儀器教程高效液相色譜法

高效液相色譜法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

20-1概述

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約170cm，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度為30cm3·h-1，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.2．高效液相色譜法與氣相色譜法

（l）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒(méi)有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作?？傊?，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類(lèi)、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。20-2高效液相色譜儀

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見(jiàn)圖20-1，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過(guò)程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。

1．高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過(guò)濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱(chēng)機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。2．進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱(chēng)柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

3分離系系統(tǒng)——色色譜柱色譜柱是液液相色譜的的心臟部件，它包括柱柱管與固定定相兩部分分。柱管材材料有玻璃璃、不銹鋼鋼、鋁、銅銅及內(nèi)襯光光滑的聚合合材料的其其他金屬。。玻璃管耐耐壓有限，，故金屬管管用得較多多。一般色色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑徑為4～5mm，凝凝膠色譜柱柱內(nèi)徑3～～12mm，制備往往內(nèi)徑較大大，可達(dá)25mm以以上。一般在分離離前備有一一個(gè)前置柱柱，前置柱柱內(nèi)填充物物和分離柱柱完全一樣樣，這樣可可使淋洗溶溶劑由于經(jīng)經(jīng)過(guò)前置柱柱為其中的的固定相飽飽和，使它它在流過(guò)分分離柱時(shí)不不再洗脫其其中固定相相，保證分分離技的性性能不受影影響。柱子裝填得得好壞對(duì)柱柱效影響很很大。對(duì)于于細(xì)粒度的的填料（＜＜20μm）一般采采用勻漿填充法法裝柱，先將填料料調(diào)成勻漿漿，然后在在高壓泵作作用下，快快速將其壓壓入裝有洗洗脫液的色色譜柱內(nèi)，，經(jīng)沖洗后后，即可備備用。4．檢測(cè)系系統(tǒng)在液相色譜譜中，有兩兩種基本類(lèi)類(lèi)型的檢測(cè)測(cè)器。一類(lèi)類(lèi)是溶質(zhì)性檢測(cè)測(cè)器，它僅對(duì)被被分離組分分的物理或或化學(xué)特性性有響應(yīng)，，屬于這類(lèi)類(lèi)檢測(cè)器的的有紫外、熒光光、電化學(xué)學(xué)檢測(cè)器等等。另一類(lèi)是是總體檢測(cè)器器，它對(duì)試樣樣和洗脫液液總的物理理或化學(xué)性性質(zhì)有響應(yīng)應(yīng)，屬于這這類(lèi)檢測(cè)器器的有示差折光，，電導(dǎo)檢測(cè)測(cè)器等?，F(xiàn)將將常用的檢檢測(cè)器介紹紹如下:（l）紫外外檢測(cè)器（2）熒光光檢測(cè)器(3)示示差折折光率檢測(cè)測(cè)器幾乎所有物物質(zhì)都有各各自不同的的折射率，，因此差示示折光檢測(cè)測(cè)器是一種種通用型檢檢測(cè)器。靈靈敏度可達(dá)達(dá)10-7g·cm-3。主要缺點(diǎn)點(diǎn)是對(duì)溫度度變化敏感感，并且不不能用于梯梯度淋洗。。（4）電導(dǎo)導(dǎo)檢測(cè)器(5)附附屬系系統(tǒng)它包括脫氣氣、梯度淋淋洗、恒溫溫、自動(dòng)進(jìn)進(jìn)樣、餾分分收集以及及數(shù)據(jù)處理理等裝置。。其中梯度度淋洗裝置置是高壓液液相色譜儀儀中尤為重重要的附屬屬裝置.20-3高高效液相色色譜的固定定相和流動(dòng)動(dòng)相（－）固定定相高效液相色色譜固定相相以承受高高壓能力來(lái)來(lái)分類(lèi)，可可分為剛性固體和硬膠兩大類(lèi)。剛性固體以二氧化硅為為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O××109Pa的高壓壓，可制成成直徑、形形狀、孔隙隙度不同的的顆粒。如如果在二氧氧化硅表面面鍵合各種種官能團(tuán)，，就是鍵合合固定相，，可擴(kuò)大應(yīng)應(yīng)用范圍，，它是目前前最廣泛使使用的一種種固定相。。硬膠主要用于離離子交換和和尺寸排阻阻色譜中，，它由聚苯乙烯與與二乙烯苯苯基交聯(lián)而成。?？沙惺軌簤毫ι舷逓闉?.5××108Pa。固定定相按孔隙隙深度分類(lèi)類(lèi)，可分為為表面多孔型型和全多孔孔型固定相相兩類(lèi)。1.表面多多孔型固定定相它的基體是是實(shí)心玻璃璃珠，在玻玻璃球外面面覆蓋一層層多孔活性性材料，如如硅膠、氧氧化鋁、離離子交換劑劑、分子篩篩、聚酸胺胺等。表面活性材材料為硅膠膠的固定相相如國(guó)外的的Zpax，CorasilI和II，Vydac，，Pellosil以及上海海試劑一廠(chǎng)廠(chǎng)的薄殼玻玻璃珠等；；表面活性性材料為氧氧化鋁的固固定相，如如Pellumina；為聚聚酰胺的，，如Pellion。這類(lèi)固定相相的多孔層層厚度小、、孔淺，相相對(duì)死體積積小，出峰峰迅速、柱柱效亦高；；顆粒較大大，滲透性性好，裝柱柱容易，梯梯度淋洗時(shí)時(shí)能迅速達(dá)達(dá)平衡，較較適合做常常規(guī)分析。。由于多孔孔層厚度薄薄，最大允允許量受限限制。2．全多孔孔型固定相相它由直徑為為10nm的硅膠微粒凝凝聚而成。如國(guó)外的的Porasil，，Zobbex、Lichrosorb系列，，上海試劑劑一廠(chǎng)的堆堆積硅珠，，青島海洋洋化工廠(chǎng)的的YWG系系列，天津津試劑二廠(chǎng)廠(chǎng)的DG系系列等。也也可由氧化化鋁微粒凝凝聚成全多多孔型固定定相，如國(guó)國(guó)外的LichrosorbALOXT。這類(lèi)固定相相由于顆粒粒很細(xì)（5～10μμm），孔孔仍然較淺淺，傳質(zhì)速速率快，易易實(shí)現(xiàn)高效效、高速。。特別適合合復(fù)雜混合合物分離及及痕量分析析.（二）流動(dòng)動(dòng)相由于高效液液相色譜中中流動(dòng)相是是液體，它它對(duì)組分有有親和力，，并參與固固定相對(duì)組組分的競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)。因此，，正確選擇擇流動(dòng)相直直接影響組組分的分離離度。對(duì)流流動(dòng)相溶劑劑的要求是是：（1）溶劑劑對(duì)于待測(cè)測(cè)樣品，必須具有有合適的極極性和良好好的選擇性性。（2））溶溶劑劑要要與與檢檢測(cè)測(cè)器器匹匹配配。對(duì)對(duì)于于紫紫外外吸吸收收檢檢測(cè)測(cè)器器，，應(yīng)應(yīng)注注意意選選用用檢檢測(cè)測(cè)器器波波長(zhǎng)長(zhǎng)比比溶溶劑劑的的紫紫外外截止止波波長(zhǎng)長(zhǎng)要長(zhǎng)長(zhǎng)。。所謂謂溶溶劑劑的的紫紫外外截截止止波波長(zhǎng)長(zhǎng)指指當(dāng)當(dāng)小小于于截截止止波波長(zhǎng)長(zhǎng)的的輻輻射射通通過(guò)過(guò)溶溶劑劑時(shí)時(shí)，，溶溶劑劑對(duì)對(duì)此此輻輻射射產(chǎn)產(chǎn)生生強(qiáng)強(qiáng)烈烈吸吸收收，此此時(shí)時(shí)溶溶劑劑被被看看作作是是光光學(xué)學(xué)不不透透明明的的，，它它嚴(yán)嚴(yán)重重干干擾擾組組分分的的吸吸收收測(cè)測(cè)量量。。表表20-2列列出出了了一一些些常常用用溶溶劑劑的的紫紫外外截截止止波波長(zhǎng)長(zhǎng)。。對(duì)于于折折光光率率檢檢測(cè)測(cè)器器，，要要求求選選擇擇與與組組分分折折光光率率有有較較大大差差別別的的溶溶劑劑作作流流動(dòng)動(dòng)相相，，以以達(dá)達(dá)最最高高靈靈敏敏度度。。（3））高高純純度度。由由于于高高效效液液相相靈靈敏敏度度高高，，對(duì)對(duì)流流動(dòng)動(dòng)相相溶溶劑劑的的純純度度也也要要求求高高。。不不純純的的溶溶劑劑會(huì)會(huì)引引起起基基線(xiàn)線(xiàn)不不穩(wěn)穩(wěn)，，或或產(chǎn)產(chǎn)生生““偽偽峰峰””。。痕痕量量雜雜質(zhì)質(zhì)的的存存在在，，將將使使截截止止波波長(zhǎng)長(zhǎng)值值增增加加50～～I(xiàn)OOnm。。（4））化化學(xué)學(xué)穩(wěn)穩(wěn)定定性性好好。不不能能選選與與樣樣品品發(fā)發(fā)生生反反應(yīng)應(yīng)或或聚聚合合的的溶溶劑劑。。(5)低低粘粘度度。若若使使用用高高粘粘度度溶溶劑劑，，勢(shì)勢(shì)必必增增高高壓壓力力，，不不利利于于分分離離。。常常用用的的低低粘粘度度溶溶劑劑有有丙丙酮酮、、乙乙醇醇、、乙乙晴晴等等。。但但粘粘度度過(guò)過(guò)于于低低的的溶溶劑劑也也不不宜宜采采用用，，例例戊戊烷烷、、乙乙醚醚等等，，它它們們易易在在色色譜譜柱柱或或檢檢測(cè)測(cè)器器內(nèi)內(nèi)形形成成氣氣泡泡，，影影響響分分離離.20-4高高效效液液相相色色譜譜法法的的主主要要類(lèi)類(lèi)型型及及選選擇擇（－－））液液一一液液分分配配色色譜譜法法（（LLPC））在液液-液液色色譜譜中中,流流動(dòng)動(dòng)相相和和固固定定相相都都是是液液體體,它它能能適適用用于于各各種種樣樣品品類(lèi)類(lèi)型型的的分分離離和和分分析析，，無(wú)無(wú)論論是是極極性性的的和和非非極極性性的的，，水水溶溶性性和和油油溶溶性性的的，，離離子子型型的的和和非非離離子子型型的的化化合合物物。。1．．分分離離原原理理液液液分分配配色色譜譜的的分分離離原原理理基基本本與與液液液液萃萃取取相相同同，，都是是根根據(jù)據(jù)物物質(zhì)質(zhì)在在兩兩種種互互不不相相溶溶的的液液體體中中溶溶解解度度的的不不同同，，具具有有不不同同的的分分配配系系數(shù)數(shù)。。所不不同同的的是是液液液液色色譜譜的的分分配配是是在在柱柱中中進(jìn)進(jìn)行行的的，，使使這這種種分分配配平平衡衡可可反反復(fù)復(fù)多多次次進(jìn)進(jìn)行行，，造造成成各各組組分分的的差差速速遷遷移移，，提提高高了了分分離離效效率率，，從從而而能能分分離離各各種種復(fù)復(fù)雜雜組組分分。。2固固定定相相由于于液液液液色色譜譜中中流流動(dòng)動(dòng)相相參參與與選選擇擇競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)，，因因此此，，對(duì)對(duì)固固定定相相選選擇擇較較簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單。。只只需需使使用用幾幾種種極極性性不不同同的的固固定定液液即即可可解解決決分分離離問(wèn)問(wèn)題題。。例例如如，，最最常常用用的的強(qiáng)強(qiáng)極極性性固固定定液液β，，ββ′′一一氧氧二二丙丙睛睛，中中等等極極性性的的聚乙乙二二醇醇，非非極極性性的的角鯊鯊?fù)橥榈取?。為了了更更好好解解決決固固定定液液在在載載體體上上流流失失問(wèn)問(wèn)題題。。產(chǎn)產(chǎn)生生了了化學(xué)學(xué)鍵鍵合合固固定定相相。它它是是將將各各種種不不同同有有機(jī)機(jī)基基團(tuán)團(tuán)通通過(guò)過(guò)化化學(xué)學(xué)反反應(yīng)應(yīng)鍵鍵合合到到載載體體表表面面的的一一種種方方法法。。它它代代替替了了固固定定液液的的機(jī)機(jī)械械涂涂漬漬，，因因此此它它的的產(chǎn)產(chǎn)生生對(duì)對(duì)液液相相色色譜譜法法迅迅速速發(fā)發(fā)展展起起著著重重大大作作用用，，可以以認(rèn)認(rèn)為為它它的的出出現(xiàn)現(xiàn)是是液液相相色色譜譜法法的的一一個(gè)個(gè)重重大大突突破破。它它是是目目前前應(yīng)應(yīng)用用最最廣廣泛泛的的一一種種固固定定相相。。據(jù)據(jù)統(tǒng)統(tǒng)計(jì)計(jì)，，約約有有3/4以以上上的的分分離離問(wèn)問(wèn)題題是是在在化化學(xué)學(xué)鍵鍵合合固固定定相相上上進(jìn)進(jìn)行行的的。。詳詳細(xì)細(xì)介介紹紹見(jiàn)見(jiàn)后后。。3．．流流動(dòng)動(dòng)相相在液液液液色色譜譜中中為為了了避避免免固固定定液液的的流流失失。。對(duì)對(duì)流流動(dòng)動(dòng)相相的的一一個(gè)個(gè)基基本本要要求求是是流流動(dòng)動(dòng)相相盡盡可可能能不不與與固固定定相相互互溶溶，，而而且且流流動(dòng)動(dòng)相相與與固固定定相相的的極極性性差差別別越越顯顯著著越越好好。。根根據(jù)據(jù)所所使使用用的的流流動(dòng)動(dòng)相相和和固固定定相相的的極極性性程程度度，，將將其其分分為為正相相分分配配色色譜譜和反相相分分配配色色譜譜。如如果果采采用用流動(dòng)動(dòng)相相的的極極性性小小于于固固定定相相的的極極性性，稱(chēng)稱(chēng)為為正相相分分配配色色譜譜，它它適適用用于于極極性性化化合合物物的的分分離離。。其其流出出順順序序是是極極性性小小的的先先流流出出，，極極性性大大的的后后流流出出。如如果果采采用用流動(dòng)動(dòng)相相的的極極性性大大于于固固定定相相的的極極性性，稱(chēng)稱(chēng)為為反相相分分配配色色譜譜。它它適適用用于于非非極極性性化化合合物物的的分分離離，，其其流出出順順序序與與正正相相色色譜譜恰恰好好相相反反。。（二二））化化學(xué)學(xué)鍵鍵合合相相色色譜譜法法（（CBPC））采用用化學(xué)學(xué)鍵鍵合合相相的的液液相相色色譜譜稱(chēng)稱(chēng)為為化化學(xué)學(xué)鍵鍵合合相相色色譜譜法法，，簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱(chēng)稱(chēng)鍵鍵合合相相色色譜譜。。由于于鍵鍵合合固固定定相相非非常常穩(wěn)穩(wěn)定定，，在在使使用用中中不不易易流流失失，，適適用用于于梯梯度度淋淋洗洗，，特特別別適適用用于于分分離離容容量量因因子子k值值范范圍圍寬寬的的樣樣品品。。由由于于鍵鍵合合到到載載體體表表面面的的官官能能團(tuán)團(tuán)可可以以是是各各種種極極性性的的，，因因此此它它適適用用于于種種類(lèi)類(lèi)繁繁多多樣樣品品的的分分離離。。1．．鍵鍵合合固固定定相相類(lèi)類(lèi)型型用來(lái)來(lái)制制備備鍵鍵合合固固定定相相的的載載體體，，幾幾乎乎都都用用硅膠膠。利利用用硅硅膠膠表表面面的的硅硅醇醇基基(Si一一OH)與與有有機(jī)機(jī)分分可可成成鍵鍵,即即可可得得到到各各種種性性能能的的固固定定相相。。一一般般可可分分三三類(lèi)類(lèi)（1））疏水水基基團(tuán)團(tuán)如不不同同鏈鏈長(zhǎng)長(zhǎng)的的烷烷烴烴（（C8和C18。））和和苯苯基基等等（2））極性性基基團(tuán)團(tuán)如氨氨丙丙基基，，氰氰乙乙基基、、醚醚和和醇醇等等。。（3））離子交換基團(tuán)團(tuán)如作為陰離子子交換基團(tuán)的的胺基，季鍍鍍鹽；作為陽(yáng)離子交交換基團(tuán)的的磺酸等.2．鍵合固定定相的制備（l）硅酸酯酯（≡Si一一OR）鍵合合固定相,它是最先用用于液相色譜譜的健合固定定相。用醇與與硅醇基發(fā)生生酯化反應(yīng)：：≡Si－0H＋ROH→→≡Si－OR＋H20由于這類(lèi)鍵合合固定相的有有機(jī)表面是一一些單體，具具有良好的傳傳質(zhì)特性,但但這些酯化過(guò)過(guò)的硅膠填料料易水解且受受熱不穩(wěn)定，，因此僅適用于不含水水或醇的流動(dòng)動(dòng)相。（2）≡Si－C或Si一N共價(jià)鍵鍵合固定相制備反應(yīng)如下下共價(jià)鍵健合固固定相不易水水解，并且熱熱穩(wěn)定較硅酸酸酯好。缺點(diǎn)點(diǎn)是格氏反應(yīng)應(yīng)不方便；當(dāng)當(dāng)使用水溶液液時(shí)，必須限限制PH在4～8范圍內(nèi)內(nèi).（3）硅烷化化（≡Si——O－Si－－C）鍵合固固定相制備反應(yīng)如下下：這類(lèi)鍵會(huì)固定定相具有熱穩(wěn)穩(wěn)定好，不易易吸水，耐有有機(jī)溶劑的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下，，PH=2～～8范圍內(nèi)正正常工作，應(yīng)應(yīng)用較廣泛.3．反相健合相相色譜法此法的固定相相是采用極性性較小的鍵合合固定相，如如硅膠一C18H37、硅膠一苯基基等；流動(dòng)相相是采用極性性較強(qiáng)的溶劑劑，如甲醇十十、乙睛一水水、水和無(wú)機(jī)機(jī)鹽的緩沖溶溶液等。它多多用于分離多多環(huán)芳烴等低低極性化合物物；若采用含含一定比例的的甲醇或乙睛睛的水溶液為為流動(dòng)相，也也可用于分離離極性化合物物；若采用水水和無(wú)機(jī)鹽的的緩沖液為流流動(dòng)相，則可可分離一些易易離解的樣品品，如有機(jī)酸酸、有機(jī)堿、、酚類(lèi)等。反反相鍵合相色色譜法具有柱柱效高，能獲獲得無(wú)拖尾色色譜峰的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)。關(guān)于反相鍵合合相色譜的分分離機(jī)理，可可用所謂疏溶溶劑作用理論論來(lái)解釋。這這種理論把非非極性的烷基基鍵合相看作作一層鍵合在在硅膠表面上上的十八烷基基的“分子毛”，這種“分分子毛”有較較強(qiáng)的流水特特性。當(dāng)用極極性溶劑為流流動(dòng)相來(lái)分離離含有極性官官能團(tuán)的有機(jī)機(jī)化合物時(shí)，，一方面，分分子中的非極極性部分與固固定相表面上上的疏水烷基基產(chǎn)生締合作作用，使它保保留在固定相相中；而另一一方面，被分分離物的極性性部分受到極極性流動(dòng)相的的作用，促使使它離開(kāi)固定定相，并減小小其保留作用用（見(jiàn)圖20-4）。顯顯然，兩種作作用力之差，，決定了分子子在色譜中的的保留行為。。4.正相鍵合相色色譜法此法是以極性性的有機(jī)基團(tuán)團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合合在硅膠表面面，作為固定定相；而以非非極性或極性性小的溶劑（（如烴類(lèi)）中中加入適量的的極性溶劑（（如氯仿、醇醇、乙臘等））為流動(dòng)相，，分離極性化化合物。此時(shí)時(shí)，組分的分配比比k值隨其極極性的增加而而增大，但隨流動(dòng)相極極性的增加而而降低。這種色譜方法法主要用于分分離異構(gòu)體、、極性不同的的化合物，特特別適用于分分離不同類(lèi)型型的化合物。。5.離子性鍵合相相色譜法當(dāng)以薄殼型或或全多孔微粒粒型硅膠為基基質(zhì)，化學(xué)鍵鍵合各種離子子交換基團(tuán)，，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等時(shí)，就形形成了離子性性鍵合相色譜譜的固定相；；流動(dòng)相一般般采用緩沖溶溶液。其分離原理與離離子交換色譜譜類(lèi)同。以上討論了各各種類(lèi)型化學(xué)學(xué)鍵合相色譜譜法，歸納鍵鍵合相色譜的的最大優(yōu)點(diǎn)是是：通過(guò)改變變流動(dòng)相的組組成和種類(lèi)，，可有效地分分離各種類(lèi)型型化合物（非非極性、極性性和離子型））。此外，由由于鍵合到載載體上的基團(tuán)團(tuán)不易流失，，特別適用于于梯度淋洗。。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在在高效液相色色譜法中，約約有8O％的的分離問(wèn)題是是用鍵合相色色譜法解決。。此法的最大缺缺點(diǎn)是不能用用于酸、堿度度過(guò)大或存在在氧化劑的緩緩沖溶液作流流動(dòng)相的體系系。如何根據(jù)樣樣品極性種類(lèi)類(lèi)來(lái)選擇化學(xué)學(xué)鍵合的固定定相，請(qǐng)參看看表20-3。（三）液一固固吸附色譜法法(LSAC)液一固吸附色色譜是以固體體吸附劑作為為固定相，吸吸附劑通常是是些多孔的固固體顆粒物質(zhì)質(zhì)，在它們的的表面存在吸吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)質(zhì)在固定相上上的吸附作用用不同來(lái)進(jìn)行行分離的。1．分離原理理當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)過(guò)固定相（吸吸附劑）時(shí)，，吸附劑表面面的活性中心心就要吸附流流動(dòng)相分子。。同時(shí)，當(dāng)試試樣分子（X）被流動(dòng)相相帶入柱內(nèi)，，只要它們?cè)谠诠潭ㄏ嘤幸灰欢ǔ潭鹊谋１Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)牡囊驯晃降牡牧鲃?dòng)相溶劑劑分用）于是是，在固定相相表面發(fā)生競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)吸附:X+nSad=Xad+nS達(dá)平衡衡時(shí),有其中Kad為吸附附平衡衡常數(shù)數(shù)，值大大表示示組分分在吸吸附劑劑上保保留強(qiáng)強(qiáng)，難難于洗洗脫。。Kad值小,則保保留值值弱，，易于于洗脫脫。試試樣中中各組組分據(jù)據(jù)此得得以分分離。。Kad值可通通過(guò)吸吸附等等溫線(xiàn)線(xiàn)數(shù)據(jù)據(jù)求出出。2．固定定相吸附色色譜所所用固固定相相多是是一些些吸附附活性性強(qiáng)弱弱不等等的吸吸附劑劑，如如硅膠膠、氧氧化鋁鋁、聚聚酸膠膠等。。由于于硅膠膠的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)較較多，，如線(xiàn)線(xiàn)性容容量較較高，，機(jī)械械性能能好，，不溶溶脹，，與大大多數(shù)數(shù)試樣樣不發(fā)發(fā)生化化學(xué)反反應(yīng)等等，因因此，，以硅硅膠用用得最最多。。在高效效液相相色譜譜法中中，表表面多多孔型型和全全多孔孔型都都可作作吸附附色譜譜中的的固定定相，，它們們具有有填料料均勻勻、粒粒度小小?？卓籽\淺的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)，，能極極大地地提高高柱效效。但但表面面多孔孔型由由于試試樣容容量較較小，，目前前最廣廣泛使使用的的還是是全多孔孔型微微粒填填料。。3流動(dòng)相相一般把把吸附附色譜譜中流動(dòng)相相稱(chēng)作洗脫劑劑。在吸附附色譜譜中對(duì)對(duì)極性性大的的試樣樣往往往采用用極性性強(qiáng)的的洗脫脫劑；；對(duì)極極性弱弱的試試樣宜宜用極極性弱弱的洗洗脫劑劑。洗洗脫劑劑的極極性強(qiáng)強(qiáng)弱可可用溶溶劑強(qiáng)強(qiáng)度參參數(shù)（（ε0）來(lái)衡衡量。。ε0越大，，表示示洗脫脫劑的的極性性越強(qiáng)強(qiáng)。表表20-4列出出一些些常用用溶劑劑在氧氧化鋁鋁吸附附劑中中的εε0值。在在硅膠膠吸附附劑中中ε0值的順順序相相同，，數(shù)值值可換換算（（ε0硅膠=0··77×εε0氧化鋁鋁）。。(四））離子子交換換色譜譜法（（IEC））此法是是利用用離子交交換原原理和和液相相色譜譜技術(shù)術(shù)的結(jié)結(jié)合來(lái)來(lái)測(cè)定定溶液液中陽(yáng)陽(yáng)離子子和陰陰離子子的一一種分分離分分析方方法。凡在在溶液液中能能夠電電離的的物質(zhì)質(zhì)，通通常都都可用用離子子交換換色譜譜法進(jìn)進(jìn)行分分離。。它不不僅適適用無(wú)無(wú)機(jī)離離子混混合物物的分分離，，亦可可用于于有機(jī)機(jī)物的的分離離，例例如氨氨基酸酸、核核酸、、蛋白白質(zhì)等等生物物大分分子。。因此此，應(yīng)應(yīng)用范范圍較較廣。。1．離離子交交換原原理離子交交換色色譜法法是利利用不不同待待測(cè)離離子對(duì)對(duì)固定定相親親和力力的差差別來(lái)來(lái)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)分離離的。。其固定定相采采用離離子交交換樹(shù)樹(shù)脂，，樹(shù)脂脂上分分布有有固定定的帶帶電荷荷基團(tuán)團(tuán)和可可游離離的平平衡離離子。。當(dāng)待待分析析物質(zhì)質(zhì)電離離后產(chǎn)產(chǎn)生的的離子子可與與樹(shù)脂脂上可可游離離的平平衡離離子進(jìn)進(jìn)行可可逆交交換，，其交交換反反應(yīng)通通式如如下：：陽(yáng)離子子交換換：陰離子子交換換：一般形形式：：R一一A＋＋B＝＝R－B＋A達(dá)平衡衡時(shí)，，以濃濃度表表示的的平衡衡常數(shù)數(shù)（離離子交交換反反應(yīng)的的選擇擇系數(shù)數(shù)）：：式中[A]r，，[B]r分分別代代表樹(shù)樹(shù)脂相相中洗洗脫劑劑離子子（A）和和試樣樣離子子（B）的的濃度度，[A]、[B]則代代表它它們?cè)谠谌芤阂褐械牡臐舛榷取ｋx離子交交換反反應(yīng)的的選擇擇性系系數(shù)見(jiàn)見(jiàn)從表表示試試樣離離子B對(duì)于于A(yíng)型型樹(shù)脂脂親和和力的的大小?。篕B/A越大，說(shuō)明明B離子交交換能力越越大，越易易保留而難難于洗脫。。一般說(shuō)來(lái)來(lái)，B離子電荷荷越大，水水合離子半半徑越小，，KB/A值就越大。。對(duì)于典型的的磺酸型陽(yáng)陽(yáng)離子交換換樹(shù)脂，一一價(jià)離子的的KB/A值按以下順順序：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價(jià)離子的的順序?yàn)椋海築a2+＞＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對(duì)于季鋁型型強(qiáng)堿陰離離子交換樹(shù)樹(shù)指，各陰陰離子的選選擇性順序序?yàn)椋篊lO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2．固定相作為固定相相的離子交交換劑，其其基質(zhì)大致致有三大類(lèi)類(lèi)：合成樹(shù)樹(shù)脂（聚苯苯乙烯）、、纖維素和和硅膠。而而離子交換換劑又有陽(yáng)陽(yáng)離子和陰陰離子之分分。再根據(jù)據(jù)官能基的的離解度大大小還有強(qiáng)強(qiáng)弱之分（（見(jiàn)表20-5）常用的離子子交換劑固固定相大致致可分以下下幾種：（l）多孔孔型離子交交換樹(shù)脂它主要是聚聚苯乙烯和和二乙烯苯苯基的交聯(lián)聯(lián)聚合物，，直徑約為為5～20μm，有有微孔型和和大孔型之之分[見(jiàn)圖圖20-6中（a））和（b））］。（2）薄膜型離離子交換樹(shù)樹(shù)脂它是在直徑徑約對(duì)30μm的固固體情性核核上，凝聚聚1～2μμm厚的樹(shù)樹(shù)脂層，如如圖20-6中（c）。（3）表面面多孔型離離子交換樹(shù)樹(shù)脂它是在固體體情性核上上，覆蓋一一層微球硅硅膠，再在在上面涂一一層很薄的的離子交換換樹(shù)脂，如如圖20-6中（d）所示。。（4）離子子交換鍵合合固定相它是用化學(xué)學(xué)反應(yīng)將離離子交換基基團(tuán)鍵合到到惰性載體體表面。它它也分為兩兩種類(lèi)型。。一種是鍵鍵合薄殼型型，其載體體是薄殼玻玻珠。另一一種是鍵合合微粒載體體型，它的的載體是多多孔微粒硅硅膠。后者者是一種優(yōu)優(yōu)良的離子子交換固定定相，它的的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)機(jī)械性能穩(wěn)穩(wěn)定，可使使用小粒度度固定相和和高柱壓來(lái)來(lái)實(shí)現(xiàn)快速速分離。3．流動(dòng)相離子交換色色譜法所用用流動(dòng)相大大都是一定pH和和鹽濃度（或離子強(qiáng)強(qiáng)度）的緩緩沖溶液。。通過(guò)改變變流動(dòng)相中中鹽離子的的種類(lèi)、濃濃度和pH值可控制制k值，改改變選擇性性。如果增增加鹽離子子的濃度，，則可降低低樣品離子子的競(jìng)爭(zhēng)吸吸附能力，，從而降低低其在固定定相上的保保留值。一般，對(duì)于于陰離子交交換樹(shù)脂來(lái)來(lái)說(shuō)，各種種陰離子的的滯留次序序?yàn)椋簷幟仕犭x子子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用檸檬檬酸離子洗洗脫要比用用氟離子快快。陽(yáng)離子子的滯留次次序大為：：Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差別不如如陰離子明明顯。關(guān)于于pH值的的影響，要要視不同情情況而定。。例如，分分離有機(jī)酸酸和有機(jī)堿堿時(shí)，這些些酸堿的離離解程度可可通過(guò)改變變流動(dòng)相的的pH值來(lái)來(lái)控制。增增大pH值值會(huì)使酸的的電離度增增加，使堿堿的電離度度減少；降降低PH值值，其結(jié)果果相反。但但無(wú)論屬于于哪種情況況，只要電離度度增大，就就會(huì)使樣品品的保留增增大。（五）離子子色譜法（（IC）離子色譜法法是由離子子交換色譜譜法派生出出來(lái)的一種種分離方法法。由于離子交交換色譜法法在無(wú)機(jī)離離子的分析析和應(yīng)用受受到限制。。例如，對(duì)對(duì)于那些不不能采用紫紫外檢測(cè)器器的被測(cè)離離子，如采采用電導(dǎo)檢檢測(cè)器，由由于被測(cè)離離子的電導(dǎo)導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)強(qiáng)電解質(zhì)流流動(dòng)相的高高背景電導(dǎo)導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)沒(méi)而無(wú)法檢檢測(cè)。為了了解決這一一問(wèn)題，1975年年Small等人提提出一種能能同時(shí)測(cè)定定多種無(wú)機(jī)機(jī)和有機(jī)離離子的新技技術(shù)。他們們?cè)陔x子交交換分離柱柱后加一根根抑制柱，，抑制柱中中裝填與分分離柱電荷荷相反的離離子交換樹(shù)樹(shù)脂。通過(guò)分離柱柱后的樣品品再經(jīng)過(guò)抑抑制柱，使使具有高背背景電導(dǎo)的的流動(dòng)相轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成低背背景電導(dǎo)的的流動(dòng)相，，從而用電電導(dǎo)檢測(cè)器器可直接檢檢測(cè)各種離離子的含量量。這種色譜技技術(shù)稱(chēng)為離離子色譜。若樣品為為陽(yáng)離子，，用無(wú)機(jī)酸酸作流動(dòng)相相，抑制柱柱為高容量量的強(qiáng)堿性性陰離子交交換劑。當(dāng)當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)陽(yáng)離子交換換劑的分離離往后，隨隨流動(dòng)相進(jìn)進(jìn)入抑制柱柱，在抑制制柱中發(fā)生生兩個(gè)重要要反應(yīng)：R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-由反應(yīng)可見(jiàn)見(jiàn)：經(jīng)抑制制柱后，一一方面將大大量酸轉(zhuǎn)變變?yōu)殡妼?dǎo)很很小的水，，消除了流流動(dòng)相本底底電導(dǎo)的影影響。同時(shí)時(shí)，又將樣樣品陽(yáng)離子子M+轉(zhuǎn)變變成相應(yīng)的的堿，由于于OH-離子的淌度度為Cl-離子的2．．6倍，提提高了所測(cè)陽(yáng)離子電電導(dǎo)的檢測(cè)測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離離子樣品也也有相似的的作用機(jī)理理。在分離柱后后加一個(gè)抑抑制柱的離離子色譜亦亦稱(chēng)為抑制制型離子色色譜或稱(chēng)雙雙柱離子色色譜。由于于抑制柱要要定期再生生，而且譜譜帶在通過(guò)過(guò)抑制柱后后會(huì)加寬，，降低了分分離度。后后來(lái)，F(xiàn)rits等等人提出采采用抑制柱柱的離子色色譜體系，，而采用了了電導(dǎo)率極極低的溶液液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或或鄰苯二甲甲酸鹽的稀稀溶液作流流動(dòng)相，稱(chēng)稱(chēng)為非抑制制型離子色色譜或單柱柱離子色譜譜。（六）離子子對(duì)色譜法法（IPC）離子對(duì)色譜譜法是分離離分析強(qiáng)極極性有機(jī)酸酸和有機(jī)堿堿的極好方方法。它是是離子對(duì)革革取技術(shù)與與色譜法相相結(jié)合的產(chǎn)產(chǎn)物。在20世紀(jì)7O年代中中期，Schill等人首先先提出離子子對(duì)色譜法法，后來(lái)，，這種方法法得到十分分迅速的發(fā)發(fā)展。1．．離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法原原理理離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法是是將將一一種種（（或或數(shù)數(shù)種種））與與溶溶質(zhì)質(zhì)離離子子電電荷荷相相反反的的離離子子（（稱(chēng)稱(chēng)對(duì)對(duì)離離子子或或反反離離子子））加加到到流流動(dòng)動(dòng)相相或或固固定定相相中中，，使使其其與與溶溶質(zhì)質(zhì)離離子子結(jié)結(jié)合合形形成成離離子子對(duì)對(duì)，，從從而而控控制制溶溶質(zhì)質(zhì)離離子子保保留留行行為為的的一一種種色色譜譜法法。。關(guān)于于離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜機(jī)理理，，至至今今仍仍不不十十分分明明確確，，已提提出出三三種種機(jī)機(jī)理理：：離離子子對(duì)對(duì)形形成成機(jī)機(jī)理理；；離離子子交交換換機(jī)機(jī)理理；；離離子子相相互互作作用用機(jī)機(jī)理理?！，F(xiàn)現(xiàn)以以離離子子對(duì)對(duì)形形成成機(jī)機(jī)理理說(shuō)說(shuō)明明之之。。假假如如有有一一離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜體體系系，，固固定定相相為為非非極極性性鍵鍵合合相相，，流流動(dòng)動(dòng)相相為為水水溶溶液液，，并并在在其其中中加加入入一一種種電電荷荷與與組組分分離離子子A-相反反的的離離子子B+，B+離子子由由于于靜靜電電引引力力與與帶帶負(fù)負(fù)電電的的人人組組分分離離子子生生成成離離子子對(duì)對(duì)化化合合物物A-B+。離離子子對(duì)對(duì)生生成成反反應(yīng)應(yīng)式式由于于離離子子對(duì)對(duì)化化合合物物A-B+具有有疏疏水水性性，，因因而而被被非非極極性性固固定定相相（（有有機(jī)機(jī)相相））提提取取。。組組分分離離子子的的性性質(zhì)質(zhì)不不同同，，它它與與反反離離子子形形成成離離子子對(duì)對(duì)的的能能力力大大小小不不同同以以及及形形成成的的離離子子對(duì)對(duì)流流水水性性質(zhì)質(zhì)不不同同，，導(dǎo)導(dǎo)致致各各組組分分離離子子在在固固定定相相中中滯滯留留時(shí)時(shí)間間不不同同，，因因而而出出峰峰先先后后不不同同。。這這就就是是離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法分分離離的的基基本本原原理理。。2．．鍵鍵合合相相反反相相離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法類(lèi)類(lèi)型型很很多多，，根根據(jù)據(jù)流流動(dòng)動(dòng)相相和和固固定定相相的的極極性性可可分分為為反反相相離離子子對(duì)對(duì)和和正正相相離離于于對(duì)對(duì)色色譜譜法法。。其中中以以鍵鍵合合相相離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法最最重重要要。。這種種色色譜譜法法的的固固定定相相采采用用非非極極性性的的疏疏水水鍵鍵合合相相［［如如十十八八烷烷基基鍵鍵合合相相（（ODS））等等］］，流流動(dòng)動(dòng)相相為為加加有有平平衡衡離離子子（（反反離離子子））的的極極性性溶溶液液（（如如甲甲醇醇一一水水或或乙乙睛睛一一水水））。。根據(jù)據(jù)離離子子對(duì)對(duì)生生成成反反應(yīng)應(yīng)式式，，平平衡衡常常數(shù)數(shù)KAB可表表示示為為根據(jù)據(jù)定定義義，，溶溶質(zhì)質(zhì)的的分分配配系系數(shù)數(shù)根據(jù)據(jù)上上兩兩式式，，有有式中中β為為相相比比率率。容容量量因因子子k隨隨KAB和[B+]水相相的增增大大而而增增大大。。鍵合合相相反反相相離離子子對(duì)對(duì)色色譜譜法法操操作作簡(jiǎn)簡(jiǎn)便便，，只只要要改改變變流流動(dòng)動(dòng)相相的的pH值值、、平平衡衡離離子子的的濃濃度度和和種種類(lèi)類(lèi)，，就就可可在在較較大大范范圍圍內(nèi)內(nèi)改改變變分分離離的的選選擇擇性性，，能能較較好好解解決決難難分分離離混混合合物物的的分分離離問(wèn)問(wèn)題題。。此此法法發(fā)發(fā)展展迅迅速速，，應(yīng)應(yīng)用用較較廣廣泛泛.（七七））尺尺寸寸排排阻阻色色譜譜法法（（SEC））尺寸寸排排阻阻色色譜譜法法又又稱(chēng)稱(chēng)凝凝膠膠色色譜譜法法，，主要要用用于于較較大大分分子子的的分分離離。。與與其其他他液液相相色色譜譜方方法法原原理理不不同同，，它它不不具具有有吸吸附附、、分分配配和和離離子子交交換換作作用用機(jī)機(jī)理理，，而而是是基于于試試樣樣分分子子的的尺尺寸寸和和形形狀狀不不同同來(lái)來(lái)實(shí)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)分分離離的的。。尺寸寸排排阻阻色色譜譜被被廣廣泛泛應(yīng)應(yīng)用用于于大大分分子子的的分1．分分離原原理尺寸排排阻色色譜是是按分分子大大小順順序進(jìn)進(jìn)行分分離的的一種種色譜譜方法法。其其固定定相為為化學(xué)學(xué)情性性多孔孔物質(zhì)質(zhì)———凝膠膠，它它類(lèi)似似于分分子篩篩，但但孔徑徑比分分子篩篩大。。凝膠膠內(nèi)具具有一一定大大小的的孔穴穴，體積大大的分分子不不能滲滲透到到孔穴穴中去去而被被排阻阻，較較早地地被淋淋洗出出來(lái)；；中等等體積積的分分子部部分滲滲透；；小分分子可可完全全滲透透入內(nèi)內(nèi)，最最后洗洗出色色譜柱柱。這樣，，樣品品分子子基本本上按按其分分子大大小，，排阻阻先后后由柱柱中流流出。。其滲滲透過(guò)過(guò)程模模型見(jiàn)見(jiàn)圖20-7。。2．固固定相相排阻色色譜固固定相相種類(lèi)類(lèi)很多多，一一般可可分為為軟性性、半半剛性性和剛剛性凝凝膠三三類(lèi)。。表20-6列列出了了常用用的一一些固固定相相。所謂凝凝膠，，指含含有大大量液液體（（一般般是水水）的的柔軟軟而富富于彈彈性的的物質(zhì)質(zhì)，它它是一一種經(jīng)經(jīng)過(guò)交交聯(lián)而而具有有立體體網(wǎng)狀狀結(jié)構(gòu)構(gòu)的多多聚體體。（1））軟性性凝膠膠如葡聚聚糖凝凝膠、、瓊脂脂糖凝凝膠都都具有有較小小的交交聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)，，其微微孔能能吸入入大量量的溶溶劑，，并能能溶脹脹到它它們干干體的的許多多倍。。它們們適用用以水水溶性性溶劑劑作流流動(dòng)相相，一一般用用于小小分子子質(zhì)量量物質(zhì)質(zhì)的分分析，，不適適宜用用在高高效液液相色色譜中中。（2））半剛剛性凝凝膠如高交交聯(lián)度度的聚聚苯乙乙烯（（Styragel）比比軟性性凝膠膠稍耐耐壓，，溶脹脹性不不如軟軟性凝凝膠。。常以以有機(jī)機(jī)溶劑劑作流流動(dòng)相相。用用于高高效液液相色色譜時(shí)時(shí)，流流速不不宜大大。（3））剛性性凝膠膠如多孔孔硅膠膠、多多孔玻玻璃等等它們們既可可用水水溶性性溶劑劑，又又可用用有機(jī)機(jī)溶劑劑作流流動(dòng)相相，可可在較較高壓壓強(qiáng)和和較高高流速速下操操作。。一般般控制制壓強(qiáng)強(qiáng)小于于7MPa，流流速＜＜1cm3·s-1；否則則將影影響凝凝膠孔孔徑，，造成成不良良分離離。3．流流動(dòng)相相排排阻色色譜所所選用用的流流動(dòng)相相必須須能溶溶解樣樣品，，并必必須與與凝膠膠本身身非常常相似似，這這樣才才能潤(rùn)潤(rùn)濕凝凝膠。。當(dāng)采采用軟軟性凝凝膠時(shí)時(shí)，溶溶劑也也必須須能溶脹脹凝膠膠。另外外，溶溶劑的的粘度度要小小，因因?yàn)楦吒哒扯榷热軇﹦┩拗浦品肿幼訑U(kuò)散散作用用而影影響分分離效效果。。這對(duì)對(duì)于具具有低低擴(kuò)散散系數(shù)數(shù)的大大分子子物質(zhì)質(zhì)分離離，尤尤需注注意。。選擇擇溶劑劑還必必須與與檢定定器相相匹配配。常常用的的流動(dòng)動(dòng)相有有四氫氫呋喃喃、甲甲苯、、氯仿仿、二二甲基基酸胺胺和水水等。。以以水水溶液液為流流動(dòng)相相的凝凝膠色色譜適適用于于水溶溶性樣樣品，，以有有機(jī)溶溶劑為為流動(dòng)動(dòng)相的的凝膠膠色譜譜適用用于非非水溶溶性樣樣品。。(八)親和和色譜譜法（（AC）簡(jiǎn)簡(jiǎn)介親和色色譜是是利用用生物物大分分子和和固定定相表表面存存在某某種特特異性性親和和力，，進(jìn)行行選擇擇性分分離的的一種種方法法。它它通常常是在在載體體（無(wú)無(wú)機(jī)或或有機(jī)機(jī)填料料）表表面先先鍵合合一種種具有有一般般反應(yīng)應(yīng)性能能的所所謂間間隔臂臂（如如環(huán)氧氧、聯(lián)聯(lián)氨等等）；；隨后后，再再連接接上配配基（（酶、、抗原原或激激素等等）。。這種種固載載化的的配基基將只只能和和具有有親和和力特特性吸吸附的的生物物大分分子相相互作作用而而被保保留，，沒(méi)有有這種種作用用的分分子不不被保保留。。圖20-9為為親和和色譜譜法示示意圖圖。（九））分離離類(lèi)型型的選選擇1．根根據(jù)相相對(duì)分分子質(zhì)質(zhì)量選選擇相對(duì)分分子質(zhì)質(zhì)量十十分低低的樣樣品，，其揮揮發(fā)性性好，，適用用于氣氣相色色譜。。標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)液相相色譜譜類(lèi)型型（液液一固固、液液一液液、及及離子子交換換色譜譜）最最適合合的相相對(duì)分分子質(zhì)質(zhì)量范范圍是是20O～～2000。對(duì)對(duì)于相相對(duì)分分子質(zhì)質(zhì)量大大于2000的的樣品品，則則用尺尺寸排排阻法法為最最佳。。2．根根據(jù)溶溶解度度選擇擇弄清樣樣品在在水、、異辛辛烷、、苯、、四氯氯化碳碳、異異丙醇醇中的的溶解解度是是很有有用的的。如如果樣樣品可可溶于于水井井屬于于能離離解物物質(zhì)，，以采采用離離子交交換色色譜為為佳；；如樣樣品可可溶于