醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文

色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表達(dá)及其對膀胱癌治療作用的研究一、趨勢判斷和需求分析國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢（含知識產(chǎn)權(quán)狀況和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)狀況）；經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會發(fā)展需求；科學(xué)技術(shù)價值、特色和創(chuàng)新點(diǎn)。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率占全身腫瘤的第8位，在男性其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率9.9/10萬；在女性，其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率為2.3/10萬，占第25位。死亡率在男性為4.2/10萬，占全身腫瘤死亡率的第9位，在女性為1.1/10萬，占第16位。在我國,膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的3.2%，1995年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為7/10萬人，上海市城區(qū)發(fā)病率為8.6/10萬人［1］，且今后發(fā)病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究始終是臨床基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措施,但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá)80%，其中大約16%-25%復(fù)發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有10%發(fā)展為浸潤性或轉(zhuǎn)移性癌，因此,尋找一種新的、更有效的生物治療方法，是當(dāng)前臨床迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中，無論是化療還是免疫治療，主要機(jī)制是通過直接殺死腫瘤細(xì)胞、阻斷腫瘤細(xì)胞分裂或誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實(shí)體性腫瘤生長，腫瘤細(xì)胞的增殖固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下，人體內(nèi)的脈管系統(tǒng)在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡(luò)式的相互作用下處于平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是發(fā)生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當(dāng)腫瘤生長達(dá)到腫瘤組織超過2mm時就會有新生血管形成，如果沒有新生血管生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止［2，3］?？寡苌莎煼ㄊ遣煌谀壳俺Ｒ?guī)療法的新的腫瘤治療策略，具有高效低毒和不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)［4］。有關(guān)血管生長因子和血管生長抑制因子在腫瘤中所起作用，以及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤研究的一個熱點(diǎn)。近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子（pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF）是一種對腫瘤有抑制作用的細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子是Tombran-Tink等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為50KD［5］,屬于serpin卵白蛋白冷人「2亞群，其基因全長16kb,位于染色體17P13.1-pter［6］。多項(xiàng)研究表明，PEDF是一種天然的高效的新生血管抑制劑［7］,并通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化起到抑制腫瘤生長的作用。Tombran-Tink等將PEDF基因定位于染色體17P13.1，腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關(guān)系密切，提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關(guān)基因［5］。對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行編碼PEDF的腺病毒轉(zhuǎn)染，在血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）存在的情況下，PEDF明顯阻止了血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成和遷移。對患有CNV/AMD患者的體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，PEDF大量減少的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞有明顯遷移;而對照組含有正常水平PEDF,則抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［6］。Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中是腫瘤細(xì)胞分化調(diào)控的主要的抗血管生成的抑制劑［7］。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)展中，PEDF作為VEGF的拮抗因子，起到了抑制作用。對裸小鼠的在體實(shí)驗(yàn)以及鼠的肺癌模型也同樣證明了PEDF對腫瘤的抑制作用。其機(jī)制乃因PEDF減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長,在腫瘤的治療前景上非常樂觀［8］。我們最近對PEDF在膀胱癌中表達(dá)情況的初步研究發(fā)現(xiàn)，PEDF在膀胱癌組織中表達(dá)明顯低于正常膀胱組織，而且PEDF表達(dá)情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負(fù)相關(guān)，提示PEDF在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用，PEDF的正常表達(dá)可能抑制膀胱癌細(xì)胞的生長、增殖，PEDF有可能成為膀胱癌生物學(xué)治療的一種有效的新方法。目前國內(nèi)、外尚未見此項(xiàng)研究的相關(guān)報(bào)道。因此我們設(shè)想，擴(kuò)大樣本量，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究PEDF在膀胱癌中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料分析PEDF表達(dá)與膀胱癌分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系；通過研究膀胱癌組織中PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，PEDF與血小板反應(yīng)素-1表達(dá)的相關(guān)性，探討膀癌組織中PEDF表達(dá)與腫瘤血管形成的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制；通過研究PEDF表達(dá)與金屬蛋白酶-9（MMP-9）的相關(guān)性，探討PEDF表達(dá)與膀胱癌浸潤的相關(guān)性；通過研究PEDF表達(dá)與已知的對腫瘤生長有明確調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子a（TNF-a）、白細(xì)胞介素1a（IL-1a）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin）和白介素8（IL-8）等細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性，探討PEDF表達(dá)對膀癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，從而探討PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機(jī)制；在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進(jìn)一步探討PEDF表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用以及對膀胱癌的治療效果,為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種有效的新方法。參考文獻(xiàn)[2]吳階平，吳階平泌尿外科學(xué)，山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004.5：898-917二、研究內(nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵研究的總體目標(biāo)：研究PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機(jī)制。研究PEDF對膀胱癌細(xì)胞的治療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法研究的創(chuàng)新點(diǎn)：本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的其他研究，應(yīng)用分子生物學(xué)方法從研究PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系入手，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，探討PEDF對膀胱癌的治療作用。目前，本項(xiàng)研究國內(nèi)、外尚未見報(bào)道。本研究的順利完成，將為膀胱癌的生物學(xué)行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種新的有效方法。研究的主要內(nèi)容：膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF表達(dá)狀況，并檢測VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-a、IL-1a、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)和IL-8的表達(dá)狀況；采用免疫組化技術(shù)檢測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度(microvasculardensity，MVD)，分析PEDF與VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-a、IL-1a、血栓調(diào)節(jié)蛋白和IL-8表達(dá)的相關(guān)性，PEDF與MVD的相關(guān)性；并結(jié)合臨床資料分析研究PEDF表達(dá)與膀胱癌患者5年生存率之間的關(guān)系；闡明PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制。PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療：以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株作為對照，觀察檢測VEGF、TNF-a的表達(dá)情況及膀胱癌細(xì)胞的凋亡、增殖情況。PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。PEDF與TSP-1表達(dá)的相關(guān)性PEDF與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性PEDF與TNFa、IL-1a、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度的相關(guān)性。PEDF與組織MVD相關(guān)性。PEDF與膀胱癌分期的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌惡性程度（分級）的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關(guān)性。方法（2）PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療：以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞作為對照，檢測VEGF、TNF-a濃度，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡情況，分析相關(guān)性。.以RT-PCR法擴(kuò)增PEDF基因。.將擴(kuò)增后的PEDF基因連接入腺病毒載體，轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞。并以空載轉(zhuǎn)染為對照。.Westernblot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9表達(dá)。④．觀察膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡情況。⑤．統(tǒng)計(jì)分析。方法（3）PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi)作為治療組，以未注射PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織MVD、VEGF表達(dá)情況、腫瘤增殖情況，評價PEDF對膀胱癌的治療效果。①．以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型。.將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。.應(yīng)用免疫組化方法檢測MVD；應(yīng)用Westernblot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9；觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與VEGF的相互作用關(guān)系及其對腫瘤生長的作用機(jī)制。技術(shù)路線：（1）膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究：膀胱癌標(biāo)本120例癌旁膀胱組織標(biāo)

本120例正常膀胱組織標(biāo)

本120膀胱癌標(biāo)本120例癌旁膀胱組織標(biāo)

本120例正常膀胱組織標(biāo)

本120例炎性膀胱組織標(biāo)

本120例RT-PCR檢測PEDFmRNA表達(dá)Westernblot

法檢測VEGF、

TSP-1、MMP-9ELISA法檢測TNF

a、IL-1a、血栓調(diào)

節(jié)蛋白、IL-8濃度免疫組化方法檢測

標(biāo)本微血管密度

(MVD)結(jié)合臨床資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療:將PEDF轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，檢測VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-a濃度，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡RTPCR法擴(kuò)增PEDF基因情況。結(jié)果分析情況。PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療:觀察PEDF與VEGF、MVD相關(guān)性及其對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型未注射（對照）注射PEDF蛋白未注射（對照）注射PEDF蛋白觀察微血

管密度

（MVD）觀察微血

管密度

（MVD）腫瘤凋亡、增

殖、侵襲情況VEGF、TSP-1、MMP-9定量測定結(jié)果分析先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎(chǔ)研究（包括分子生物學(xué)研究）和臨床研究，如：裸鼠膀胱癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系、VEGF表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究的技術(shù)方法，如RT-PCR、southern、northern雜交、DNA測序、擁有獨(dú)立的泌尿外科免疫、病理、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備完善，技術(shù)方法先進(jìn)，擁有PCR-擴(kuò)增儀、酶標(biāo)儀、各種電泳槽、凝膠成像設(shè)備、細(xì)胞房及各種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)設(shè)備等,為本課題的順利進(jìn)行提供了有力的技術(shù)和儀器設(shè)備保證。細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒載體構(gòu)建等技術(shù)，積累了較豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織中PDEF表達(dá)的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱癌組織中PDEF表達(dá)的檢測方法，對本課題的順利進(jìn)行提供了便利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正常膀胱組織PEDF表達(dá)情況的對照性研究，初步結(jié)果顯示如下：（1）定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見：PEDF在正常膀胱組織中高表達(dá)，而在膀胱癌組織中表達(dá)明顯降低（見圖1）。(2)

2MPEDFIOC250GAPDH注：2MPEDFIOC250GAPDHN1,N2,N3：正常膀胱組織T1,T2,T3：膀胱癌組織GAPDH：內(nèi)參照M：為標(biāo)記分子量圖1：正常膀胱組織與膀胱癌組織PEDF定量PCR(2)在膀胱癌組織中PEDF低表達(dá)與微血管增殖相關(guān)(見圖2)o預(yù)期成果：(1)明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達(dá)情況以及其與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。PEDF對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨床應(yīng)用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。成果以論文的形式表達(dá)，并申請“PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術(shù)”的專利；擬發(fā)表論著5—7篇,其中國內(nèi)權(quán)威雜志4—5篇，SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒定。本課題實(shí)施過程中，形成一整套細(xì)胞因子檢測方法、膀胱癌細(xì)胞株培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞技術(shù)、裸鼠膀胱癌模型的建立及PEDF治療裸鼠膀胱癌模型等方法，將為復(fù)旦大學(xué)泌尿外科研究所的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供新的研究條件和技術(shù)，并為以后此類研究的開展奠定扎實(shí)基礎(chǔ)。本課題研究過程中，擬培養(yǎng)碩士研究生2名，博士研究生2名，技術(shù)員一名。六、預(yù)期效果和風(fēng)險(xiǎn)分析課題成果對社會發(fā)展所起的作用；經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)業(yè)化前景(預(yù)計(jì)年產(chǎn)值、年利潤、年節(jié)匯、年創(chuàng)匯、年節(jié)能等)；對環(huán)境影響程度及資源綜合利用情況;可能的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)；可能的市場風(fēng)險(xiǎn)。本課題通過對對膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF表達(dá)和相關(guān)細(xì)胞因子的檢測，探討PEDF表達(dá)對膀癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，從而探討PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機(jī)制；在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以PEDF蛋