免疫標(biāo)記技術(shù)節(jié)熒光免疫技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)節(jié)熒光免疫技術(shù)第一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第十七章熒光免疫技術(shù)第二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光免疫技術(shù)的基本原理熒光的基本知識(shí)熒光抗體染色的方法及其原理熒光抗體的制備熒光免疫測(cè)定的類型及其原理免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用本章要點(diǎn)第三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日目錄基本知識(shí)1熒光免疫顯微技術(shù)2時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定3熒光偏振免疫測(cè)定4免疫芯片技術(shù)5第四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光檢測(cè)技術(shù)的敏感性和直觀性相結(jié)合而建立的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。前言第五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)基本知識(shí)熒光免疫技術(shù)：用熒光素標(biāo)記Ab或Ag，與待測(cè)標(biāo)Ag或Ab結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)熒光，確定標(biāo)本中有無(wú)相應(yīng)的Ab或Ag。AbF（AgF）+Ag（Ab）AbF-Ag/（AgF–Ab）熒光激發(fā)光檢測(cè)

分類熒光免疫分析

（定量）熒光抗體技術(shù)（定位、定性）第六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日一、熒光的基本知識(shí)熒光（fluorescence）

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出的波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)的光?；鶓B(tài)發(fā)射光（熒光）基態(tài)（熒光物質(zhì)）激發(fā)態(tài)發(fā)射光譜激發(fā)光譜激發(fā)光第七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光效率熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率。

發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）熒光效率=第八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光壽命

熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時(shí)間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。熒光淬滅熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、高溫（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。*熒光免疫檢測(cè)中避免熒光淬滅的發(fā)生；消除非特異性熒光（本底）的干擾。第九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日Stokes位移熒光物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的過(guò)程中，由于部分能量丟失而導(dǎo)致發(fā)射光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)，兩者波長(zhǎng)之差。熒光偏振熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光照射后，吸收光能并發(fā)出單一平面的偏振熒光的現(xiàn)象。第十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日

二、常用的熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570nm～575nm595nm～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490nm-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)碘化丙啶（PI）488nm620nm橙紅色Eu3+螯合物340nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日三、熒光抗體的制備熒光素?cái)嚢璺ㄍ肝龇ㄖ苽涿庖哐逵H和層析離子交換層析法純化抗體標(biāo)記抗體純化透析法凝膠過(guò)濾法鑒定實(shí)際應(yīng)用第十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)熒光免疫顯微技術(shù)定性和定位檢測(cè)，或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定熒光素標(biāo)記抗體與標(biāo)本片中組織或細(xì)胞抗原結(jié)合，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。第十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日

AbF+Ag（組織/細(xì)胞）AbF-Ag檢測(cè)特異性熒光紫外線一、基本原理第十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、方法類型1.直接法2.間接法3.雙標(biāo)記法第十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日固定Ag（待測(cè)）＋Ab*——AgAb*快，直接、干擾因素少；常用于檢測(cè)Ag

特異性高但敏感度偏低檢測(cè)一種Ag，需標(biāo)記一種Ab，較麻煩Ag？

AbF直接法第十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日制備一種熒光抗體，可檢測(cè)多種Ag或Ab既可檢測(cè)Ag，又可檢測(cè)Ab。靈敏度高間接法熒光素標(biāo)記抗抗體AgAb抗－Ab*第十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日雙標(biāo)記法兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本不同抗原表位反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。如：具CD3、CD4表位的Th細(xì)胞。ThCD3CD4（FITC黃綠）（RB200橘紅）第十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日三、關(guān)鍵技術(shù)1.標(biāo)本制作2.熒光抗體染色3.熒光顯微鏡檢查4.熒光抗體染色結(jié)果判讀第十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)本制作組織切片：冷凍切片、石蠟切片印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞冷凍切片：操作簡(jiǎn)單，抗原損失少，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰石蠟切片：組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，抗原損失多固定劑：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃第二十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光抗體染色于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)相關(guān)試劑（含適當(dāng)稀釋的熒光抗體），置濕盒內(nèi)25℃～37℃溫育30分鐘左右或4℃過(guò)夜；然后用PBS充分洗滌，待干燥后鏡檢。第二十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光顯微鏡檢查（熒光顯微鏡）

光源：高壓汞燈氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野相差聚光器鏡頭：消色差鏡頭第二十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日隔熱濾光片：阻斷紅外線通過(guò)而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，使紫外線（激發(fā)光）透過(guò)。吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過(guò)，保護(hù)眼睛。熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第二十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日透射光：照明光線從標(biāo)本下方經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上方落射到標(biāo)本上，經(jīng)反射進(jìn)入物鏡。透射熒光光路(a)落射熒光光路(b)熒光顯微鏡光路圖光路熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第二十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照區(qū)分特異和非特異染色陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷熒光顯微鏡檢查（結(jié)果判斷）

“-”：無(wú)或極微弱“+”：較弱但清晰可見(jiàn)“++”：明亮“+++”：耀眼對(duì)照光：“-”或“±”陽(yáng)性：特異熒光強(qiáng)度“+”以上效價(jià)：呈"+"的血清最高稀釋度第二十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日四、方法評(píng)價(jià)與應(yīng)用方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：可用于抗原或抗體的定位、定性檢查，既有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強(qiáng)。

缺點(diǎn)：熒光容易消退，難以制備永久性標(biāo)本，非特異熒光常干擾結(jié)果判斷。第二十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)應(yīng)用自身抗體檢測(cè)抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用臨床應(yīng)用第二十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日病原體檢測(cè)寄生蟲(chóng)（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲(chóng)）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用細(xì)菌（藤黃微球菌)第二十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測(cè)以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)第二十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日其他：如免疫病理、腫瘤等檢測(cè)腫瘤抗原（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第三十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)第三十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，并與時(shí)間分辨技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型超微量物質(zhì)免疫分析方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、發(fā)光穩(wěn)定、自然熒光干擾少、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等特點(diǎn)，已在臨床實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。第三十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日AgEu3＋/AbEu3＋+Ag/Ab檢測(cè)一、基本原理AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag?Ab/Ag

熒光壽命長(zhǎng)：10μs-1000μs，時(shí)間差—

時(shí)間分辨

Stokes位移大：270nm，易分辨第三十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日時(shí)間分辨短壽命熒光長(zhǎng)壽命熒光第三十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日Eu3+元素的stokes位移第三十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、方法類型12

3雙抗體夾心法固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法第三十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日Eu增強(qiáng)液激發(fā)Eu固相Ab待檢AgEu標(biāo)記Ab每一步均需洗滌Eu解離發(fā)光雙抗體夾心法第三十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日增強(qiáng)液激發(fā)固相AbAg？AgEu3+熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成負(fù)相關(guān)固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法第三十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日增強(qiáng)液激發(fā)固相AgAg？AbEu3+熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成負(fù)相關(guān)固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法第三十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日三、方法評(píng)價(jià)

靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個(gè)數(shù)量級(jí)

標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長(zhǎng)

測(cè)量快速，易自動(dòng)化易受污染，本底增高第四十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日四、臨床應(yīng)用廣泛用于微量或超微量物質(zhì)的檢測(cè)，如各種激素（肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等）、蛋白質(zhì)、酶、藥物、腫瘤標(biāo)記物及病毒抗原等的測(cè)定。第四十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)熒光偏振免疫測(cè)定（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）

熒光偏振免疫測(cè)定是利用抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物之間熒光偏振程度的差異，測(cè)定液體中小分子物質(zhì)的含量。第四十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日一、基本原理熒光物質(zhì)經(jīng)激發(fā)光照射后，可發(fā)出偏振熒光，其強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)熒光素標(biāo)記的小分子抗原（AgF）偏振熒光弱；而形成的AgF-Ab分子增大，偏振熒光強(qiáng)反應(yīng)體系中待測(cè)Ag與AgF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合已知抗體，故待測(cè)Ag越多，形成AgF-Ab越少，游離AgF多，故待檢Ag含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比第四十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日

（一）FPIA原理熒光偏振免疫測(cè)定示意圖第四十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日二、方法評(píng)價(jià)熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)重復(fù)性好快速，易自動(dòng)化適于小、中等分子物質(zhì)檢測(cè)儀器設(shè)備昂貴，試劑盒專屬性強(qiáng)靈敏度較非均相熒光免疫測(cè)定法低第四十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日三、臨床應(yīng)用主要用于測(cè)定小分子抗原物質(zhì)，是臨床藥物濃度測(cè)定的首選方法，目前已有多種藥物、激素、毒品和常規(guī)生化項(xiàng)目可以用本方法進(jìn)行分析，如環(huán)孢素、苯妥英鈉、卡馬西平、地高辛、丙戊酸、苯巴比妥、氨茶堿及鴉片濃度等測(cè)定。第四十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第五節(jié)免疫芯