實驗SDS-PAGE蛋白電泳

蛋白質的分離聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳法一、實驗目的學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術二.基本原理(一)電泳電泳:帶電顆粒在電場的作用下,向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象.(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳

用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質.以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。1凝膠聚合催化體系化學催化：AP-TEMED催化體系Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結構

化學聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復性好。聚合反應受各種因素的影響：?

催化劑和加速劑的濃度?pH堿性條件?

溫度?

分子氧?

雜質

2.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性(1)凝膠有彈性，機械性能好；幾乎無吸附和電滲作用，樣品分離重復性好；(2)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度較高。(3)凝膠孔徑可調節(jié)，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑；(4)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。

分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關系3.凝膠濃度的選擇與被分離物質分子量密切相關

4.聚丙烯酰胺凝膠種類(1)連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類

不連續(xù)系統(tǒng):是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，既存在電荷效應，也有分子篩效應。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。

(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。三.實驗器材1、電泳儀,電泳槽及其附件2、培養(yǎng)皿3、搖床4、燒杯5、移液管6、微量進樣器7、針管電泳裝置電泳儀：提供直流電在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅動帶電分子的遷移垂直平板電泳槽每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。四.實驗試劑BSA；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液pH8.9；濃縮膠緩沖液:Tris-HCl緩沖液pH6.7；分離膠貯液:Acr28.0g,Bis0.735g,無離子水溶解定容至100ml；濃縮膠貯液:Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml；過硫酸銨溶液（AP）電泳緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3；10%SDS固定染色液脫色液(一)垂直平板電泳槽的安裝(二)凝膠的制備(三)加樣(四)電泳(五)固定和染色(六)脫色五.操作步驟五.操作步驟(一).垂直平板電泳槽的安裝注意短玻璃板是向內(nèi)側的。要將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。(二).凝膠的制備1分離膠的制備(7%)配8mL(按如下順序加入）分離膠緩沖液1mL分離膠貯液2mL去離子水4.7mL10%SDS0.08mLTEMED10uL過硫酸胺（AP)0.20mL將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至3/4處，再取大約3mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。加入AP后請迅速混勻加樣，否則易凝固無法加樣凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.

水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡2.凝聚后倒出上層的高純水，可用濾紙在邊緣吸水。3.濃縮膠的制備(2.5%)配4mL(按如下順序加入）濃縮膠緩沖液0.5mL濃縮膠貯液1mL去離子水2.45mL10%SDS0.04mLTEMED8uL過硫酸胺（AP)0.1mL迅速混勻,用膠頭滴管沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面,直至上邊緣,迅速插入加樣梳,室溫靜置一段時間.※加樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面貼長玻板.凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳。加入緩沖液除去底板，將制膠裝置放在電泳槽內(nèi)，加入Tris－甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內(nèi)槽加入，上液面超過短玻璃板，外槽液面沒過最下一個螺絲處。用微量移液器取10uL蛋白樣品，再加入10uL上樣緩沖液，80度水浴5分鐘。用離心機短暫離心5秒，在梳子產(chǎn)生的加樣孔上方，兩塊玻板夾縫處緩緩進樣20uL,取蛋白標準7uL（已經(jīng)含有上樣緩沖液）按同樣方法處理，每塊平板加入一份蛋白標準。(三).上樣(四).電泳將電泳儀的正極負極與電泳槽連接（方向切勿接錯），打開電泳儀開關，將電壓調至200V。當藍色染料遷移至距離凝膠下端2cm時，關閉電源。電泳結束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂），將凝膠移至培養(yǎng)皿中染色?！鶆兡z時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.(五).固定和染色

將凝膠放入固定染色液中，使染色液剛好沒過膠板，放到搖床上，緩慢搖動，染色7min。(注意染色液要用漏斗回收）(六).脫色放置搖床上，用脫色液漂洗數(shù)次，直至背景藍色褪去。

六.實驗結果可在培養(yǎng)皿下襯一白紙，便于觀察。1、Acr和Bis為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作應小心。2、玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應嚴格的