第七章之后四基因治療

基因治療1.基因治療歷史與現(xiàn)狀20世紀(jì)80年代初，Cline首次對(duì)β-珠蛋白生成障礙性貧血患者進(jìn)行基因治療嘗試1990年9月，美國(guó)批準(zhǔn)世界上首個(gè)基因治療方案。腺苷酸脫氨酶（ADA）基因。1989-1995，企業(yè)界投入10億美元從事研究；1995-1996年，NIH對(duì)美國(guó)已進(jìn)行的103個(gè)基因治療研究方案進(jìn)行了評(píng)估；急功近利、不切實(shí)際；1996年，載體研究初見(jiàn)成效，非病毒型載體改建成功，在細(xì)胞中表達(dá)效率提高了100倍以上。開(kāi)展基因治療臨床試驗(yàn)的主要國(guó)家和地區(qū)國(guó)家或地區(qū)臨床方案數(shù)%病例數(shù)%美國(guó)27874.4220070.2英國(guó)184.81113.5法國(guó)143.8892.8德國(guó)82.1672.1意大利82.1391.2加拿大71.9481.5瑞士71.9341.1埃及10.3150.5日本30.850.2中國(guó)20.540.1新加坡20.5190.6韓國(guó)10.310以色列10.300已進(jìn)行基因治療臨床試驗(yàn)的受試對(duì)象與疾病類(lèi)型類(lèi)型臨床方案數(shù)%病例數(shù)%腫瘤23462.7213468.1單基因遺傳病5314.22969.4基因標(biāo)志41112277.2感染性疾病30840512.9健康志愿者20.560.2其他133.5662.1惡性腫瘤中，惡性黑色素瘤約占40%，轉(zhuǎn)移腫瘤占14%，惡性膠質(zhì)瘤占11%，乳腺癌10%，腎癌7%，結(jié)腸癌6%等?；蛑委熍R床試驗(yàn)所采用的主要載體與轉(zhuǎn)移方法載體或方法臨床方案數(shù)%病例數(shù)%逆轉(zhuǎn)錄病毒載體15441.3119438.1脂質(zhì)體6918.572523.1腺病毒載體6316.936411.6牛痘病毒載體246.41304.1產(chǎn)RV細(xì)胞215.642013.4裸DNA133.5692.2基因槍41.1351.1腺相關(guān)病毒載體30.8361.1電穿孔20.5200.62.基因治療的概念與策略基因治療的定義：

將正常功能性基因置換或彌補(bǔ)缺陷基因的手段，廣義地講，即將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)某個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)從而獲得治療效果，導(dǎo)入的基因可以是與缺陷基因?qū)?yīng)的功能性同源基因，也可以是與缺陷基因無(wú)關(guān)的治療基因?；蛑委煹牟呗曰蛑脫Q(genereplacement)基因修復(fù)(genecorrection)基因增補(bǔ)(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)免疫調(diào)節(jié)(immuneadjustment)基因治療的途徑invivo，稱(chēng)為活體直接轉(zhuǎn)移，指將外源基因直接注入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞。更簡(jiǎn)單、直接和經(jīng)濟(jì)，療效也比較確切，常用的體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移手段有病毒介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)和基因直接注射等。exvivo，稱(chēng)為在體轉(zhuǎn)移，指在體外將外源基因?qū)爰?xì)胞，再將這種細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。該方法經(jīng)典、安全且效果容易控制，但技術(shù)復(fù)雜。3.基因轉(zhuǎn)移的方法物理方法：包括裸DNA直接注射、微粒轟擊、電穿孔、顯微注射等?；瘜W(xué)方法：磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。生物學(xué)方法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、嵌合病毒載體。幾種常見(jiàn)的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法的比較名稱(chēng)機(jī)制轉(zhuǎn)染效率用途優(yōu)缺點(diǎn)影響因素細(xì)胞核微注射直接注射50-100%穩(wěn)定轉(zhuǎn)化需要特殊儀器,處理樣品數(shù)量少,高效注射技術(shù),DNA濃度電穿孔高壓在膜上形成微孔較高瞬時(shí)表達(dá),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化需要精密儀器,可用于動(dòng)、植物細(xì)胞和細(xì)菌電場(chǎng)強(qiáng)度，脈沖長(zhǎng)度，溫度，DNA濃度，培養(yǎng)液原生質(zhì)體融合細(xì)胞膜融合50-100%瞬時(shí)表達(dá),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化操作復(fù)雜，不能進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，慎用于篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株溶菌酶，PEG濃度，溫育時(shí)間脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂膜融合50-60%瞬時(shí)表達(dá),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化操作簡(jiǎn)單，可用于體內(nèi)試驗(yàn)脂質(zhì)體質(zhì)量，DNA濃度磷酸鈣共沉淀內(nèi)吞作用20%瞬時(shí)表達(dá)簡(jiǎn)單有效，適用于貼壁、非貼壁細(xì)胞Ca2+，DNA濃度，pH，沉淀時(shí)間，氯喹、甘油和丁酸鈉處理基因治療的載體可分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類(lèi)。

病毒性載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、皰疹病毒(HSV)及腺相關(guān)病毒（AAV）等。

非病毒性載體主要包括脂質(zhì)體、分子偶聯(lián)載體、裸露DNA等常見(jiàn)病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)比較載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)主要用途逆轉(zhuǎn)錄病毒，單鏈RNA病毒，約10kb基因組小并且簡(jiǎn)單，生物學(xué)特性清楚，可有效整合到靶細(xì)胞的基因組中，并穩(wěn)定持久表達(dá)所帶外源基因，表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，可高效感染分裂細(xì)胞插入容量有限，可能會(huì)與有復(fù)制能力的病毒重組，有致癌的危險(xiǎn)Exvivo基因治療，腫瘤基因治療腺病毒，雙鏈DNA病毒，36kb生物學(xué)特性清楚，可感染分裂和非分裂細(xì)胞，在非分裂細(xì)胞中也可進(jìn)行高效的體內(nèi)感染，病毒滴度高，外源基因表達(dá)水平較高不與宿主基因組整合，表達(dá)時(shí)間較短，病毒蛋白免疫原性強(qiáng)，可引起免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，插入容量有限（7-8kb）Ivvivo基因治療，特別適于原位使用，尤其是肺部，腫瘤基因治療常見(jiàn)病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)比較（續(xù)）載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)主要用途腺伴隨病毒，單鏈DNA病毒，4.6kb無(wú)毒、無(wú)致病性，免疫原性弱，可位點(diǎn)特異性整合于人19號(hào)染色體，長(zhǎng)期表達(dá)外源基因，可感染分裂和非分裂細(xì)胞，在骨骼肌、心肌、肝、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高基因組小，攜帶外源基因能力有限（4kb），需腺病毒等輔助復(fù)制，難得到高滴度病毒Ivvivo及exvivo基因治療，遺傳疾病基因治療，獲得性慢性疾病的基因治療單純皰疹病毒，雙鏈DNA病毒，152kb插入容量可達(dá)50kb以上，可同時(shí)裝載多個(gè)目的基因，具有嗜神經(jīng)性，可潛伏感染，可感染分裂和非分裂細(xì)胞分子生物學(xué)特性尚未完全闡明，神經(jīng)毒性在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療方面得到了廣泛應(yīng)用4.基因治療的靶細(xì)胞生殖細(xì)胞基因治療(germcellgenetherapy)

精細(xì)胞、卵細(xì)胞、早期胚胎體細(xì)胞基因治療（somaticcellgenetherapy）

造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞靶細(xì)胞的選擇需考慮：①最好為組織特異性細(xì)胞；②細(xì)胞較易獲得，且生命周期長(zhǎng)；③離體細(xì)胞較易受外源基因的轉(zhuǎn)化；④離體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時(shí)間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)，仍較易成活。造血干細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：骨髓移植技術(shù)相當(dāng)成熟；骨髓造血干細(xì)胞具有不斷分裂，分化成各種血細(xì)胞的潛能；基因產(chǎn)物在骨髓細(xì)胞成熟后可以通過(guò)血液循環(huán)遍布全身。缺點(diǎn)：骨髓造血干細(xì)胞在骨髓細(xì)胞中所占比例很低，僅0.1%。成纖維細(xì)胞

容易獲取和體外培養(yǎng)，也容易植回體內(nèi)；易轉(zhuǎn)染、并能穩(wěn)定地表達(dá)外源目的基因，合成和分泌的蛋白質(zhì)可通過(guò)血液供各種類(lèi)型細(xì)胞使用；植回的成纖維細(xì)胞很容易被取出。肝細(xì)胞

肝臟是人體代謝過(guò)程的中心，是基因治療的重要靶器官。肌細(xì)胞

肌肉組織數(shù)量大，易獲?。怀杉〖?xì)胞容易分離培養(yǎng)，并易于基因轉(zhuǎn)移；基因轉(zhuǎn)移成肌細(xì)胞易移植回肌肉，并易與原位肌纖維融合；豐富的血管可以將基因產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)饺?。淋巴?xì)胞

在提取、體外培養(yǎng)、回輸體內(nèi)、基因轉(zhuǎn)移效率和體內(nèi)高效表達(dá)等方面均不存在問(wèn)題。唯一的缺點(diǎn)是回輸體內(nèi)后的壽命不長(zhǎng)，需要經(jīng)常輸入?？晒┗蛑委熯x擇的某些遺傳病遺傳疾病缺失的基因產(chǎn)物細(xì)胞類(lèi)型嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷腺苷脫氨酶T/B淋巴細(xì)胞慢性肉芽腫病細(xì)胞色素B嗜中性細(xì)胞Gaucher病糖腦苷酶巨噬細(xì)胞鐮狀細(xì)胞貧血β-珠蛋白紅細(xì)胞α和β地中海貧血α和β珠蛋白紅細(xì)胞Lesch-Nghan癥群次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基低神經(jīng)節(jié)Duchene肌萎癥抗萎縮素肌肉Parkinson病多巴胺腦黑質(zhì)肺氣腫α-1抗胰酶肺上皮囊性纖維化CF跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑肺/胰腺上皮苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶肝細(xì)胞家族性高膽固醇血癥低密度脂蛋白質(zhì)體肝細(xì)胞血友病A和B因子Ⅷ和Ⅸ血小板、肝細(xì)胞等5.惡性腫瘤的基因治療細(xì)胞因子導(dǎo)入療法“自殺”基因療法腫瘤抑制基因療法耐藥基因療法反義基因療法細(xì)胞因子導(dǎo)入療法：細(xì)胞因子是免疫活性細(xì)胞分泌的蛋白多肽類(lèi)物質(zhì)，它們可以作用于細(xì)胞本身和其他細(xì)胞。將許多編碼細(xì)胞因子的基因作為目的基因?qū)爰?xì)胞，使其在宿主或局部腫瘤中穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá)，通過(guò)增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫達(dá)到治療的目的。自殺基因治療：就是將細(xì)菌、病毒和真菌中特有的藥物敏感基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，通過(guò)此基因編碼的特異性酶類(lèi)將原先對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或毒性極低的藥物前體在腫瘤細(xì)胞中代謝成有度的產(chǎn)物，以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，也稱(chēng)前藥轉(zhuǎn)換療法。腫瘤抑制基因療法：腫瘤抑制基因的失活與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。將正常的腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中可代替和補(bǔ)償缺陷的基因，以抑制腫瘤的生長(zhǎng)或逆轉(zhuǎn)其表性，這種替代療法是從根本上攻克腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。耐藥基因療法：藥物耐受是腫瘤治療中常見(jiàn)的問(wèn)題，它同時(shí)也明顯阻礙了腫瘤化療的效果。決定細(xì)胞這種耐藥性的基因成為多耐藥基因（MDR）。將一些耐藥基因轉(zhuǎn)移至造血干細(xì)胞，以降低化療藥物對(duì)骨髓的毒性，這樣就可能用高劑量的藥物殺死腫瘤細(xì)胞而不破壞骨髓細(xì)胞.反義基因療法：是指利用人工合成的反義RNA或DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，阻斷