端粒和端粒酶

端粒和端粒酶TelomeresandEnzymeTelomerase武漢大學(xué)藥學(xué)院郝春霖B端粒酶telomerase

C科學(xué)思想ScientificthoughtsA端粒telomeres

Puzzles1DNA聚合酶特點(diǎn)(引物方向5’→3’)染色體復(fù)制之初可以由小RNA作引物起始合成,之后DNA聚合酶能以反鏈DNA為模板,以前合成的DNA為引物,合成新的DNA取代染色體中間的RNA引物;線性染色體最末端的RNA引物無(wú)法被取代;末端隱縮端粒telomeres

Assumptions1.復(fù)制前聯(lián)體、環(huán)化〔linear→circle〕2.發(fā)卡結(jié)構(gòu)3.可變末端〔alterableterminal〕多個(gè)短重復(fù)序列(shortrepetitivesequences)4.蛋白質(zhì)干預(yù)端粒telomeres

Puzzles21939年,潛心玉米遺傳性狀研究的BarbaraMcClintock(因發(fā)現(xiàn)玉米的轉(zhuǎn)座子獲諾貝爾學(xué)獎(jiǎng))注意到:在減數(shù)分裂后期偶然產(chǎn)生的染色體斷裂很容易重新融合起來(lái)形成“橋〞,在緊接著的有絲分裂中,這種染色體“斷裂---融合---橋---斷裂〞的循環(huán)不斷繼續(xù)。為什么染色體的自然末端不容易相互融合？端粒telomeres

染色體的自然末端不同于非正常的DNA斷裂末端,它有一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)防止染色體之間的相互融合.

科學(xué)家HermannMuller將這種特殊結(jié)構(gòu)命名為端粒(Telomere,在希臘語(yǔ)中,telos表示末端,meros表示片段).Assumptions端粒telomeres

Experiments四膜蟲JackSzostakElizabethBlackburn人工染色體端粒telomeres

四膜蟲四膜蟲是一種特殊的模式生物，有兩個(gè)細(xì)胞核。小核很穩(wěn)定，含5對(duì)染色體，用于生殖傳代；而大核在接合細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，染色體可斷裂成200—300個(gè)小染色體，端粒非常豐富。端粒telomeres

ElizabethBlackburn

1978年，ElizabethBlackburn利用四膜蟲純化了rDNA,以rDNA為模板通過(guò)體外合成摻入dNTP的實(shí)驗(yàn)，推斷出四膜蟲的染色體上有由許多重復(fù)的5’-CCCCAA-3’六堿基序列組成的特殊結(jié)構(gòu)區(qū)域，此區(qū)域即端粒。端粒telomeres

人工染色體

1980年，ElizabethBlackburn在會(huì)議上對(duì)這一重大發(fā)現(xiàn)的報(bào)告,引起了JackSzostak的極大興趣。他那時(shí)候正試圖在釀酒酵母中構(gòu)建人工線性染色體，讓它能夠在細(xì)胞中像自然染色體一樣復(fù)制。但當(dāng)環(huán)狀質(zhì)粒線性化并轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，很快就被降解掉。

端粒telomeres

端粒序列的發(fā)現(xiàn)使JackSzostak有時(shí)機(jī)把線性質(zhì)粒末端連接到四膜蟲的端粒DNA，然后再倒入酵母細(xì)胞中。奇跡發(fā)生了：線性質(zhì)粒不再被降解，而是在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并復(fù)制。這是人工染色體的最早雛形，它使得DNA的大片段克隆成為可能，后來(lái)為人類基因組測(cè)序工作立下了汗馬功績(jī)。人工染色體端粒telomeres

端粒----穩(wěn)定線性染色體的末端結(jié)構(gòu)Def.

存在于染色體末端的一段特殊的DNA重復(fù)序列端粒和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中；不同種類細(xì)胞的端粒重復(fù)單位不同，大多長(zhǎng)約5—8bp;端粒的結(jié)構(gòu)與功能具有保守性.端粒telomeres

端粒的功能端粒telomeres

ABCDETPE效應(yīng)固定染色體位置保護(hù)染色體末端防止染色體復(fù)制時(shí)喪失決定細(xì)胞壽命端粒酶活性的發(fā)現(xiàn)Liz女士的實(shí)驗(yàn)室在研究四膜蟲端粒序列的過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象:帶著四膜蟲端粒DNA的人工染色體導(dǎo)入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜蟲的端粒序列.

由于端粒是由重復(fù)序列組成的,當(dāng)時(shí)人們普遍猜測(cè)同源重組是延伸端粒補(bǔ)償染色體末端隱縮的機(jī)制.但是同源重組只能復(fù)制出更多本身的序列,為什么在四膜蟲端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜蟲本身的序列呢?這個(gè)現(xiàn)象是同源重組無(wú)力解釋的.端粒酶telomerase

ElizabethBlackburn和CarolGreider的實(shí)驗(yàn)四膜蟲在接合細(xì)胞的大核發(fā)育過(guò)程中,大核產(chǎn)生了非常豐富的小染色體,每一個(gè)小染色體都在末端加上了端粒,可以推測(cè):如果“酶〞的假說(shuō)成立,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的酶活性應(yīng)該是非常高的.重組or酶?端粒酶telomerase

用四膜蟲的核抽提液與體外的端粒DNA進(jìn)行溫育,試圖在體外檢測(cè)到這個(gè)酶的活性,看到端粒的延伸.

ElizabethBlackburn和CarolGreider的實(shí)驗(yàn)端粒酶telomerase

經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化條件,尤其是把底物換成體外合成的高濃度的端粒DNA后,Carol通過(guò)曝光x光片,清楚地看到了“酶〞的活性:在測(cè)序膠的同位素曝光片上,端粒底物明顯被重新加上了DNA堿基,而且每六個(gè)堿基形成一條很深的帶,與四膜蟲端粒重復(fù)根本單位為六個(gè)堿基正好吻合.

ElizabethBlackburn和CarolGreider的實(shí)驗(yàn)端粒酶telomerase

這種酶活性不依賴于DNA模板,只對(duì)四膜蟲和酵母的端粒DNA進(jìn)行延伸,而對(duì)隨即序列的DNA底物不延伸;并且該活性不依賴于DNA聚合酶.而同源重組對(duì)序列沒(méi)有特異性要求,并且依賴于DNA聚合酶的活性.至此,她們澄清了這兩種假說(shuō),證明了有一種酶來(lái)延伸端粒DNA,即端粒酶(telomerase)ElizabethBlackburn和CarolGreider的實(shí)驗(yàn)端粒酶telomerase

NobelPrizeinMedicineAwardedforCreakingDNAPuzzle端粒酶亞基Liz實(shí)驗(yàn)室與TomCech合作,對(duì)端粒酶活性進(jìn)一步定性.用RNA酶處理樣品,降解樣品的RNA→酶活性消失用蛋白酶消化→酶活性消失

端粒酶telomerase

RNA亞基有一段RNA序列正好和四膜蟲的端粒DNA序列互補(bǔ),端粒酶正式利用RNA亞基的這段序列作為模板重復(fù)復(fù)制出端粒DNA端粒酶RNA亞基的發(fā)現(xiàn)端粒酶telomerase

DanielGottschling利用TPE效應(yīng)設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn),篩選酵母RNA亞基基因:

把URA和ADE連個(gè)基因通過(guò)遺傳重組的方法置入端粒區(qū)域,由于TPE效應(yīng),URA和ADE不表達(dá).酵母只能在含有uracil的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),且克隆是紅色的.再轉(zhuǎn)入cDNA表達(dá)庫(kù),某些調(diào)控端粒長(zhǎng)度的基因通過(guò)過(guò)表達(dá)可以改變端粒的長(zhǎng)度.如果端粒長(zhǎng)度變得足夠短,TPE效應(yīng)就會(huì)消失,URA和ADE兩個(gè)基因就會(huì)啟動(dòng)表達(dá).這種短端粒的酵母能夠在不含有uracil的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),并且酵母克隆顯示出白色端粒酶RNA亞基的發(fā)現(xiàn)端粒酶telomerase

端粒酶催化亞基端粒酶既然能夠利用RNA模板亞基來(lái)復(fù)制DNA,那么很容易推測(cè)這個(gè)蛋白亞基可能具有RNAdependentDNApolymerase活性(依賴于RNA的DNA聚合酶活性),即逆轉(zhuǎn)錄酶活性.更進(jìn)一步說(shuō),它的蛋白質(zhì)序列里應(yīng)該包含逆轉(zhuǎn)錄酶特有的結(jié)構(gòu)區(qū)域.ETS1ETS2ETS3ETS4(CD13)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)共表達(dá)了端粒酶的催化亞基和RNA亞基,在體外重建了端粒酶活性端粒酶telomerase

Nature:端粒酶的活化成功逆轉(zhuǎn)未老先衰實(shí)驗(yàn)鼠衰老過(guò)程哈佛科學(xué)家最近破天荒地令年老的老鼠器官獲得新生，成功逆轉(zhuǎn)衰老過(guò)程，這項(xiàng)突破成果或有望防治腦退化癥(老人癡呆癥)、糖尿病和心臟病等疾病，甚至有望翻開(kāi)永恒青春的奧秘，進(jìn)一步邁向研制“長(zhǎng)生不老藥〞。研究員飼養(yǎng)了一些經(jīng)基因改造的老鼠，令它們因缺乏“端粒〞而未老先衰，出現(xiàn)嗅覺(jué)衰退、腦部縮小、不育、腸部和脾臟受損等疾病，使它們皮膚、大腦、內(nèi)臟和其它器官老化。將這些老鼠分為兩組，把一種名為“TERT〞的定時(shí)釋放藥物，植入其中一組老鼠的皮下，重啟它們體內(nèi)休眠的“端粒〞基因。結(jié)果在短短2個(gè)月內(nèi)，有注射TERT的老鼠體內(nèi)長(zhǎng)出許多新的細(xì)胞，主要器官運(yùn)作功能改善，身體差不多完全“返老還童〞，當(dāng)中雄性的老鼠更恢復(fù)生育功能。實(shí)驗(yàn)鼠最終活到正常鼠的壽命，但并不比普通鼠壽命長(zhǎng)。進(jìn)行研究的德皮尼奧博士表示，實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)人類而言，就像一個(gè)40歲的人，身體未老先衰像80多歲的老人，而這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)孓D(zhuǎn)衰老過(guò)程，把他變回50歲一般。

德皮尼奧說(shuō)：“這些是嚴(yán)重衰老的動(dòng)物，但經(jīng)過(guò)一個(gè)月治療后，它們已有具體康復(fù)跡象，包括腦部長(zhǎng)出新的細(xì)胞。〞他指出，這是首次有老鼠實(shí)驗(yàn)成功把衰老過(guò)程逆轉(zhuǎn)，意味著一些老化的器官也有“重生〞的可能。不過(guò)，要把這一科技應(yīng)用于人體身上將會(huì)較為困難，老鼠一生中都能制造端粒，但是人類到成年后便會(huì)自動(dòng)“關(guān)掉〞這種，從而阻止細(xì)胞增長(zhǎng)失控，以免轉(zhuǎn)化成癌癥。因此，提升人體的“端粒〞水平雖然或有助減緩衰老速度，但同時(shí)增加患癌的風(fēng)險(xiǎn)。

德皮尼奧認(rèn)為，“TERT〞療法如果是分階段進(jìn)行，和只用于身體沒(méi)有癌細(xì)胞及較為年青的人身上，療法或?qū)θ梭w平安。牛津大學(xué)生物化學(xué)家考克斯認(rèn)為，這項(xiàng)研究“非常重要〞，證明原那么上短期恢復(fù)成人體內(nèi)的“端粒〞，能令年老的組織重生和恢復(fù)生理功能?？茖W(xué)思想PuzzlesAssumptions模式生物生化技術(shù)靜心閱讀文獻(xiàn)和縝密思考,找出問(wèn)題的關(guān)鍵,并對(duì)課題進(jìn)行精心討論和設(shè)計(jì)

Timewilltellwhichconnectionsbetweentelomeraseandhealthwillendure…Wedidnotsetou