動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)制備藥用蛋白

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)制備藥用蛋白第一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日本章主要內(nèi)容1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念、歷史2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件4.體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖過程5.細(xì)胞株與保存6.動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)7.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)8.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器9.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)影響因素10.動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白第二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日§11-1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概念與歷史1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（Animalcellculture）：是模擬體內(nèi)生理環(huán)境使動(dòng)物細(xì)胞在體外增殖、生存的一種技術(shù)。包括：原代培養(yǎng)：動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行首次傳代前的培養(yǎng)過程。傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。2、歷史：1907年,哈里森（Harrison）采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周時(shí)間，并觀察到細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過程，開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。法國(guó)學(xué)者卡雷爾（C（Carrell）設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶1923年用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織取得成功，極大推動(dòng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立。1951年，厄爾利（Earle）等人開發(fā)了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。伴隨著培養(yǎng)工具與培養(yǎng)基的不斷完善，動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)日益成熟。第三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日§11-2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)1、動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，比微生物細(xì)胞大2、動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢3、培養(yǎng)過程需氧量少，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感。4、動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在。5、原代細(xì)胞培養(yǎng)繁殖50代左右即退化死亡。6、對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求更加苛刻，除常規(guī)營(yíng)養(yǎng)外還需血清等。7、對(duì)培養(yǎng)條件或環(huán)境極其敏感。8、容易受污染。9、大多需要貼附在固體或半固體表面才能生長(zhǎng)。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)第四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日體外生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般具有貼附性、細(xì)胞接觸抑制性、密度抑制性的特點(diǎn)。懸浮型細(xì)胞：與微生物、植物細(xì)胞不同，動(dòng)物細(xì)胞中只有極少數(shù)細(xì)胞體外生長(zhǎng)可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)密度高、效率高。血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。P981、類型：貼附型細(xì)胞：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞必須附著在固體或半固體表面才能生長(zhǎng)，另外也包括細(xì)胞間相互接觸。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類型與形態(tài)第五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日接觸抑制性(Contactinhibition)是指由于動(dòng)物細(xì)胞相互接觸而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的現(xiàn)象（圖）。由于這個(gè)特性，正常細(xì)胞并不會(huì)相互重疊，而是呈單層細(xì)胞生長(zhǎng)。密度抑制(Densityinhibition)細(xì)胞接觸匯合成片后，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂。但是當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，營(yíng)養(yǎng)相對(duì)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，發(fā)生密度抑制生長(zhǎng)現(xiàn)象。第六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）成纖維型細(xì)胞外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形，中央有圓形核，胞質(zhì)向外伸出2－3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。除成纖維細(xì)胞外，心肌、成骨肌細(xì)胞等起源于中胚層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)均屬這一類型。2、貼附型細(xì)胞四種形態(tài)第七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）上皮型細(xì)胞類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞，特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長(zhǎng)時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀”。包括：皮膚的表皮細(xì)胞、消化管與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等起源于內(nèi)或外胚層細(xì)胞。第八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）游走型細(xì)胞細(xì)胞呈分散生長(zhǎng)，一般不連接成片，胞質(zhì)常伸出偽足和突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則，在器皿上生長(zhǎng)位置不固定。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，外形不斷變化，密度大時(shí)難以和成纖維、上皮細(xì)胞相區(qū)別。包括單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)：白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。第九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）多形型細(xì)胞

多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，包括細(xì)長(zhǎng)型胞突和多角形胞體。多形型細(xì)胞不常見，體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見的是神經(jīng)原和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)際上，體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)常受培養(yǎng)條件影響，呈現(xiàn)過渡形態(tài)。第十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1、培養(yǎng)工具多為玻璃或無毒塑料制成的：培養(yǎng)瓶的形狀主要是適合細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和顯微鏡觀察的扁平形狀。培養(yǎng)皿培養(yǎng)管儀器包括：CO2培養(yǎng)箱、相差顯微鏡等。目前大多采用微載體(多孔塑料培養(yǎng)板)作為介質(zhì)培養(yǎng)貼附型細(xì)胞生長(zhǎng)，類似懸浮培養(yǎng)效果?！?1-3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件另外，同微生物、植物細(xì)胞培養(yǎng)不同，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與其他溶液不能經(jīng)受高溫滅菌，多采用40nm過濾除菌（例如支原體污染。第十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2、培養(yǎng)條件溫度：人類和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜溫度為37℃。細(xì)胞對(duì)低溫耐受性更強(qiáng)，40℃高溫?cái)?shù)小時(shí)可使細(xì)胞死亡。pH：哺乳動(dòng)物細(xì)胞為7.2~7.4，耐酸不耐堿。滲透壓：細(xì)胞在高滲透壓或低滲透壓溶液中會(huì)發(fā)生皺縮或腫脹，甚至破裂。BSS溶液。氣體：細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝離不開O2和CO2

。二氧化碳培養(yǎng)箱供應(yīng)CO2

，還可調(diào)節(jié)pH值。第十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日3、動(dòng)物培養(yǎng)基對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求非?？量?，包括必需氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔酶、激素、生長(zhǎng)因子、血清等。分為：天然、合成、無血清培養(yǎng)基三種。第十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）天然培養(yǎng)基常用動(dòng)物血清（胎牛血清、小牛血清）、組織提取液、雞胚胎汁等。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高血清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過血凝或去纖維蛋白法)的血漿。第十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日血清的生物功能1.提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的物質(zhì)。2.提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。3.提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。第十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日4.對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：提供促接觸和伸展因子，使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。血清蛋白形成的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞攪拌時(shí)免受機(jī)械損傷。血清中含有抗蛋白酶成分，可以使用血清來終止內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞釋放胰蛋白酶的消化作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如硒等。第十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）合成培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：成分已知，便于對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行控制。缺點(diǎn)：無法替代天然培養(yǎng)基中一些未知成分解決途徑——合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ)目前常用的合成培養(yǎng)基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等，具體配方參見本章附錄（P123）第十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日例如MEM培養(yǎng)基：厄爾利（Earle）于1951年開發(fā)成功。含有少量氨基酸、維生素、谷氨酰胺以及必須的無機(jī)鹽，組成簡(jiǎn)單。DMEM培養(yǎng)基：由杜爾貝科（Dulbecco）等在MEM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上研制而成，增加了各已有成分的含量，同時(shí)又根據(jù)葡萄糖高低分為高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型適合生長(zhǎng)較快、貼附性差的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）培養(yǎng)。第十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）無血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的利于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)：（1）動(dòng)物血清來源有限，價(jià)格高，不宜大量使用.（2）動(dòng)物血清成分復(fù)雜且成分不穩(wěn)定，使生長(zhǎng)過程不易檢測(cè)控制。（3）雖然血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有效，但會(huì)對(duì)后期培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測(cè)造成一定困難。第十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基(Serumfreemedium,SFM)是不含血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加已知組分組成。試圖全部替代血清成分?；A(chǔ)培養(yǎng)基較常用的是DMEM、F12培養(yǎng)基。添加組分主要包括：生長(zhǎng)因子、激素（胰島素、胰高血糖素等）、結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、酶抑制劑等。第二十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液（1）平衡鹽溶液（Balancedsaltsolution，BSS

）主要由生理鹽水和葡萄糖組成，具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。例如：Hanks液、Earle液（緩沖能力強(qiáng)）注：酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。第二十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）培養(yǎng)基pH調(diào)整液動(dòng)物細(xì)胞對(duì)酸堿度要求十分嚴(yán)格，大部分合成培養(yǎng)液都呈微酸性，若滅菌前調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)值，滅菌后又會(huì)降低，因此pH調(diào)整液應(yīng)單獨(dú)配制和滅菌，在培養(yǎng)液滅菌后再加入調(diào)整pH值最好。常用pH調(diào)整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。注：HEPES（4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液，其在pH7.2-7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力：第二十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）細(xì)胞消化液使用目的：培養(yǎng)前讓組織塊消化解離成分散細(xì)胞，或傳代培養(yǎng)時(shí)使細(xì)胞脫離器皿表面并分散解離。胰蛋白酶溶液：水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞分散，使用濃度0.125或0.25%，用無Ca2+、Mg2+的Hanks或PBS緩沖液配制，pH值，2-10分鐘消化完后加血清終止反應(yīng)。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）消化液：非酶性解離細(xì)胞，毒性小、經(jīng)濟(jì)、操作方便，使用濃度0.02%。注：若將兩者結(jié)合使用，解離效果更好：

EDTA：胰蛋白酶體積比=1：1或2：1第二十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）抗生素溶液作用：防止微生物污染。常用抗生素有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用：培養(yǎng)基內(nèi)最終使用濃度為青霉素100U/ml、鏈霉素100微克/ml（雙抗）。第二十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般過程一般經(jīng)過：組織獲得與消化、接種、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)幾個(gè)環(huán)節(jié)11-4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)和增殖過程★原代培養(yǎng)期★傳代期★衰退期第二十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)D11-8動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程生長(zhǎng)曲線第二十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（Primaryculture）：從體內(nèi)取出組織接種直接長(zhǎng)出單層細(xì)胞到第一次傳代培養(yǎng)前的階段（一般持續(xù)1-4周）。特點(diǎn)：在這個(gè)階段，細(xì)胞有分裂但不旺盛，細(xì)胞多呈二倍體核型。這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)的形態(tài)學(xué)特征，是藥物測(cè)試、研究細(xì)胞分化等很好的實(shí)驗(yàn)材料。第二十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.1組織塊原代培養(yǎng)法

是比較常用早期簡(jiǎn)易的原代培養(yǎng)方法：（2）接種與培養(yǎng)：用吸管吸出組織塊，放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每小塊間隔0.5厘米，使其均勻貼在培養(yǎng)瓶的壁上（可涂血清）。然后將貼有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液，塞上瓶塞，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)使培養(yǎng)液覆蓋組織塊，傾斜置于37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。（3）生長(zhǎng)周期：一般情況下，組織塊貼壁后24小時(shí)細(xì)胞就從組織塊四周長(zhǎng)出，24小時(shí)后可再補(bǔ)充培養(yǎng)液，3-5天即可形成單層細(xì)胞再更換培養(yǎng)液即首次傳代培養(yǎng)，若5-7天組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落。（1）組織塊的分離：將組織塊剪碎成1mm3大小，加Hanks緩沖液，用吸管吸打，離心，收集沉淀即為組織塊。也可用注射器擠壓，或用網(wǎng)篩分離得到細(xì)小的組織塊。第二十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.2組織消化原代培養(yǎng)法（1）取材與消化—酶解法制備單細(xì)胞根據(jù)不同的組織對(duì)象采用適當(dāng)?shù)拿赶韩@得動(dòng)物細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)。最常用的有胰蛋白酶和膠原酶，此外鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動(dòng)物細(xì)胞的消化。消化傳代細(xì)胞常用EDTA與胰蛋白酶一起使用。?胰蛋白酶法適用消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等?膠原酶解：適用于結(jié)締、上皮、癌組織等，使膠原酶最終濃度為200u/ml，36.5℃，靜置4—48小時(shí)，上面懸液經(jīng)離心獲得或纖維細(xì)胞沉淀，沉淀重置于生理鹽水，去掉未解向組織塊后沉淀得到上皮樣細(xì)胞。第二十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日組織消化原代培養(yǎng)示意圖第三十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1.檢查細(xì)胞形態(tài)及活力：倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中原代細(xì)胞，生長(zhǎng)良好者輪廓不清晰，較透明；生長(zhǎng)不良者反而輪廓清晰，形態(tài)不規(guī)則，胞內(nèi)有空泡、顆粒等。四唑氮藍(lán)法(MTT)法可以檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲暨（Formazan)并沉淀在細(xì)胞中。2.培養(yǎng)液pH及污染檢查：含血清的新鮮培養(yǎng)液呈桃紅色，pH在7.2～7.4之間。CO2的積累使培養(yǎng)液pH下降，當(dāng)超出緩沖范圍時(shí)，培養(yǎng)液變黃，需要3～4天更換一次培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱能自動(dòng)控制5%的CO2含量。細(xì)菌污染時(shí)培養(yǎng)液變渾濁；支原體易透過濾器，污染不易被發(fā)現(xiàn)。（2）原代培養(yǎng)期檢查第三十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日倒置顯微鏡：組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。第三十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日3、動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（Passageculture/Subculturing）是指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程，一般可傳代50代左右。傳代培養(yǎng)期間的細(xì)胞稱為細(xì)胞系。注意：每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱為傳一代，即從細(xì)胞接種培養(yǎng)到分離再培養(yǎng)期間的一段時(shí)間。在細(xì)胞的一代中，細(xì)胞約能倍增3～6次。第三十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日傳代培養(yǎng)方法懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用加入新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代，或者采用自然沉降法加入新鮮培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。貼壁生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展成片后需要進(jìn)行細(xì)胞分離重新接種培養(yǎng)。一般采用酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。視頻：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù):第三十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日酶消化傳代過程1、吸出或者倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液。2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。3、2～5分鐘后檢查，有細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象時(shí)添加培養(yǎng)液終止消化。4、吸出消化液，加入Hanks液輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗去殘留消化液。5、加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液。6、計(jì)數(shù)，接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第三十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)第三十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日11-5細(xì)胞株與保存1.細(xì)胞系(Cellline)是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細(xì)胞為主的、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體。第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞即稱之為細(xì)胞系。不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細(xì)胞系(Finitecellline)，能連續(xù)培養(yǎng)下去的為連續(xù)細(xì)胞系(Infinitecellline)。2.細(xì)胞株(Cellstrain)是指從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。細(xì)胞株的建立需要從細(xì)胞系群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外繁殖成為新細(xì)胞群體。第三十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日3動(dòng)物細(xì)胞株類型包括：原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞有限細(xì)胞系、無限細(xì)胞系（不具有接觸抑制現(xiàn)象；理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞）二倍體細(xì)胞、異倍體細(xì)胞融合細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、基因工程細(xì)胞第三十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）原代細(xì)胞常用有：雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎組織細(xì)胞生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)滅活疫苗，開創(chuàng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行生物制藥的先河。缺點(diǎn)：具有需要大量動(dòng)物組織、成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等。藥物篩選、藥理研究。第三十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）二倍體傳代細(xì)胞二倍體細(xì)胞具有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：二倍體染色體、具有貼壁和接觸抑制特性、無致瘤性。有限細(xì)胞系（傳代次數(shù)一般都不超過50代）。WI-38：1961年Wister38研究所從女性高加索人的正常胚肺組織中獲得的一株人2倍體細(xì)胞系WI-38。培增時(shí)間24h；貼壁生長(zhǎng)；第一批獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)的二倍體細(xì)胞有對(duì)病毒敏感，第一個(gè)用于疫苗（脊髓灰質(zhì)滅活疫苗）生產(chǎn)。MRC-5：二倍體，成纖維，生長(zhǎng)比WI-38快。第四十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）融合細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞：脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞。用于抗體藥物生產(chǎn)。將藥用蛋白基因轉(zhuǎn)化入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，用于大量生產(chǎn)藥物。（4）基因工程細(xì)胞第四十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（5）轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞發(fā)生遺傳改變而產(chǎn)生永生化，即由限定性細(xì)胞系轉(zhuǎn)化為連續(xù)性細(xì)胞系，可以在體外進(jìn)行無限傳代和生長(zhǎng)繁殖。不同于癌細(xì)胞，沒有致瘤性。倍增時(shí)間短，對(duì)培養(yǎng)條件與生長(zhǎng)因子要求低。由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞常常由于染色體斷裂而變成異倍體，失去正常細(xì)胞的特點(diǎn)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞于20世紀(jì)80年代獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)。第四十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化方法1.細(xì)胞自轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的細(xì)胞自發(fā)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在許多正常二倍體長(zhǎng)期傳代過程中出現(xiàn)?？赡艿囊蛩匕ǎ貉遒|(zhì)量、溫度或pH不穩(wěn)定、病毒污染等。2.人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化采用誘導(dǎo)劑使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。凡是可以改變DNA結(jié)構(gòu)的因素都可以稱為誘導(dǎo)劑，包括化學(xué)、物理和病毒誘導(dǎo)劑。第四十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日CHO細(xì)胞(Chinesehamsterovarycell)：從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢分離的細(xì)胞，亞二倍體，有多種突變株。貼壁生長(zhǎng)，也可以懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能力。CHO細(xì)胞能表達(dá)糖基化蛋白藥物：組織纖維蛋白溶酶原激活劑(Tissueplasminogenactivator，tPA)、促紅細(xì)胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（HepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg）、粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocytecolonystimulatingfactor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。比二倍體減少1條(2n-1)或幾條染色體的細(xì)胞稱亞二倍體第四十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日Vero細(xì)胞（Verocell）:是1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細(xì)胞。成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞之一。第四十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日BHK-21細(xì)胞（Babyhamsterkidneycell）：是1961年英國(guó)從幼地鼠的腎臟分離的細(xì)胞。成纖維樣，異倍體。常用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白(例如重組凝血因子VIII)。第四十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）先酶消化分散成單個(gè)細(xì)胞，用冷凍保護(hù)液（含10%血清的培養(yǎng)液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷卻，同時(shí)將細(xì)胞稀釋成2~5*106個(gè)/ml。（2）分裝：1ml/安瓶（3）冷凍機(jī)內(nèi)冷凍至-25℃（4）液氮罐長(zhǎng)期冷凍保存。（5）細(xì)胞復(fù)蘇：37℃水浴快速融化4動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存第四十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1、懸滴培養(yǎng)?是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)，是組織和器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法。?將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開，將待培養(yǎng)的組織或器官植塊放于鋪展開的培養(yǎng)液中央部位，然后將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封后進(jìn)行培養(yǎng)。11-6動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)2、灌注小室培養(yǎng)是在懸滴法基礎(chǔ)上的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)液的循環(huán)供應(yīng)與流出。第四十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日3培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)成功卡氏瓶，可以保證動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和生長(zhǎng)空間。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法是目前動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)的主要方法之一。培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)再放入培養(yǎng)箱第四十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日4培養(yǎng)板培養(yǎng)法接種在培養(yǎng)板孔（48、96）內(nèi)，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。目前常規(guī)方法之一。第五十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日5轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法1933-1934年，蓋爾（Gey）和劉易斯（Lewis）建立了旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法克服了靜置培養(yǎng)的不足，例如：細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境不均勻、不利于營(yíng)養(yǎng)的吸收等，培養(yǎng)物可以交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織生長(zhǎng)。6轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法將轉(zhuǎn)管換成培養(yǎng)瓶，增加了培養(yǎng)液與空氣接觸面積第五十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在反應(yīng)器培養(yǎng)液中自由懸浮生長(zhǎng)。主要用于非貼壁依賴型的少數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)：雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞等。貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。11-7動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞呈單個(gè)游離態(tài)存在，傳代時(shí)無需再消化分散；增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單。第五十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.微載體培養(yǎng)微載體（Microcarrier）：是直徑60-250μm的帶正電荷微粒（葡聚糖聚合物），適于貼壁型細(xì)胞生長(zhǎng)。1967年，維茨爾（VanWezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)。微載體培養(yǎng)成既能滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求，又能使微珠懸浮起來，實(shí)現(xiàn)3D培養(yǎng)，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）培養(yǎng)限制（面積有限，占用空間大，細(xì)胞產(chǎn)率低，監(jiān)控不便，勞動(dòng)強(qiáng)度大）。第五十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.1微載體特點(diǎn)1.良好的生物相容性、無毒無害2.有好的黏附性，一般帶正電荷3.大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一4.良好的傳質(zhì)性能5.強(qiáng)的機(jī)械性能：重復(fù)利用、保護(hù)細(xì)胞6.好的熱穩(wěn)定性：能高壓滅菌第五十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.2微載體分類1.實(shí)心微載體優(yōu)點(diǎn)：易于細(xì)胞在表面貼壁，機(jī)械強(qiáng)度高，容易接種操作缺點(diǎn)：細(xì)胞濃度低；細(xì)胞容易受剪切力、攪拌、碰撞等影響；細(xì)胞易老化脫落。2.多孔微載體優(yōu)點(diǎn)：比表面積更大生長(zhǎng)空間大；內(nèi)部生長(zhǎng)可使細(xì)胞免受機(jī)械損傷；易固定化培養(yǎng)，可以采用高的攪拌速度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。缺點(diǎn)：容易產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)傳遞障礙，積聚代謝副產(chǎn)物。第五十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.3微載體培養(yǎng)細(xì)胞方法1、選擇合適的微載體類型：細(xì)胞貼壁率高、細(xì)胞容納量大等。2、浸泡水化及消毒：用含Ca2+、Mg2+的PBS浸泡微載體3h，洗滌1次，高壓滅菌。3、接種：根據(jù)不同細(xì)胞類型決定接種濃度。細(xì)胞在微載體表面的貼附是關(guān)鍵，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和親和性，也與培養(yǎng)基組成（血清提供促接觸和伸展因子）、要慢速攪拌等相關(guān)。多數(shù)細(xì)胞都可在24小時(shí)內(nèi)貼壁。4、培養(yǎng)與觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)：觀察形態(tài)是否正常，并計(jì)數(shù)控制密度。第五十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日第五十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1.游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)。2.吸附期：不同類型的細(xì)胞的貼壁時(shí)間有所差異，多數(shù)細(xì)胞都可在24小時(shí)內(nèi)貼壁。3.繁殖期：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞間開始接觸并連接成片。出現(xiàn)接觸性抑制。4.退化期：細(xì)胞長(zhǎng)滿載體表面，隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞開始退化。如不及時(shí)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞脫落死亡。微載體細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)過程第五十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日2.3微載體培養(yǎng)細(xì)胞方法酶消化法：碳酸氫鈉堿性溶液浸泡，貼壁性差，使細(xì)胞脫落；用含EDTA的PBS緩沖液洗滌微球，胰蛋白酶-EDTA37℃浸泡攪動(dòng)消化15min后，血清終止5、消化與細(xì)胞回收：細(xì)胞貼壁率高、細(xì)胞容納量大等。6、細(xì)胞收獲：離心沉降法(400r/min,2min)或100um過濾法。7、傳代培養(yǎng)：“球傳球”傳代培養(yǎng)技術(shù)。第五十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日球傳球接種技術(shù)將貼滿細(xì)胞的微載體與新鮮微載體混合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因隨機(jī)碰撞而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移貼附在新載體表面的技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：（1）避免了細(xì)胞收獲與微載體再生過程，方便、高效。（2）防止細(xì)胞調(diào)亡：通過定期更換微載體也能為細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)提供了新的生長(zhǎng)空間，在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中保持細(xì)胞活力，延長(zhǎng)了細(xì)胞壽命，提高了細(xì)胞分泌物的產(chǎn)量。視頻：第六十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日機(jī)械攪拌式：漿葉改造充氣攪拌式：需要改造微載體培養(yǎng)：解決空間分布與貼壁，連續(xù)灌注培養(yǎng)中空纖維式：解決貼壁、營(yíng)養(yǎng)氣體有效吸收交換、連續(xù)灌注培養(yǎng)11-8動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器第六十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞生長(zhǎng)在由半透性的多孔膜制成的中空纖維中外表面。柱式中空纖維生物反應(yīng)器中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜。

主體是由微孔中空纖維管束制成的中空絲，纖維束由外殼包裹，因此可分為中空內(nèi)腔與中空外腔兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。新鮮培養(yǎng)液從中空內(nèi)腔導(dǎo)入。氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體內(nèi)部。無菌空氣進(jìn)出口第六十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日中空纖維反應(yīng)器第六十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日板框式：平行排列的中空纖維床中心灌流式優(yōu)點(diǎn)：克服了纖維軸向流動(dòng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)與產(chǎn)物積累存在的濃度梯度多孔通氣第六十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)。既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞如果是附壁性的，則附著在纖維外殼表面，在培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化液將其消化沖出；若是非附壁性的，應(yīng)采用微濾材料將其截留在反應(yīng)器內(nèi)而讓培養(yǎng)液排出。優(yōu)點(diǎn)：無剪切力影響，高密度培養(yǎng)，傳質(zhì)效率高。缺點(diǎn)：容易堵塞，價(jià)錢昂貴。柱式中空纖維生物反應(yīng)器評(píng)價(jià)第六十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1、有毒物質(zhì)或抑制因子產(chǎn)生氨：來自培養(yǎng)基+代謝，積聚影響細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白糖基化。乳酸：來自細(xì)胞的糖代謝，抑制乳酸脫氫酶，抑制糖酵解，能量產(chǎn)生減少，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。甲基乙二醛：脂類、氨基酸的代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞有潛在的損傷作用，改變有機(jī)物-NH3和-SH2。CO2：毒害細(xì)胞或改變代謝水平、增大細(xì)胞滲透壓。11-9動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素第六十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日原因：營(yíng)養(yǎng)成分耗盡、有毒產(chǎn)物積累如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。滲透壓：影響細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡速度，影響產(chǎn)物積累；載體：空間大小、孔隙大小，貼壁性、細(xì)胞移動(dòng)性細(xì)胞死亡與凋亡：凋亡基因bcl-211-9動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素2、物理因素參數(shù)控制：在線監(jiān)控pH、溫度、氧氣、攪拌等第六十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日灌注培養(yǎng)1.減少細(xì)胞調(diào)亡（1）可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等代謝物質(zhì)。（2）保證營(yíng)養(yǎng)供給。2.連續(xù)性收獲產(chǎn)品采取怎樣的工藝操作才可以消除細(xì)胞凋亡，保證高的細(xì)胞濃度？第六十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日11-10動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白大多數(shù)哺乳動(dòng)物蛋白翻譯后的修飾，例如：糖基化、磷酸化和乙?；龋潜３稚飳W(xué)活性、穩(wěn)定性及抗原性的前提。轉(zhuǎn)基因微生物在生產(chǎn)分子量較小、結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的異源蛋白方面具有優(yōu)越性，微生物表達(dá)系統(tǒng)合成的復(fù)雜真核蛋白存在折疊方式不正確、缺乏翻譯后加工修飾等缺陷，動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以較好地解決這些問題。第六十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日1.動(dòng)物轉(zhuǎn)基因方法（1）物理法-電穿孔法利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，在細(xì)胞膜上形成納米級(jí)的微孔，達(dá)到增加通透性的效果，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。簡(jiǎn)單、效率較高。第七十頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日DEAE-萄聚糖法早期使用轉(zhuǎn)基因法，效率低。原理：帶負(fù)電的DNA吸附在帶正電荷的DEAE（二乙氨乙基）表面形成顆粒，通過胞飲作用進(jìn)入胞內(nèi)。（2）化學(xué)方法磷酸鈣-DNA共沉法：比前者高，但轉(zhuǎn)基因效率還較低。原理：形成磷酸鈣-DNA沉淀顆粒，Ca2+能促使細(xì)胞膜脂裂開形成孔隙，使DNA進(jìn)入，也可通過胞飲作用進(jìn)入胞內(nèi)。第七十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，2022年，8月28日脂質(zhì)體載體包埋法將需轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA與脂質(zhì)體混合，帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體內(nèi)形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。效