免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)第一頁，共六十頁，2022年，8月28日1.1概念

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）:

將化學(xué)反應(yīng)中呈色反應(yīng)與免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來，用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對細(xì)胞及組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)原位檢測的一門技術(shù)。第一節(jié)概述

第二頁，共六十頁，2022年，8月28日1.2與組織化學(xué)的關(guān)系

從廣義上理解：免疫組織化學(xué)為組織化學(xué)的分支。不同點(diǎn)：

組織化學(xué)的局限性：只能識別細(xì)胞或組織中核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂肪等，對免疫活化的大分子不能特異識別；方法上繁鎖，不易掌握。第三頁，共六十頁，2022年，8月28日

免疫組化的優(yōu)點(diǎn)：能識別細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)、脂、多糖類及小分子肽類。只要理論上具有抗原性，可以制備出相應(yīng)抗體，就可以示蹤定位，因此其待檢物質(zhì)廣泛；方法上“一通百通”。1.3免疫組化在生物學(xué)中的應(yīng)用

第四頁，共六十頁，2022年，8月28日第二節(jié)

免疫組織化學(xué)的理論基礎(chǔ)

第五頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1抗原2.1.1定義抗原(antigen，Ag)是一類在合適條件下，能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（包括抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)和（或）體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)，它具有免疫原性和反應(yīng)原性。第六頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫原性指的是它能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答；反應(yīng)原性指的是它能與抗體或致敏淋巴細(xì)胞特異性地結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)。第七頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1.2分類

完全抗原:兼有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)稱完全抗原。大多數(shù)蛋白質(zhì)是良好的完全抗原。

半抗原:只有反應(yīng)原性而無免疫原性的物質(zhì)稱半抗原或不完全抗原，絕大多數(shù)低分子量的多糖和所有的類脂均屬半抗原。第八頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1.3抗原的特異性抗原具有與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的特異性。這是由抗原分子表面具有化學(xué)活性的基團(tuán)—抗原決定簇的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)型決定的?？乖瓫Q定簇能被免疫活性細(xì)胞所識別，能與相應(yīng)抗體的可變區(qū)結(jié)合。

第九頁，共六十頁，2022年，8月28日2.1.4抗原的異物性

抗原化學(xué)結(jié)構(gòu)必須與宿主自身物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)相異。

①異種物質(zhì)。如鴨血清蛋白對于兔為強(qiáng)抗原，對于雞則為弱抗原。②同種異體物質(zhì)。如人類的ABO血型的抗原物質(zhì)；③自身抗原。如被血——睪屏障所嚴(yán)密封閉的精子所含的物質(zhì)。

第十頁，共六十頁，2022年，8月28日2.2抗體

2.2.1定義抗體(antibody)是機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性地結(jié)合的球蛋白，稱免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，存在于血液、淋巴液和組織液中。第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日2.2.2結(jié)構(gòu)抗體的基本結(jié)構(gòu)由四條肽鏈對稱排列組成，即兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈?？勺儏^(qū)與穩(wěn)定區(qū)第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日

抗原與抗體的結(jié)合具有高度特異性，抗體結(jié)合抗原的不同特異性，取決于輕鏈和重鏈的可變區(qū)氨基酸的種類和順序的不同。2.2.3特異性第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日2.2.4抗體的分類目前，根據(jù)制備的原理和方法可分為多克隆抗體、單克隆抗體及基因工程抗體三類。

第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日

多克隆抗體（第一代抗體）

將一種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，由于抗原性物質(zhì)具有多種決定簇，故可刺激產(chǎn)生多種抗體形成細(xì)胞克隆，合成和分泌抗各種決定簇的抗體分泌到血清中，故在其血清中實(shí)際上是含多種抗體的混合物，稱這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清為多克隆抗體（多數(shù)抗血清系由家兔制得）。第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日

單克隆抗體（第二代抗體）

由識別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，稱為單克隆抗體，具有特異性強(qiáng)、純度高的特點(diǎn)。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體（多數(shù)單克隆抗體由小鼠制備）。第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日

基因工程抗體（第三代抗體）

將對基因結(jié)構(gòu)與功能的了解與DNA重組技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)研究者的意圖在基因水平對分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚至是人工全合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日第三節(jié)

免疫組化染色方法及原理

第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.1標(biāo)記抗體法（熒光素標(biāo)抗體法或酶標(biāo)抗體法。1941年Coons建立了熒光素標(biāo)記肺炎雙球菌粘多糖抗體。60年代Nakane建立了酶標(biāo)記抗體技術(shù)第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.1.1直接標(biāo)記法

直接用熒光素或辣根過氧化物酶標(biāo)記特異性抗體，與組織切片中相關(guān)抗原結(jié)合，用熒光/普通顯微鏡識別熒光所在的部位或酶顯色的部位，以確定抗原所在的部位。該方法簡單，但購買標(biāo)記特異性抗體較困難，目前已經(jīng)較少使用。

第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日直接標(biāo)記法第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.1.2間接標(biāo)記法

將未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與組織中抗原相結(jié)合，為了觀察其結(jié)合部位，用熒光素或HRP標(biāo)記第二抗體即標(biāo)記在抗第一抗體的免疫球蛋白上再與第一抗體結(jié)合，如第一抗體為兔血清，第二抗體必須為其他動物抗兔的免疫球蛋白抗體。第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日

間接標(biāo)記法第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可避免了直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。缺點(diǎn)：酶與抗體間的共價連結(jié)可損害部分抗體和酶的活性、抗血清中的非特異性抗體被酶標(biāo)記后，與組織成分結(jié)合，可致背景染色等。第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.2非標(biāo)記抗體酶法70年代Sternberger改良并建立了辣根過氧化物酶---抗過氧化物酶復(fù)合物法（PAP）技術(shù)。

第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日

辣根過氧化物酶（HRP）是從辣根中提取的，分子量為40000，等電點(diǎn)3～9，最適PH為5，它的底物是3，3ˊ-二氨基聯(lián)苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黃色產(chǎn)物，可在光鏡和電鏡下觀察。

HRPDAB+H2O2棕黃色產(chǎn)物第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日PAP法基本原理:

第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)卵白素（Avidin）:又稱抗生物素、親和素，具有4個與生物素親和力極強(qiáng)的結(jié)合點(diǎn)。鏈霉親和素（streptavidin）是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，和親和素一樣，也有4個生物素結(jié)合位點(diǎn)。生物素（Biotin）:維生素H，是一種小分子的維生素。第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日抗生物素具有4個與生物素親和力極強(qiáng)的結(jié)合點(diǎn)，這種親和力較抗原抗體的親和力高100萬倍，而且不影響彼此的生物學(xué)活性，同時生物素與抗生物素都具有與其他示蹤物質(zhì)如熒光素、鐵蛋白和HRP相結(jié)合能力，由此建立了抗生物素－生物素免疫染色系統(tǒng)，包括抗生物素－生物素－過氧化酶復(fù)合物技術(shù)（ABC）及鏈霉親合素—生物素－過氧化酶（或堿性磷酸酶）合復(fù)技術(shù)（SABC）。第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3.1ABC法：親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法

第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3.2BRAB法：橋連抗生物素－生物素法：第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日3.1.3.3LSAB法：

標(biāo)記鏈霉抗生物素－生物素法，又稱鏈霉親合素酶結(jié)合法（strepavidinperoxidaseconjgatedmethod,S-P法）,即采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉抗生物素蛋白連接的過氧化物酶來測定細(xì)胞和組織中的抗原。第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第四節(jié)

免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)（1）

第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日4.1組織材料的處理

固定液的選擇及固定的時間長短對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響。一般采用10%中性福爾馬林液（石蠟切片）和丙酮（冰凍切片）固定。組織材料的處理是獲得良好免疫組化結(jié)果的前提，必須保證要檢測的細(xì)胞或組織取材新鮮，固定及時，形態(tài)保存完好，抗原物質(zhì)的抗原性不丟失，不擴(kuò)散和不被破壞。第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2切片前的準(zhǔn)備工作

4.2.1載玻片、蓋玻片處理

清潔液浸泡24小時后依次自來水、雙蒸餾水洗，95%酒精浸泡2小時，擦拭干凈。防脫片處理：將干燥、干凈的玻片放入多聚賴氨酸溶液中浸泡5分鐘，60℃烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥備用。第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.2常用試劑配制

0.05%-0.1%胰蛋白酶取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可。4%胃蛋白酶取4g胃蛋白酶加入到100ml0.1mol/LHCL即可。第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日0.01mol/LPH6.0檸檬酸緩沖液取檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7.2H2O)10g、檸檬酸（C6H8O7.2H2O）1.5g，加雙蒸餾水至1000ml即可。10%中性福爾馬林固定液

40%甲醛與0.01mol/LPH7.4PBS按1：9配制。DAB（3，3-二氮聯(lián)苯胺）染色液取DAB2.5mg充分溶解于5mlPBS后過濾，使用前加入3%H2O215μl即可。第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日0.01mol/LPH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)

原液:

A液:0.2mol/LNa2HPO4.12H2O取72g加雙蒸餾水至1000ml即可。

B液:0.2mol/LNaH2PO4.2H2O取15.6g加雙蒸餾水至500ml即可。工作液：取A液415ml、B液85ml、NaCL85g加雙蒸餾水至10000ml,用0.1N的NaOH調(diào)PH值至7.4即可。第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.3石蠟切片免疫組化染色步驟(S-P法)

石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5～10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。5～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~～2小時或4℃過夜。

第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日PBS沖洗，5分鐘×3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗或二抗工作液，37℃孵育10~30分鐘；

PBS沖洗，5分鐘×3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素或工作液，37℃孵育10~30分鐘；PBS沖洗，5分鐘×3次。顯色劑顯色（DAB）。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.4冰凍切片免疫組化染色步驟

冰凍切片4～8μm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3次。用3%過氧化氫孵育5～10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2次。下接免疫組化染色操作步驟。第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.5抗原修復(fù)

4.2.5.1蛋白酶消化

胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%～0.1%，消化時間為37℃、10～40分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30～180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日4.2.5.2抗原熱修復(fù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具有條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原。第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日

石蠟切片微波爐抗原修復(fù)：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃～98℃之間并持續(xù)10～15分鐘。取出容器，室溫冷卻10～20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日第五節(jié)

免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)（2）

第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日5.1免疫組化結(jié)果的判斷

免疫組化的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。

第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日5.1.1陽性反應(yīng)的染色特征

陽性反應(yīng)染色分布有四種類型：細(xì)胞間質(zhì)、胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞膜表面。

陽性細(xì)胞分布呈灶性和彌漫性。由于細(xì)胞內(nèi)含抗原量不同，所以染色強(qiáng)度不一。如果細(xì)胞之間染色強(qiáng)度相同，常提示其反應(yīng)為非特異性。陽性細(xì)胞染色定位于單個細(xì)胞，且與陰性細(xì)胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞。切片邊緣、刀痕或皺褶區(qū)域，壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強(qiáng)度，不能用于判斷陽性。第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日5.1.2假陽性及其處理

所用的抗體與其它無關(guān)的抗原有交叉反應(yīng)，特異性差，特別是使用多克隆抗血清時較易出現(xiàn)；組織細(xì)胞內(nèi)含有DAB沉淀相類似的色素。假過氧化物酶活性：組織中存在紅細(xì)胞時，即不加過氧化物酶，也可出現(xiàn)陽性結(jié)果。第五十三頁，共六十頁，2022年，8月28日內(nèi)源性過氧化物酶活性：過氧化物酶體等存在過氧化物酶，能夠與H2O2

～DAB反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性。游離醛基：用小分子賴氨酸、白蛋白等預(yù)先孵育切片，可封閉之。疏水鍵和離子鍵：用