓莓成分，發(fā)現(xiàn)原花青素的含量明顯高于其他水果，有利于增強卵巢癌患者對于伯類耐藥細胞敏感性。這些研究都為卵巢癌耐藥機制、靶向治療等方面的研究擴展新的思路。卵巢癌的高復(fù)發(fā)率也是導(dǎo)致其死亡率居高不下的重要原因。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，經(jīng)初級腫瘤細胞減滅術(shù)和化療等治療后，仍有高達70%的患者存在復(fù)發(fā)可能。Wang等的運用MB-WCX預(yù)處理了49例原發(fā)上皮性卵巢癌、21例經(jīng)6個月綜合治療后復(fù)發(fā)的卵巢癌、40例良性婦科腫瘤患者及40例健康體檢女性的血清樣本，運用MALDI-TOF-MS分析獲得相應(yīng)指紋圖譜，以良性組及健康組作為對比標準篩查惡性腫瘤特異蛋白。在原發(fā)組中發(fā)現(xiàn)8個差異蛋白質(zhì)峰高表達，根據(jù)其建立原發(fā)性卵巢癌診斷模型用于盲測的精確度為87.50%；而復(fù)發(fā)組中發(fā)現(xiàn)了10個差異蛋白高表達，2個差異蛋白低表達，其盲測時準確性達88.90%以上。以上研究證明，運用MALDI-TOF-MS及早發(fā)現(xiàn)含有高復(fù)發(fā)率表達蛋白的患者，從而進行對癥適量的治療，在當前臨床工作中具有必需性及可行性。。.問題與展望雖然MALDI-TOF-MS顯示了很多強大的功能，但也面臨著一系列的挑戰(zhàn)，最突出的問題就是如何進一步提高MALDI檢測的靈敏度以及滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究高通量的需要。此外，疾病和健康對照在研究中樣本數(shù)量有限，疾病組大多數(shù)為中晚期癌癥患者，血清預(yù)處理的方法是大多通過使用磁珠和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析，而不是分離出血清混合物樣品的真實構(gòu)成［37］。在無癥狀的早期癌癥患者的血液中蛋白質(zhì)或多肽的差異變化也許無法最大程度地發(fā)現(xiàn)異常［38］,特異性不高，因此取同一個體的多種體液進行篩選從而確定最適合早期診斷和治療靶點的媒介日益顯現(xiàn)其重要性［39］。且研究［40］發(fā)現(xiàn)，癌癥患者在手術(shù)前的體液組成含量與手術(shù)后相比有明顯差別，故選擇手術(shù)前后體液進行對比檢驗，有助于觀察術(shù)后恢復(fù)，或提早準備進一步治療方案。另外不同學(xué)者實驗結(jié)果中所得到的差異蛋白質(zhì)荷比往往有所不同，這可能主要是由于樣本選取標準、預(yù)處理方法、分析軟件、人為因素等不同所造成的［41］。因此有必要在未來的研究中加大規(guī)模、集中規(guī)范的進行審查以及制定規(guī)范化的標準國]。最后，MALDI-TOF-MS還需進一步改造為更低成本、更高效率的檢測儀器，作為可以用于臨床常規(guī)檢驗加以推廣。[參考文獻]PuschW,KostrzewaM.ApplicationofMALDI-TOFMassSpectrometryinScreeningandDiagnosticResearch[J].CurrPharmDes,2005,11(20):2577-2591.VestalML.ModernMALDItime-of-flightmassspectrometry[J].JMassSpectrom,2009,44(3):303-17.VoortmanJ,PhamTV,KnolJC,etal.Predictionofoutcomeofnon-smallcelllungcancerpatientstreatedwithchemotherapyandbortezomibbytime-courseMALDI-TOF-MSserumpeptideprofiling[J].ProteomeSci,2009,7:34.MaurerK,EschrichK,SchellenbergerW,etal.OralbrushbiopsyanalysisbyMALDI-ToFMassSpectrometryforearlycancerdiagnosis[J].OralOncol,2013,49(2):152-6.MejiasJH,LuX,OsorioC,etal.AnalysisofWheatProlamins,theCausativeAgentsofCeliacSprue,UsingReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatography(RP-HPLC)andMatrix-AssistedLaserDesorptionIonizationTimeofFlightMassSpectrometry(MALDI-TOF-MS)[J].Nutrients,2014,6(4):1578-97.RanaA,MinzRW,AggarwalR,etal.AcomparativeproteomicstudyofserainpaediatricsystemiclupuserythematosuspatientsandinhealthycontrolsusingMALDI-OF-TOFandLCMS-Apilotstudy[J].PediatrRheumatolOnlineJ,2012,10(1):24.BryanRT,WeiW,ShimwellNJ,etal.Assessmentofhigh-throughputhigh-resolutionMALDI-TOF-MSofurinarypeptidesforthedetectionofmuscle-invasivebladdercancer[J].ProteomicsClinAppl,2011,5(9-10):493-503.SogawaK,WatanabeM,NomuraF.RapididentificationofmicroorganismsusingMALDI-TOFmassspectrometry[J].RinshoByori,2013,61(1):44-51.AnJ,TangC,WangN,etal.PreliminarystudyofMALDI-TOFmassspectrometry-basedscreeningofpatientswiththeNSCLCserum-specificpeptides[J].ZhongguoFeiAiZaZhi,2013,16(5):233-9.FanY,WangJ,YangY,etal.Detectionandidentificationofpotentialbiomarkersofbreastcancer[J].JCancerResClinOncol,2010,136(8):1243-54.WanQL,HouXS,ZhaoG.Utilityofserumpeptidomepatternsofesophagealsquamouscellcarcinomapatientsforcomprehensivetreatment[J].AsianPacJCancerPrev,2013,14(5):2919-23.KimHK,ReyzerML,ChoiIJ,etal.Gastriccancer-specificproteinprofileidentifiedusingendoscopicbiopsysamplesviaMALDImassspectrometry[J].JProteomeRes,2010,9(8):4123-30.AnJ,TangC,WangN,etal.PreliminaryStudyofMALDI-TOFmassspectrometry-basedscreeningofPatientswiththeNSCLCserum-specificpeptides[J].ZhongguoFeiAiZaZhi,2013,16(5):233-9.ChenXL,ZhouL,YangJ,etal.Hepatocellularcarcinoma-associatedproteinmarkersinvestigatedbyMALDI-TOFMS[J].MolMedRep,2010,3(4):589-96.SchwambornK,KriegRC,GrosseJ,etal.Serumproteomicprofilinginpatientswithbladdercancer[J].EurUrol,2009,56(6):989-96.SunTC,XinL,SongLM,etal.Nuclearmatrixproteinsdifferentiallyexpressedinhumanprostatecancercelllinesandbenignprostatichyperplasiaepithelialcellline[J].ZhonghuaNanKeXue,2012,18(7):583-9.QiSZ,ZhangGC,ZhangJP,etal.Comparativeproteomeanalysisofhumanpapillomavirus-infectedcervicalspecimensandthedifferencebetweenthehigh-andlow-riskgenotypesofhumanpapillomavirus[J].ZhongguoYiXueKeXueYuanXueBao,2007,29(5):597-602.ZhuX,L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