免疫細(xì)胞的分離與檢測(cè)

免疫細(xì)胞的分離與檢測(cè)第一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日一、免疫細(xì)胞的特征1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征理化性狀生物學(xué)特性2、免疫細(xì)胞的膜分子特征

CD分子第二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日NKcells吞噬溶酶體第四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法第六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、密度梯度離心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分層液Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，親水性高，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。

第七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細(xì)胞分離液血漿單個(gè)核細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞第八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日2、黏附分離法-純淋巴細(xì)胞群的分離貼壁法：將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。第九頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日2、黏附分離法：淋巴細(xì)胞亞群的分離尼龍毛法：混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過(guò)尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過(guò)尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。

T細(xì)胞得率為20-30%左右。親和板法：利用親和層析法分離淋巴細(xì)胞亞群，其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽(yáng)性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取。吸附柱法：將單個(gè)核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來(lái)的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡(jiǎn)單易行，對(duì)細(xì)胞極少損害。第十頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日3、熒光激活分離法（FACS）第十一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日流式細(xì)胞儀第十二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日4、磁性分離法（1）磁鐵吸引法：利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在單個(gè)核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。（2）磁激活細(xì)胞分離術(shù)MACs：是一種特異性細(xì)胞分選技術(shù)，其高度特異性來(lái)自抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順磁化微粒。MACS分選柱置于一個(gè)永久性磁場(chǎng)—MACS分選器中，可以將磁力增強(qiáng)1000倍，足以滯留僅標(biāo)記極少量微珠的目的細(xì)胞。用緩沖液沖洗分選柱，所有未標(biāo)記的細(xì)胞被沖洗掉。分選柱離開(kāi)磁場(chǎng)，即可獲得被標(biāo)記的細(xì)胞組分。第十三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日MACS(陽(yáng)性選擇法）NS第十四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日MACS(陰性選擇法）NS第十五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第十七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日5、其他分離法花環(huán)沉降法：本法是將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合，待淋巴細(xì)胞形成E花環(huán)后，繼用淋巴細(xì)胞分層液分離細(xì)胞。浮懸在分層界面而不形成E花環(huán)的群則富含B細(xì)胞，而沉降在管底的形成E花環(huán)的細(xì)胞用低滲法處理，使圍繞細(xì)胞周?chē)木d羊紅細(xì)胞快速裂解，則獲得純的T細(xì)胞?？扇苄訫HC-肽四聚體法：mhc-肽四聚體復(fù)合物的原理是通過(guò)增強(qiáng)t細(xì)胞受體與mhc-肽復(fù)合物親和力，達(dá)到可直接特異性檢測(cè)t細(xì)胞的目的。作為臨床診斷工具，定量檢測(cè)外周血及組織中抗原特異性CTLs的比率，并進(jìn)行表型及功能分析。

用于過(guò)繼性腫瘤免疫治療

用于疫苗療效的監(jiān)測(cè)第十八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)T第十九頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日MHCI類(lèi)(左)和Ⅱ類(lèi)(右)分子四聚體結(jié)構(gòu)示意圖第二十頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1、細(xì)胞凍存的原理與方法：在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，引起細(xì)胞死亡。向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。2、細(xì)胞復(fù)蘇的原理與方法：細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。第二十一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞凍存罐第二十二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

第二節(jié)免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類(lèi)型二、免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)方法第二十三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類(lèi)型1、以抗體識(shí)別抗原2、以配體識(shí)別受體第二十四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日二、免疫細(xì)胞膜分子的主要檢測(cè)方法1、免疫標(biāo)記檢測(cè)方法熒光抗體法酶免疫檢測(cè)法免疫金銀染色法2、補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）3、花環(huán)形成試驗(yàn)第二十五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日SmIg的熒光抗體檢測(cè)法第二十六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日SmIg的酶免疫檢測(cè)法第二十七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）染料補(bǔ)體第二十八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日E-花環(huán)：利用T細(xì)胞膜上的異種動(dòng)物紅細(xì)胞受體T細(xì)胞B細(xì)胞花環(huán)形成細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞第二十九頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日EA-花環(huán)：B淋巴細(xì)胞表面有Fc受體，能與免疫球蛋白的Fc段結(jié)合，因此用抗體致敏的紅細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞混合，可見(jiàn)B淋巴細(xì)胞周?chē)掣接屑t細(xì)胞第三十一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日EAC-花環(huán)：B淋巴細(xì)胞表面有補(bǔ)體受體，在抗體致敏的紅細(xì)胞中加入補(bǔ)體，可形成紅細(xì)胞-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物，再與B淋巴細(xì)胞混合，則可形成EAC玫瑰花環(huán)。第三十二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

第三節(jié)免疫細(xì)胞功能測(cè)定一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)二、細(xì)胞毒試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)四、細(xì)胞吞噬與殺傷試驗(yàn)第三十三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：刺激物分為非特異性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特異性刺激因子（如抗原）；檢測(cè)方法為形態(tài)學(xué)檢測(cè)法和3H-TdR摻入法及MTT法等。2、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)或稱(chēng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)常用于器官移植前的組織配型，以測(cè)定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴細(xì)胞接受同種異型抗原的刺激而發(fā)生活化、增殖，產(chǎn)生種類(lèi)眾多的細(xì)胞因子，促進(jìn)NK、LAK和CTL等殺傷細(xì)胞的分化，因此又是免疫調(diào)節(jié)研究中常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)第三十四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第三十五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日放射性測(cè)定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理示意小淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)化為原始母細(xì)胞過(guò)程中，合成DNA增加，能夠吸收胸腺嘧啶核苷（3H）第三十六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)2、ADCC作用測(cè)定3、NK活性測(cè)定二、細(xì)胞毒檢測(cè)試驗(yàn)

第三節(jié)免疫細(xì)胞功能測(cè)定第三十七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日放射性測(cè)定細(xì)胞毒試驗(yàn)原理示意靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞分離上清第三十八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日2、K細(xì)胞活性測(cè)定（ADCC活性測(cè)定）動(dòng)物機(jī)體有些免疫細(xì)胞，通過(guò)抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）殺傷靶細(xì)胞，如NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等，這類(lèi)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為K細(xì)胞。K細(xì)胞的活性不僅反映機(jī)體細(xì)胞免疫的能力，而且與體液免疫也有直接的關(guān)系。K細(xì)胞活性檢測(cè)的方法有同位素釋放試驗(yàn)法，溶血空斑法，細(xì)胞剝離法和靶細(xì)胞接合試驗(yàn)。僅介紹同位素釋放法。第三十九頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（1）原理將靶細(xì)胞用51Cr標(biāo)記后，再與特異性的IgG抗體結(jié)合，加入K細(xì)胞后即可發(fā)生ADCC效應(yīng)，引起靶細(xì)胞的溶解并釋放51Cr。用計(jì)數(shù)儀分別檢測(cè)上清和細(xì)胞沉淀中的cpm，根據(jù)上清中釋放的51Cr的多少，可判斷K細(xì)胞活性的高低。第四十頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（2）方法1、試驗(yàn)管：效應(yīng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞懸液)，標(biāo)記的靶細(xì)胞(Cr51標(biāo)記的雞紅細(xì)胞)和亞凝集單位的抗體(兔抗雞紅細(xì)胞抗體)各0.1ml，加RPMI1640完全培養(yǎng)基1.7ml（ADCC）。2、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照管：效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的靶細(xì)胞各0.1ml加上述完全培養(yǎng)基1.8ml（未加抗體）。3、抗體對(duì)照管：標(biāo)記的靶細(xì)胞和亞凝集單位的抗體各0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.8ml（未加效應(yīng)細(xì)胞）。4、最大釋放對(duì)照管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml加蒸餾水1.9ml（靶細(xì)胞會(huì)裂解，完全釋放同位素）。5、自然釋放管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.9ml（靶細(xì)胞不裂解，但可自然釋放一定量的同位素）。以上各管均置37℃5～20h后，2500g離心10min，分別取各管上清夜1.0ml置于5支試管中，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)各管上清和沉淀中的cpm值。第四十一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（3）結(jié)果判斷和計(jì)算51Cr實(shí)驗(yàn)釋放率（%）

2×(上清cpm—本底cpm)×100%(上清cpm-本底cpm)＋(沉淀cpm-本底cpm)51Cr特異釋放率（%）

試驗(yàn)釋放率—自然釋放率×100%

最大釋放率－自然釋放率

第四十二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日3、NK細(xì)胞活性測(cè)定NK細(xì)胞是具有天然殺傷靶細(xì)胞活性的淋巴樣細(xì)胞，其殺傷作用不需要抗體、補(bǔ)體的參加，所殺傷靶細(xì)胞通常指腫瘤細(xì)胞和病毒感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這樣，可以將來(lái)源于同種動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞系或病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，作為檢測(cè)NK細(xì)胞活性的指示細(xì)胞。NK細(xì)胞活性測(cè)定多采用51Cr釋放法試驗(yàn)，其原理同細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗(yàn)中所采用的51Cr釋放法試驗(yàn)。在這里以檢測(cè)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性為例，說(shuō)明本試驗(yàn)方法。用3H-TdR摻入法，靶細(xì)胞為YAC-1細(xì)胞株（小鼠淋巴瘤細(xì)胞系）。第四十三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（1）試劑小鼠脾細(xì)胞懸液:分離單個(gè)脾臟細(xì)胞---裂解紅細(xì)胞---淋巴細(xì)胞洗滌配置懸液（1640完全培養(yǎng)基2×106/ml）。標(biāo)記的靶細(xì)胞：活淋巴細(xì)胞（96%以上）加入H3-Tdr---孵育2小時(shí)/每30min振搖---洗3次---配成2×106/ml懸液。第四十四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（2）方法試驗(yàn)組孔：脾細(xì)胞懸液(淋巴細(xì)胞)：標(biāo)記的靶細(xì)胞懸液100:1左右；對(duì)照組：?jiǎn)渭兗訕?biāo)記的靶細(xì)胞。37℃5%CO2培養(yǎng)18小時(shí)（NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞）；每孔加終濃度為0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37℃處理30min（消化細(xì)胞和處理掉死亡靶細(xì)胞釋放出來(lái)的放射性DNA）。各孔細(xì)胞收集后依次通過(guò)生理鹽水，5%三氯乙酸和無(wú)水乙醇（獲得了存活的靶細(xì)胞的標(biāo)記DNA）。待濾膜干燥后用γ液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定cpm值。三、結(jié)果計(jì)算NK細(xì)胞活性以特異性殺傷率表示：特異性殺傷率（%）＝（1－試驗(yàn)組cpm/對(duì)照組cpm）×100%第四十五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、直接溶血空斑試驗(yàn)2、間接溶血空斑試驗(yàn)3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)第四十六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、直接溶血空斑試驗(yàn)第四十七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日2、間接溶血空斑試驗(yàn)第四十八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)第四十九頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)2、細(xì)胞殺菌功能試驗(yàn)細(xì)胞吞噬與殺傷功能試驗(yàn)第五十頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日第五十一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日吞噬百分率=吞有顆粒的吞噬細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)吞噬指數(shù)=吞噬細(xì)胞吞噬的總顆粒數(shù)計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)第五十二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日NBT還原試驗(yàn)原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲月簪基（紫黑色）第五十三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日NBT還原試驗(yàn)方法：1、抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽(yáng)性細(xì)胞7.5-15%第五十四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

第四節(jié)免疫細(xì)胞凋亡測(cè)定一、細(xì)胞凋亡的概念與原理二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第五十五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

一、細(xì)胞凋亡的概念與原理1、細(xì)胞凋亡的概念2、細(xì)胞凋亡的原理3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)第五十六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

1、細(xì)胞凋亡（apoptosis）

細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)死亡過(guò)程，也稱(chēng)程序性死亡。第五十七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過(guò)程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過(guò)程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。第五十八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

凋亡壞死機(jī)制基因調(diào)控的程序化細(xì)胞死亡，主動(dòng)進(jìn)行（自殺性）意外事故性細(xì)胞死亡，被動(dòng)進(jìn)行（他殺性）誘因生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如生長(zhǎng)因子缺乏病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如缺氧、感染、中毒死亡范圍多為散在的單個(gè)細(xì)胞多為聚集的大片細(xì)胞形態(tài)特征細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細(xì)胞自溶生化特征耗能的主動(dòng)過(guò)程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀不耗能的被動(dòng)過(guò)程，無(wú)新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀周?chē)磻?yīng)不引起周?chē)M織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生，但凋亡小體可被鄰近細(xì)胞吞噬引起周?chē)M織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生第五十九頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

2、細(xì)胞凋亡的原理凋亡信號(hào)——凋亡受體——信號(hào)傳導(dǎo)——凋亡基因啟動(dòng)——編碼程序性死亡蛋白——細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體——細(xì)胞凋亡第六十頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

細(xì)胞凋亡機(jī)制（動(dòng)畫(huà)）第六十一頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)（1）細(xì)胞皺縮（2）染色質(zhì)邊集（3）凋亡小體出現(xiàn)第六十二頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

細(xì)胞凋亡第六十三頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日

二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法1、形態(tài)觀察法：凋亡的細(xì)胞皺縮，質(zhì)膜完整，胞漿致密，細(xì)胞器密集，不同程度退變；核染色質(zhì)致密，形成形狀不一，大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜處，進(jìn)而胞核裂解；胞漿發(fā)生芽突。胞漿芽突脫落后，形成許多凋亡小體。2、生化檢測(cè)法：①胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。

②細(xì)胞內(nèi)活性氧增多。

③質(zhì)膜通透性增高。

④DNA內(nèi)切酶被激活，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp的特征性的有序片段。

⑤Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。

3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法第六十四頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日1、形態(tài)觀察法（1）普通光鏡檢測(cè)HE染色甲基綠-派諾寧染色：細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，需要有細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。而細(xì)胞壞死是一種被動(dòng)的細(xì)胞死亡過(guò)程，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根據(jù)這一特點(diǎn)，可應(yīng)用試劑甲基綠對(duì)DNA染色的特異性和派諾寧對(duì)RNA的親和性，使甲基綠對(duì)固縮細(xì)胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽(yáng)性染色者為凋亡細(xì)胞，呈陰性染色者為壞死細(xì)胞。

二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第六十五頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日甲基綠-派諾寧染色：光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞固縮：其中凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色或綠藍(lán)色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染，壞死細(xì)胞只有固縮細(xì)胞，核綠色著染，而細(xì)胞質(zhì)無(wú)染色。

第六十六頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（2）熒光顯微鏡檢測(cè)—溴化丙錠（PI）染色：

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。第六十七頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月28日（3）透射電子顯微鏡：已經(jīng)用于凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞體積變小、細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核變小、染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核邊集現(xiàn)象。晚期的凋亡細(xì)胞，清晰可見(jiàn)細(xì)胞核裂解產(chǎn)生的凋亡小體。第六十八頁(yè)，共七十五頁(yè)，2022年，8月