免疫分析技術(shù)

免疫分析技術(shù)第一頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容第一節(jié)免疫檢測(cè)技術(shù)概述第二節(jié)四種常見免疫分析技術(shù)第三節(jié)免疫生物傳感器第四節(jié)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)第五節(jié)免疫親和色譜第六節(jié)免疫印跡技術(shù)第二頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)免疫檢測(cè)技術(shù)概述免疫檢測(cè)技術(shù)起源：檢測(cè)病原微生物抗原及抗體的血清學(xué)診斷。1896年G.Widal和A.Sicard利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效準(zhǔn)確地診斷傷寒。免疫分析法（immunoassay,IA）是利用抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生免疫復(fù)合物的原理分析微量或超微量待測(cè)物質(zhì)的一種分析手段，往往需要借助一種信號(hào)放大系統(tǒng)把抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)信息予以展現(xiàn)和放大。免疫分析技術(shù)是以抗原與抗體在體外特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。免疫分析法是將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測(cè)試手段相結(jié)合而建立的超微量測(cè)定技術(shù)。第三頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日免疫分析技術(shù)的特點(diǎn)高度的靈敏性：可檢測(cè)10-18~10-6級(jí)別的物質(zhì)；（免疫聚合酶鏈反應(yīng)，免疫沉淀反應(yīng)）高度的特異性：可區(qū)別物質(zhì)間細(xì)微的差異，這是其他技術(shù)無法比擬的。第四頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日樣品前處理復(fù)雜操作繁瑣需要昂貴的儀器設(shè)備檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)可大大簡(jiǎn)化甚至省去復(fù)雜的樣品前處理過程操作簡(jiǎn)便無需昂貴的儀器設(shè)備快速、靈敏、特異，可短時(shí)間檢測(cè)大量樣品

與目前農(nóng)藥殘留的主要檢測(cè)方法氣相色譜分析法和高效液相色譜法等相比，免疫分析方法具有明顯優(yōu)勢(shì)。GC/HPLC法IA分析法第五頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日免疫分析技術(shù)的分類根據(jù)免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)類型分為：競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）共同競(jìng)爭(zhēng)與抗體的反應(yīng)。

Ag（樣品）+AbAgAbAg*（定量加入）

+Ab*AgAb夾心反應(yīng)：將抗體、抗原和第二抗體結(jié)合在一起，形成夾心式結(jié)合物。最終，檢測(cè)夾心結(jié)合物上標(biāo)記物，計(jì)算樣品中抗原含量。

Ab1+Ag+Ab2*Ab1-Ag-Ab1*第六頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日免疫分析技術(shù)的分類根據(jù)抗原和抗體在反應(yīng)中存在方式不同分為：均相分析（液相免疫分析）：不需要將游離抗原與結(jié)合物分離，直接進(jìn)行測(cè)定。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單省時(shí)，適合于測(cè)定小分子化合物，靈敏度10-9g/ml；異相分析（固相免疫分析）：抗原抗體反應(yīng)后，將結(jié)合物與游離抗原（或抗體）及樣品用常規(guī)物理方法分離，然后對(duì)分離出的結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)。特點(diǎn)：有較高靈敏度靈敏度10-12g/ml，干擾少。第七頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日免疫分析技術(shù)的分類根據(jù)標(biāo)記方法的不同分為：熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)、生物發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，并借助熒光顯微鏡、射線測(cè)量?jī)x、酶標(biāo)檢測(cè)儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接進(jìn)行觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定。第八頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)四種常見免疫分析技術(shù)第九頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）熒光免疫分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種，是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。

1941年，Coons首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)?；驹恚簾晒饷庖叻治龇ㄊ菍⒉挥绊懣乖贵w活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。第十頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）熒光免疫分析技術(shù)熒光現(xiàn)象與熒光物質(zhì)

熒光素(fluorescein):

在藍(lán)光或紫外線照射下，發(fā)出綠色熒光的一種黃色染料。用于熒光抗體技術(shù)中的熒光染料。常用的熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC），四乙基羅丹明（RB200），四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。第十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）熒光免疫分析技術(shù)抗體的熒光素標(biāo)記

用于標(biāo)記的抗體要求：高特異性和高親和力；不應(yīng)含有針對(duì)標(biāo)本中正常組織的抗體；一般需經(jīng)純化提取后再作標(biāo)記。作為標(biāo)記的熒光素要求：具有能與Ab分子形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)；與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率；熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明；與Ab結(jié)合后不影響Ab的生化與免疫性質(zhì)；標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無毒；與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，不易解離，易于保存。

第十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）熒光免疫分析技術(shù)直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異熒光染色因素少，缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體第十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）熒光免疫分析技術(shù)間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。應(yīng)用：常用于微生物檢測(cè)，例如：沙門氏菌。第十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用:熒光抗體技術(shù)在臨床檢驗(yàn)上已廣泛用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)及自身免疫病的診斷等第十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日熒光顯微鏡第十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）放射免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)（Radioimmunoassay，RIA）定義：是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析方法，用于定量測(cè)定受檢標(biāo)本中抗原。1959年，Yalow和Berson創(chuàng)建的分析方法?；驹恚旱谑唔?yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）放射免疫分析技術(shù)常用標(biāo)記核素：125I：γ射線，半衰期60天3H：β射線，半衰期12.3年測(cè)量?jī)x器γ計(jì)數(shù)儀β液閃儀優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度高，高達(dá)ng~pg水平;測(cè)定的準(zhǔn)確性好，數(shù)量級(jí)的回收率接近100%.缺點(diǎn)：操作相對(duì)復(fù)雜，同位素半衰期短，保存及操作相對(duì)復(fù)雜。第十八頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日β液閃儀γ計(jì)數(shù)器第十九頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一大新型的標(biāo)記免疫技術(shù)，這一技術(shù)的誕生被譽(yù)為免疫血清學(xué)技術(shù)的一場(chǎng)革命，是應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)技術(shù)之一。1971年，Engvall和Perlman首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA）。由于ELISA具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。第二十頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)基本原理：利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。常用于標(biāo)記抗體的酶：酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。第二十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)直接法測(cè)定抗體缺點(diǎn)：每檢查一種抗體需制備相應(yīng)的特異抗體。第二十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)間接法測(cè)定抗體優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗體的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種酶標(biāo)抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。第二十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)雙抗體夾心測(cè)定抗原第二十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）酶聯(lián)免疫分析技術(shù)應(yīng)用：檢測(cè)食品中農(nóng)、獸藥殘留及微生物；還可以檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)素，例如蛋白質(zhì)、激素等。第二十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日酶標(biāo)儀第二十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)光免疫分析：將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。第二十七頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)：將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)。常用化學(xué)發(fā)光劑有直接化學(xué)發(fā)光劑和酶促反應(yīng)發(fā)光劑。直接化學(xué)發(fā)光劑：吖啶酯，三聯(lián)吡啶釕

酶促反應(yīng)發(fā)光劑：魯米諾及其衍生物，AMPPD第二十八頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)基本原理：用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。第二十九頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光-直接競(jìng)爭(zhēng)法第三十頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光-雙抗體夾心法第三十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日幾種標(biāo)記免疫分析技術(shù)比較檢測(cè)方法檢測(cè)范圍生化、常規(guī)免疫mg~μg（10-3~10-6g）熒光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發(fā)光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）第三十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)免疫生物傳感器免疫生物傳感器（immune-biosensor）是生物技術(shù)與微電子技術(shù)結(jié)合，利用生物體內(nèi)抗原、抗體轉(zhuǎn)移性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化的設(shè)備裝置。免疫傳感器分為兩類：利用競(jìng)爭(zhēng)酶免疫反應(yīng)原理設(shè)計(jì)：例如：黃曲霉毒素傳感器：氧化極和黃曲霉抗體膜組成檢測(cè)農(nóng)、獸殘留，微生物等利用親和性設(shè)計(jì)：例如：農(nóng)獸藥品種檢測(cè)食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)素（氨基酸、脂肪酸和糖類）以及農(nóng)獸藥等污染物。第三十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日免疫生物傳感器原理示意圖緩沖液抗體生物傳感和傳輸元件檢測(cè)器廢液缸計(jì)算機(jī)待測(cè)樣品（酶標(biāo)抗原）底物泵第三十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)膠體金（colloidalgold）是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核及包圍在外的雙例子層構(gòu)成，緊連在金核（Au）表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuCl2-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。免疫金：膠體金可與免疫活性物質(zhì)（抗體或抗原）結(jié)合形成膠體金結(jié)合物，常稱為免疫金復(fù)合物（肉眼可見的紅色）。第三十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)原理：以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，以微孔濾膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測(cè)樣品后，經(jīng)濾膜毛細(xì)管作用，使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，膠體金結(jié)合物大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。第三十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)結(jié)果以血吸