免疫檢測新技術(shù)

免疫檢測新技術(shù)第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日章節(jié)安排第一節(jié)生物素-親和素免疫檢測新技術(shù)第四節(jié)免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)的因素第二節(jié)免疫膠體金檢測新技術(shù)第2節(jié)影響第三節(jié)免疫電鏡技術(shù)第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日[目的與要求]

1、了解標(biāo)生物素-親和素免疫檢測技術(shù)的原理及種類。

2、理解免疫膠體金檢測技術(shù)的原理及常用的檢測方法。

3、了解免疫電鏡技術(shù)的應(yīng)用。

4、了解免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)的原理及應(yīng)用。

[難點(diǎn)與重點(diǎn)]

重點(diǎn)：免疫膠體金檢測技術(shù)的原理。難點(diǎn)：免疫膠體金檢測技術(shù)的原理。第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)生物素-親和素免疫檢測新技術(shù)第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日

利用生物素與親和素專一性結(jié)合以及生物素、親和素既可標(biāo)記抗原或抗體，又可被標(biāo)記物所標(biāo)記的特性，可建立生物素-親和素系統(tǒng)來顯示抗原抗體特異性反應(yīng)的各種免疫檢測技術(shù)。第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、生物素與親和素的特性1、生物素生物素(biotin)是一種廣泛分布于動、植物組織的生長因子，亦稱輔酶R或維生素H，尤以蛋黃、肝、腎組織中含量較高。結(jié)構(gòu)式中的咪唑酮環(huán)是與親和素結(jié)合的主要部位。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾后，可以制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素。針對不同的被標(biāo)記物可以應(yīng)用不同類型的活化生物素。第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、生物素與親和素的特性2、親和素

(avidin)：是一種存在于雞蛋清中的堿性糖蛋白，結(jié)晶呈白色粉末狀，易溶于水。在pH2～13緩沖液中性質(zhì)穩(wěn)定，消化道多種蛋白水解酶不能使其失活。它對熱的耐受性較強(qiáng)，經(jīng)80℃溫度作用2min仍保持活性。親和素是由4個(gè)相同的亞單位組成的四聚體，富含色氨酸，通過色氨酸與生物素的咪唑環(huán)呈十分牢固的結(jié)合。親和素的每個(gè)亞單位可結(jié)合1個(gè)分子生物素，因此1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子。鏈霉親和素

第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術(shù)類型1、親和素-生物素-過氧化物酶技術(shù)(ABC法)

（1）原理：ABC法是利用親和素分別連接生物素標(biāo)記的第2抗體和生物素標(biāo)記的酶。生物素標(biāo)記的第2抗體與ABC復(fù)合物相連接，最后加底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。其中，ABC復(fù)合物是將過氧化酶結(jié)合在生物素上，再將生物素-過氧化酶連接物與過量的親和素蛋白反應(yīng)而制備的。第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術(shù)類型1、親和素-生物素—過氧化物酶技術(shù)(ABC法)

（2）應(yīng)用：①組織切片和細(xì)胞懸液中抗原的檢測②在免疫電鏡中的應(yīng)用標(biāo)記抗體滲透性是免疫電鏡技術(shù)的關(guān)鍵，小分子的生物素就可得到更高的滲透力，且生物素化抗體可在組織包埋前或包埋后加入，因此ABC法進(jìn)行抗原的亞細(xì)胞水平定位分析得到較好的應(yīng)用。第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日目前最靈敏的免疫組化二抗檢測系統(tǒng)

由于親和素和生物素有極強(qiáng)的親和力（其親和力比抗體和大多數(shù)抗原的親和力高100萬倍），因而親和素和生物之間的結(jié)合是不可逆的。此外，親和素具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，大多數(shù)蛋白質(zhì)包括酶可以和多個(gè)生物素分子結(jié)合。利用這些特征，可以把親和素和生物素化的酶結(jié)合為大分子復(fù)合物（ABC’s）。第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日

使用步驟：1．加入一抗，與切片孵育。如加入兔抗腫瘤相關(guān)抗原的抗體。2．加入生物素化二抗，如生物素化抗-兔IgG。3．加入親和素-生物素化酶復(fù)合物（ABC）。4．加入酶作用底物，定位抗原。第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術(shù)類型2、橋親和素-生物素技術(shù)(BRAB)

原理及應(yīng)用：方法是用生物素分別標(biāo)記抗體和酶，然后以親和素為橋，把兩者連接起來。檢查抗原時(shí)，先用生物素標(biāo)記的抗體與細(xì)胞(或組織內(nèi))的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體，加人親和素孵育后，洗去未結(jié)合的親和素，再加入已標(biāo)記酶的生物素孵育，洗片，以細(xì)胞化學(xué)方法呈色反應(yīng)。第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術(shù)類型3、標(biāo)記生物素-親和素技術(shù)(LAB)

LAB法是以生物素標(biāo)記抗體作第1抗體，酶標(biāo)記親和素作為第2抗體。

BRAB法和LAB法都需以生物素標(biāo)記第1抗體，應(yīng)用不如ABC法普遍。但是，用于免疫細(xì)胞中免疫球蛋白的顯示具有特異性。第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術(shù)類型4、生物素-親和素或鏈霉親和素ELISA檢測技術(shù)

包括BAB-ELISA，BA-ELISA和ABC-ELISA等技術(shù)。第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日第2節(jié)免疫膠體金檢測技術(shù)第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日

免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金顆粒為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。已廣泛應(yīng)用于光鏡、電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫轉(zhuǎn)印、體外診斷試劑的制造等領(lǐng)域。膠體金即水溶膠，是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體溶液，具有一般溶膠的特性，主要通過還原劑將氯化金分子聚合成特定大小金顆粒的方法而產(chǎn)生?？赏ㄟ^采用檸檬酸、抗壞血酸鈉和白磷等還原氯金酸或四氯化金而制備膠體金。膠體金顆?？赏ㄟ^靜電吸引及其表面的物理特性與多種生物分子(如抗體、SPA)相結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-金顆粒復(fù)合物，即膠體金標(biāo)記物(膠體金探針)。一、概述第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。

第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術(shù)1、免疫膠體金光鏡染色法

細(xì)胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術(shù)2、免疫膠體金電鏡染色法

可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染。可用于病毒形態(tài)的觀察和病毒檢測。第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術(shù)3、斑點(diǎn)免疫金滲濾法

應(yīng)用微孔濾膜(如NC膜)作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于NC膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體。第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術(shù)4、膠體金免疫層析法

將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在NC膜上，膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日四、免疫膠體金檢測技術(shù)的應(yīng)用

免疫膠體金檢測技術(shù)主要應(yīng)用于組織化學(xué)染色、基礎(chǔ)免疫學(xué)研究(如通過膠體金標(biāo)記的CD分子單克隆抗體采用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群)和疾病診斷。第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日第3節(jié)免疫電鏡技術(shù)第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日

免疫電鏡技術(shù)(immuneelectronmicroscopy，IEM)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電鏡的高分辨能力相結(jié)合的檢測技術(shù)，該方法始建于1941年。IEM主要包括兩個(gè)方面應(yīng)用：①在電鏡下利用標(biāo)記抗體，直接對抗原在分子水平上進(jìn)行定位；②利用特異性抗體捕獲、濃縮相應(yīng)的病毒，經(jīng)負(fù)染后在電鏡下檢查病毒粒子，可用于病毒病的診斷。第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、抗原定位

用酶、鐵蛋白、膠體金標(biāo)記的特異性抗體，對組織切片進(jìn)行染色，結(jié)合電鏡技術(shù)，可對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原的分布進(jìn)行定位。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫電鏡技術(shù)可分為電鏡免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)等。第三十頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、病毒檢測

在所檢病毒樣中加入已知抗血清，使形成抗原(病毒)—抗體復(fù)合物，經(jīng)過超速離心或瓊脂、濾紙濃縮、過濾系統(tǒng)后將此抗原—抗體復(fù)合物濃集于電鏡銅網(wǎng)的For-mar膜上，負(fù)染色后進(jìn)行電鏡觀察。由于抗體將病毒濃縮在一起，比直接觀察散在病毒粒子的方法大大提高了敏感性。第三十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日

目前有幾種方法：①經(jīng)典的免疫電鏡法是將待檢樣品與抗血清混合反應(yīng)后，超速離心，吸取沉淀物染色觀察；②快速法是在瓊脂糖凝膠上打孔，下墊濾紙，孔中加入待檢樣品與抗血清混合液，然后將銅網(wǎng)膜漂浮于孔中的免疫反應(yīng)液滴上，待液滴被濾紙吸下后取出銅網(wǎng)膜、