第九章發(fā)酵工程下游技術發(fā)展及發(fā)酵液的預處理

第九章發(fā)酵工程下游技術發(fā)展及發(fā)酵液的預處理下游技術（工程）：對于由生物界自然產(chǎn)生的或由微生物菌體發(fā)酵的、動植物細胞組織培養(yǎng)的、酶反應等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的生物原料，經(jīng)提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術。概述下游加工過程的重要性。（組成、費用和關注程度）1.組成：下游加工過程是生物技術的重要組成部分，發(fā)酵液或反應液需要經(jīng)過下游加工過程才能成為成品；2.費用：傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中下游部分的費用占整個工廠投資費用的60％，而對重組DNA生產(chǎn)蛋白質等基因工程產(chǎn)品，下游加工的費用可占整個生產(chǎn)費用的80％－90％；3.關注程度：英國政府工業(yè)部于1983年發(fā)起生物分離計劃（BIOSEP），專門研究下游加工過程；1987年英國化學工業(yè)會召開了專門討論下游加工過程的國際會議；我國也于1989年在濟南召開了一次專門會議；近十年來國內外有關生物分離或蛋白質純化的專著陸續(xù)出版。第一節(jié)發(fā)酵工程下游技術發(fā)展一、發(fā)酵產(chǎn)物的分類

從工業(yè)發(fā)酵范疇來看，從發(fā)酵液中獲得的發(fā)酵產(chǎn)物大致可分為三類：1、菌體：2、酶：3、代謝產(chǎn)物二、下游加工技術的特點1.發(fā)酵液的復雜性造成分離上的困難性。粗原料中帶入大量的不參與發(fā)酵過程的可溶性雜質和不溶性懸浮物，給下游過程的分離提取帶來了不小的困難，增加了下游操作成本，包括發(fā)酵廢液的處理成本

2.欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定。

一些新興生物技術產(chǎn)品，待處理物料中產(chǎn)品濃度很低，往往低于雜質含量，如L—異亮氨酸為2.4％，青霉素為3.6％，每千克產(chǎn)品中核黃素僅含幾克、胰島素僅含幾十毫克，而且對熱、PH、有些甚至對光不穩(wěn)定。

生物活性物質的活性還易受溫度、pH、金屬離子、無機鹽濃度、有機溶媒等環(huán)境因素的影響。制約了下游技術的可選范圍。3.多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。四、生物工業(yè)下游技術的發(fā)展歷程2.純培養(yǎng)階段古代釀造業(yè)包括釀酒、制醬（油）、醋、酸奶和干酪等。技術原始、家庭式作坊、產(chǎn)物基本不經(jīng)過后處理而直接使用，無下游技術。主要指1860－1930。發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵的本質是微生物的作用，掌握了純種培養(yǎng)技術，生物技術進入近代釀造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展階段。逐漸開發(fā)形成了發(fā)酵法生產(chǎn)酒精、丙酮、丁醇等微生物發(fā)酵工業(yè)（厭氧發(fā)酵），其產(chǎn)品相對簡單，基本上是無活性的小分子。此時開始引入過濾、蒸餾、精餾等近代分離技術。1.古代釀造業(yè)以20世紀40年代出現(xiàn)的青霉素產(chǎn)品為代表。無菌空氣制備技術、大型好氧發(fā)酵裝置開發(fā)，一大批通風發(fā)酵技術產(chǎn)品相繼投入了工業(yè)生產(chǎn)，如抗生素（鏈霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有機酸（核酸、檸檬酸）、酶制劑（淀粉酶）、微生物多糖和單細胞蛋白等。產(chǎn)品多樣性決定了分離方法的多樣性。借鑒和引進吸收了大量的近代化學工業(yè)的分離技術，如沉淀、離子交換、萃取、結晶等。3.液體深層發(fā)酵階段以20世紀70年代末崛起的DNA重組技術及細胞融合技術為代表。生物技術在其主要領域：基因工程、酶工程、細胞工程和發(fā)酵工程取得了長足進步，一批高附加值的產(chǎn)品開始面世，如乙肝疫苗、干擾素、功能因子、低聚糖、活性肽、高度不飽和脂肪酸等。生物技術在深度和廣度上都取得了很大的進展。很多企業(yè)開始加強在生物工業(yè)下游技術領域的研究開發(fā)力量，不斷推出新技術、新產(chǎn)品、新裝備，以搶占更多的市場。新技術有超臨界CO2萃取技術、膜過濾、滲透蒸發(fā)技術、各種色譜（層析）技術等。4.現(xiàn)代生物技術階段20世紀80年代以來，生物工業(yè)下游技術進步很快，出現(xiàn)了很多新概念、新技術、新產(chǎn)品和新裝備。大致可分為以下幾大類：（1）固液分離技術絮凝技術引入到發(fā)酵液的預處理上，研究開發(fā)了菌體及懸浮物絮凝技術，改善了發(fā)酵液的分離性能，加之纖維素助濾劑的開發(fā)，大大提高了發(fā)酵液的固液分離效率。在固液分離機械方面，也出現(xiàn)了一些性能優(yōu)良的新型機械，如帶式過濾機、板框過濾機、螺旋沉降式離心機等。微濾膜可高效分離細微的懸浮粒子。已開發(fā)出珠磨破碎、高壓勻漿法、X-press法和化學破碎等技術。該技術的成熟使得胞內代謝產(chǎn)物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。（2）細胞破碎技術主要開發(fā)了沉淀、離子交換、萃取、超濾等技術。較早出現(xiàn)的是酶及蛋白質的鹽析法；有機溶劑沉淀法；雙水相萃取技術比較適合于胞內活性物質和細胞碎片的分離；超濾技術解決了生物大分子對pH、熱、有機溶劑、金屬離子敏感等難題，在生物大分子的分級、濃縮、脫鹽等操作中得到了廣泛的使用。（3）初步分離純化技術小分子物質一一般可通過離子交換、脫色和結晶、重結晶等方法獲得純純度很高的產(chǎn)產(chǎn)品。生物大大分子的純化化一直是個難難題。20世紀70年代以來，逐逐漸開發(fā)出各種色譜（層層析）技術，如親和色譜譜、疏水色譜譜、聚焦色譜譜、離子交換換色譜和凝膠色譜等，后兩種技技術已開始用用于批量生產(chǎn)產(chǎn)。（4）高度分離純純化技術（5）其他新型分分離技術超臨界CO2萃取技術在獲得天然生生物物質方面面有著獨特的的優(yōu)勢。20世紀80年代以來，已已經(jīng)在許多領領域中迅速實實現(xiàn)了工業(yè)化化。如啤酒花花中有效成分分和咖啡豆中中咖啡因的萃萃取分離。介介于反滲透和和超濾之間的的納米濾技術，由于其能使使水和大部分分無機鹽通過過而截留分子子量300-1000的小分子有機機物，且操作作壓力低，在在生物工業(yè)和和水處理中具具有廣闊的應應用前景。滲透蒸發(fā)技術術、液膜技術術及反膠團技技術的研究和應用用開發(fā)等也相相繼取得了很很大的進展。。五、發(fā)酵工業(yè)業(yè)下游技術的的一般工藝過過程下游加工過程程由各種化工單單元操作組成成。由于生物產(chǎn)產(chǎn)品品種多，，性質各異，，故用到的單單元操作很多多，其中如蒸餾、萃取、、結晶、吸附附、蒸發(fā)和干干燥等屬傳統(tǒng)的單單元操作，理理論比較成熟熟，而另一些些則為新近發(fā)發(fā)展起來的單單元操作，如如細胞破碎、膜膜分離和色層層分離等，缺乏完整整的理論，介介于兩者之間間的有離子交換過程程等。1.一般工藝過程程一般說來，下下游加工過程程可分為4個階段：（1）預處理和固固液分離：目的是除去發(fā)發(fā)酵液中的菌菌體細胞和不不溶性固體雜雜質（離心和過濾）。（2）初步分離：目的是除去與與產(chǎn)物性質差差異較大的雜雜質，為后道道精制工序創(chuàng)創(chuàng)造有利條件件（萃取、吸附、、沉淀、蒸發(fā)發(fā)）（3）高度純化：去除與產(chǎn)物的的物理化學性性質比較接近近的雜質（層析、膜分離離、離子交換換、沉淀、電電泳）。（4）產(chǎn)品的最后后加工：成品形式由產(chǎn)產(chǎn)品的最終用用途決定（結晶、干燥、、蒸餾）。下游加工一般般工藝流程發(fā)酵液菌體提取、分離純化、精制產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞內產(chǎn)物離心或過濾細胞破碎離心或過濾離心或過濾干燥含產(chǎn)物的清液液離心或過濾干燥產(chǎn)物固體部分下游工藝過程程決定于產(chǎn)品品的性質和要要求達到的純純度如產(chǎn)品為菌體體本身，則工工藝比較簡單單，只需經(jīng)過過濾、得到菌菌體，再經(jīng)干干燥就可，如如單細胞蛋白白的生產(chǎn)。如可以從發(fā)酵酵液直接提取取，則可省去去固液分離步步驟。如為胞外產(chǎn)物物則可省去細細胞破碎步驟驟。2.如何著手對一一種未知的發(fā)發(fā)酵產(chǎn)品進行行提取。（1）產(chǎn)品的類型型，性質的研研究。大致確定它是是屬于哪一類類型；了解它是一種種成分還是幾幾種成分的混混合物。（2）穩(wěn)定性研究究。確定在哪一種種條件下進行行提取和精制制不受破壞，，即確定提取條件件。適合于大規(guī)模模工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)的傳統(tǒng)技術術經(jīng)過改造提提高后，適應應面更寬，效效率會更高，，仍然顯示出出強勁的生命命力。各種新型高效效的過濾機械械和離心機械械的問世，結結晶理論和離離子交換技術術的新進展，，提高了產(chǎn)品品的收率、質質量和生產(chǎn)效效率。六、生物工業(yè)業(yè)下游技術的的發(fā)展動態(tài)——成本、質量、、環(huán)保將是該技術發(fā)發(fā)展方向和動動力1.傳統(tǒng)分離技術術的提高和完完善2.新技術的研究究開發(fā)膜（膜材料和膜膜制造工藝））、樹脂（離子交換樹樹脂和大網(wǎng)格格樹脂）和凝膠（瓊脂糖凝膠膠為基質，與與各種配基結結合后制成各各種色譜分離離介質）是目目前主要的新新型分離介質質。各種分離純化化技術相互結結合、交叉、、滲透，形成成子代分離技技術。如膜技術和萃萃取、蒸餾、、蒸發(fā)技術相相結合形成了了膜萃取技術術、膜蒸餾及及滲透蒸發(fā)技技術；色譜技技術與離子交交換技術等結結合形成了離離子交換色譜譜、等電聚焦焦色譜等。（1）新型分離介介質的研究開開發(fā)（2）子代代分離離技術術（3）其他他新興興下游游技術術由溶劑劑萃取取技術術衍生生出一一大批批生物物工業(yè)業(yè)分離離技術術，如如雙水水相萃萃取、、超臨界界CO2萃取、反膠團團萃取?。毎槠コ⒓毤毎麅任镂镔|、、酶及及蛋白白質、、天然然生物物物質質的提提取分分離））；菌體絮絮凝技技術和菌體細細胞破破碎技技術的進展展為工工業(yè)化化經(jīng)濟濟的分分離菌菌體細細胞和和大規(guī)規(guī)模生生產(chǎn)胞胞內物物質創(chuàng)創(chuàng)造了了技術術前提提。第二節(jié)節(jié)發(fā)發(fā)酵酵液的的預處處理一、發(fā)發(fā)酵液液的一一般特特征1.含水量量高，一般般可達達90％-99%2.產(chǎn)品濃濃度低低3.懸浮物物顆粒粒小，密度度與液液體相相差不不大4.固體粒粒子可可壓縮縮性大大5.液體黏黏度大大6.產(chǎn)物性性質不不穩(wěn)定定二、發(fā)發(fā)酵液液預處處理的的目的的和要要求1.預處理理的目目的：：（1）改變發(fā)發(fā)酵液液的物物理性性質，促進進懸浮浮液中中分離離固形形物的的速度度，提提高固固液分分離的的效率率（2）盡可能能使產(chǎn)產(chǎn)物轉轉入便便于后后處理理的某某一相相中（多數(shù)數(shù)是液液體））（3）去除發(fā)發(fā)酵液液中部部分雜雜質，以利利于后后續(xù)各各步操操作。。2.發(fā)酵液液預處處理的的要求求:（1）菌體的的分離離（2）固體懸懸浮物物的去去除（3）蛋白質質的去去除（4）重金屬屬離子子的去去除（5）色素、、熱原原質、、毒性性物質質等有有機雜雜質的的去除除（6）改變發(fā)發(fā)酵液液的性性質（7）調節(jié)適適宜pH值和溫溫度三、預預處理理的方方法（一））加熱熱法（二））調節(jié)節(jié)懸浮浮液的的pH（三））發(fā)酵酵液的的凝聚聚和絮絮凝（四））高價價無機機離子子的去去除方方法（五））雜蛋蛋白質質的去去除（一））加熱熱法：：降低懸懸浮液液的黏黏度，，除去去某些些雜蛋蛋白，，降低低懸浮浮物的的最終終體積積，破破壞凝凝膠狀狀結構構、增增加濾濾餅的的空隙隙度。。（不不適用用熱敏敏性的的物質質）（二））調節(jié)節(jié)懸浮浮液的的pH通過調節(jié)發(fā)發(fā)酵液液pH到蛋白白質的的等電電點使使蛋白白質沉沉淀，同時絡絡合重重金屬屬離子子；常用的的酸化化劑有有草酸、、鹽酸酸、硫硫酸和和磷酸酸（三））發(fā)酵酵液的的凝聚聚和絮絮凝機理電解質質將膠膠體粒粒子表表面上上的電電荷中中和，，減少少存在在于膠膠體粒粒子間間的靜靜電斥斥力，，使范范德華華力占占優(yōu)勢勢，這這樣膠膠體就就會凝凝聚成成較大大、較較密實實的粒粒子（（凝聚），或或在某某些高高分子子絮凝凝劑存存在下下，基基于架橋作作用，使膠膠粒形形成粗粗大的的絮凝凝團使使之更更容易易過濾濾（絮凝）。常用的的凝聚聚方法法在稀溶溶液中中加入入電解解質以以促進進凝聚聚。試試劑包包括酸酸、堿堿、簡簡單電電解質質和合合成的的高分分子電電解質質。常用的的絮凝凝劑聚丙烯烯酰胺胺、聚聚乙烯烯亞胺胺、聚聚胺衍衍生物物、氯氯化鈣鈣、磷磷酸氫氫二鈉鈉影響絮絮凝的的因素素絮凝劑劑的添添加量量發(fā)酵液液的pH絮凝劑劑的分分子量量攪拌轉轉速攪拌時時間絮凝劑劑添加加量對對絮凝凝效果果(濾速)的影響響料液中中，絮凝劑劑濃度度增加加有助助于架架橋充充分，但是是過多多的加加量反反而會會引起起吸附附飽和和，在在每個個膠粒粒上形形成覆覆蓋層層而使發(fā)酵液液pH對絮凝凝效果果的影影響溶液pH的變化化常會會影響響離子子型絮絮凝劑劑中官官能團團的電電離度度，從從而影影響分分子鏈鏈的伸伸展形形態(tài)。。電離度度增大大，由于于鏈節(jié)節(jié)上相相鄰離離子基基團間間的電電排斥斥作用用，而而使分分子鏈鏈從卷卷曲狀狀態(tài)變變?yōu)樯焐煺範顮顟B(tài)，，所以以架橋能能力提提高。絮凝技技術預預處理理發(fā)酵酵液的的優(yōu)點不僅在在于過濾速速度的的提高高，還在在于能能有效效地去除雜雜蛋白白質和和固體體雜質質，如菌菌體、、細胞胞和細細胞碎碎片等等，提提高了了濾液液質量量（四））高價價無機機離子子的去去除方方法鈣離子子，可用用草酸酸。鎂離子子，可用用三聚聚磷酸酸鈉它它和鎂鎂離子子形成成可溶溶性絡絡合物物，用用磷酸酸鹽處處理，，也能能大大大降低低鈣離離子和和鎂離離子的的濃度度。此此法可可用于于環(huán)絲絲氨酸酸的提提取。。鐵離子子，可加加入黃黃血鹽鹽，使使形成成普魯魯士藍藍沉淀淀。（五））雜蛋蛋白質質的去去除方方法熱變性性沉淀大幅度度改變變pH四、發(fā)發(fā)酵液液的過過濾微生物物發(fā)酵酵液中中含有有大量量菌體體、細細胞或或細胞胞碎片片以及及殘余余的固固體培培養(yǎng)基基成分分。過濾就就是將將懸浮浮在發(fā)發(fā)酵液液中的的固體體顆粒粒與液液體進進行分分離的的過程程。在過濾濾操作作中，，要求求濾速速快，，濾液液澄清清并且且有高高的收收率。。（一））影響響過濾濾速度度的因因素過濾速速度和和以下下因素素有關關菌種。。發(fā)酵條條件。。培養(yǎng)基基的組組成未用完完培養(yǎng)養(yǎng)基的的數(shù)量量消泡劑劑發(fā)酵周周期菌種對對過濾濾速度度影響響真菌的菌絲絲比較較粗大大，如如青霉霉菌的的菌絲絲直徑徑可達達10μμm，發(fā)酵液液容易易過濾濾，不需需特殊殊處理理。其其濾渣渣呈緊緊密餅餅狀物物，很很容易易從濾濾布上上刮下下來，，故可可采用用鼓式式真空空過濾濾機過過濾。。放線菌菌發(fā)酵液液菌絲絲細而而分枝枝，交交織成成網(wǎng)絡絡狀。。如鏈鏈霉素素發(fā)酵酵液菌菌絲僅僅0.5~1.0μm左右，，還含含有很很多多多糖類類物質質，粘粘性強強，過濾較較困難難，一般需需經(jīng)預預處理理，以以凝固固蛋白白質等等膠體體。細菌發(fā)酵液液的菌菌體更更細小小，因因此，，過濾十十分因因準，如不不用絮絮凝等等方法法預處處理發(fā)發(fā)酵液液，往往往難難以采采用常常規(guī)過過濾的的設備備來完完成過過濾操操作。。發(fā)酵條條件對對過濾濾速度度影響響用黃豆豆粉、、花生生粉作作氮源源、淀淀粉作作碳源源會使使過濾濾困難難；發(fā)酵后后期加加消泡劑劑或剩余余大量末末用完完的培培養(yǎng)基基也會使使過濾濾困難難。發(fā)酵周周期對對過濾濾的影影響正確選擇擇發(fā)酵終終了時間間對過濾濾影響很很大。在菌體絲絲自溶前前必須放放罐，因因為細胞胞自溶后后的分分解產(chǎn)物物一般很很難過濾濾。有時延延長發(fā)酵酵周期雖雖能使發(fā)發(fā)酵單位位有所提提高，但但嚴重影影響發(fā)酵酵液質量量，使色色素和膠膠狀雜質質增多、、過濾困困難，最最終造成成成品質質量降低低。（二）改改善過濾濾性能的的方法等電點蛋白質變變性吸附凝聚和絮絮凝加入助濾濾劑直接在發(fā)發(fā)酵液中中形成填填充-凝固劑酶解作用用助濾劑助濾劑是是一種不不可壓縮縮的多孔孔微粒，，它能使使濾餅疏疏松，濾濾速增大大。能形成一一層不可可壓縮的的濾層，，截留了了懸浮雜雜質，隔離了細細小、易易壓縮雜雜質與過過濾介質質接觸，，以形成成疏松濾濾餅。常用的助助濾劑硅藻土、珍珠巖巖、磨碎碎的木漿漿、淀粉粉助濾劑的的加入有有兩種方法法：在濾布上上預先鋪鋪一層助助濾劑(1~2mm)，該方法法，會使使濾速降降低，但但濾液透透明度高高直接加入入發(fā)酵液液中。助濾劑種種類、用用量要恰恰當，是取得得良好過過濾效果果的關鍵鍵。助濾劑的的用量，，有一條條經(jīng)驗規(guī)規(guī)則可供供參考，，即助濾濾劑用量量若等于于懸浮液液中固體體含量時時，濾速速最快。。填充-凝固劑改善過濾濾性能較較好的方方法是加加入一些些反應劑劑，它們們能相互互作用，，或和某某些溶解解性鹽類類發(fā)生反反應生成成不溶解解的沉淀淀(CaSO4，AlPO4等)。生成的沉沉淀能防防止菌絲絲體粘結結，沉淀淀本身即即可作為為助濾劑劑，并且且還能使使膠狀物物和懸浮浮物凝固固，如新生霉素素發(fā)酵液中中加入氯氯化鈣和和磷酸鈉鈉，生成成的磷酸鈣可作為填填充-凝固劑。。一方面面作為助助濾劑，，另一方方面還可可使某些些蛋白質質凝固。。又如環(huán)絲氨酸酸發(fā)酵液用用氧化鈣鈣和磷酸酸處理，，生成的的磷酸鈣沉淀，能能使懸浮浮物凝固固。多余余的磷酸酸根離子子，還能能除去鈣