木質素的微生物降解

木質素的微生物降解摘要：綜述了木質素微生物降解酶系及酶活性調控措施，介紹了木質素降解機制及木質素微生物降解的應用。

關鍵字：木質素微生物降解木素降解酶系木質素是植物的主要成分之一，占植物細胞化學組成的15%～30%。在植物體中，木質素是包裹在纖維素的外面，功能之一就是保護植物細胞不受外界微生物的侵蝕。從生物合成過程研究得知，木質素首先是由葡萄糖發(fā)生芳環(huán)化反應形成莽草酸（Shikirnicacid），然后由莽草酸合成三種具有苯丙烷結構的基本單元，分別為：對香豆醇、松柏醇、芥子醇。從化學結構看，針葉樹的木質素主要由松柏醇的脫氫聚合物構成愈創(chuàng)木基木質素；闊葉樹的木質素由松柏醇和芥子醇的脫氫聚合物構成愈創(chuàng)木基—紫丁香基木質素；草本植物則由松柏醇、芥子醇和對香豆醇的脫氫聚合物和對香豆酸組成[1]。木質素是結構復雜、穩(wěn)定、多樣的無定形三維體型大分子，在自然界中，降解緩慢，成為地球生物圈中碳循環(huán)的障礙。1木質素微生物降解酶系及酶活性調控自然界參與降解木質素的微生物的種類有真菌、放線菌和細菌。其中，真菌能把木質素徹底降解為CO2和水。降解木質素的真菌主要分為三類：白腐菌、褐腐菌和軟腐菌。白腐菌在木質素的生物降解中占有十分重要的地位。白腐菌多數是擔子菌（Basidiomycetes[2]，少數為子囊菌。黃孢原毛平革菌是研究最多的木質素降解菌。Tien[3]和Glenn兩個研究小組幾乎同時發(fā)現木質素被降解的關鍵是黃孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）產生的胞外木質素過氧化物酶系的作用。該酶系包括木質素過氧化物酶（Ligninperoxidase，簡稱Lip）、錳過氧化物酶（Mn-dependentperoxidase，簡稱MnP），除此之外，還有蟲漆酶、HRP、CDH等酶類[4]。云芝（Corilusversicolor）是一種非常重要的白腐菌，對木質素的降解能力較強。丁少軍等[5]研究了云芝漆酶的培養(yǎng)和分離純化研究，發(fā)現在云芝的木質素降解過程中，漆酶活力較高而木素過氧化物酶、錳過氧化物酶活力較低，它們對木質素的降解率比黃孢原毛平革菌提高近一倍，并認為漆酶在云芝的木質素降解過程中起非常重要的作用。林鹿等[6]研究了白腐菌木云芝和黃孢原毛平革菌對制漿黑液中硫酸鹽木質素的降解作用和影響因素。他們發(fā)現分子量在1500～3000kD之間的硫酸鹽木質素降解最為顯著；兩種白腐菌的降解能力不同，培養(yǎng)10天后，木云芝Lu-11的降解率達74.5%，降解產物只有一種主要組分，而黃孢原毛平革菌的降解率為65.6%，降解產物有兩種，培養(yǎng)條件如：碳源、氮源、pH值、溫度對白腐菌降解硫酸鹽木質素的作用有明顯影響；在白腐真菌胞內中，除含有利用H2O2的過氧化物酶系外，還分泌利用O2的多酚氧化酶系，主要為漆酶（laccase），該酶需要依賴氧和助劑的存在才能有明顯的脫甲氧基和脫木質素作用。Andrzej[7]綜述了漆酶在木質素降解的作用與活性，認為蟲漆酶在木質素降解中起非常關鍵的作用。付時雨等[8,9]用漆酶/助劑通入氧氣處理葦漿殘余木素，通過甲氧基的測定、元素分析、13C-NMR、IR分析葦漿殘余木素與漆酶/助劑反應前后結構的變化，研究發(fā)現葦漿殘余木素在反應后甲氧基、酚羥基減少，醇羥基增多，木素結構中羧基增多，木素的苯環(huán)結構發(fā)生了開環(huán)反應。除上述酶類外，白腐菌還產生胞內H2O2產生酶，因胞內還有過氧化物水解酶，因此胞內不會積累；纖維二糖脫氫酶和纖維二糖/醌還原酶系（CBQ）也是白腐菌產生的重要的木素降解酶[10]。黃峰等[11,12]報道用裂褶菌（Schizophllumcommune）所產的纖維二糖脫氫酶（CDH）加入在黃胞原毛平革菌錳過氧化物酶解硫酸鹽漿木質素，結果發(fā)現木質素溶出物質明顯增加；木質素中甲氧基、羧基、酚羥基和總羥基含量減少，CDH促進了錳過氧化物酶（MnP）的降解作用。表明CDH不僅能促進纖維素的降解，而且也是木質素降解體系中的重要組成部分。纖維二糖/醌還原酶（CBQ）是1974年由Westermark和Erikssion發(fā)現的。木質素在氧化酶作用下轉變?yōu)榉辑h(huán)自由基和醌類，CBQ能防止活性中間體再聚合，將醌還原為氫醌，CBQ在纖維素和木素降解中起到了協同作用，即纖維素降解產物為木質素的降解提供還原力[13]。謝君等[14]利用白腐側耳菌（P.sp2）和粗毛栓菌（T.gallica）在含有麥草的液體培養(yǎng)基中生產木質纖維素降解酶的研究，發(fā)現側耳sp2和粗毛栓菌在液體培養(yǎng)基中產木質纖維素酶類的能力強、產酶較快，且首先降解木質素，側耳菌和粗毛栓菌比較，粗毛栓菌（T.gallica）具有更強的分解麥草木質素的能力，60天后麥草中70.14%的木質素被降解。不同的生理條件對微生物降解木質素的重要影響成為木質素微生物降解研究的一個熱點問題[15,16]，王宜磊[17]研究了碳源與氮源對彩絨革蓋菌Coridusversicolor木質素酶分泌的影響，發(fā)現淀粉含量豐富的物質作碳源有利于木質素降解酶的分泌，而尿素對木質素降解酶的分泌有抑制作用，具體原因有待于進一步研究；王佳玲等[18,19]研究了氮源、碳源及Mn2+濃度對Panusconchatus分泌木質素降解酶的影響，認為高氮條件可能是這種類型的白腐菌生產木素降解酶的重要條件，同時發(fā)現紫丁香醛和香豆酸對其錳過氧化物酶和漆酶分別起顯著的誘導作用，碳源的種類對MnP和漆酶（laccase）產生的影響有明顯的差異，Mn2+對P.conchatusMnP和laccase的產生有明顯的調節(jié)作用：不加Mn2+條件下，P.conchatus幾乎不分泌MnP，加入Mn2+并提高Mn2+濃度，MnP活力隨之提高，而laccase活力卻相應降低。余惠生等[20]研究了銅（Ⅱ）離子濃度的變化對白腐菌Panusconchatus產漆酶的影響，結果表明漆酶的產生顯著受Cu2+的調控，沒有銅離子存在，漆酶的活性很低，增加Cu2+濃度，漆酶的活性增大，但過多的Cu2+又會對漆酶產生抑制作用，使酶活降低。2木質素生物降解機制[21]（1）木質素模型化合物的Ca-Cb斷裂現已基本確定，通過單電子轉移機制，LiP催化氧化b-1非酚型木質素模型化合物為其芳香正離子自由基，經Ca-Cb斷裂形成3,4-二甲氧基苯乙醇自由基和質子化形式的藜蘆醛。有氧存在時，前者加氧后再釋放超氧離子形式羰基，或形成醇，無氧存在時則溶劑水參與而形成醇。付時雨等[22]利用色—質聯用技術分析了稻草木質素經白腐菌Panusconchatus生物作用后木質素降解產物中低分子酸性組分的主要變化及其結構，通過質譜對其主要11種化合物結構進行分析，證實木質素生物降解過程發(fā)生木質素側鏈Ca-Cb鏈氧化斷裂。（2）Ca-氧化機制LiP催化b-O-4木質素模型化合物的主要反應是Ca-Cb斷裂形成的藜蘆醛和2-甲氧基苯酚，后者在反應條件下易于聚合，同時還有相當一部分形成Ca氧化產物。這種氧化產物是正離子自由基中間體失去質子或直接失去氫形成的。在活性氧存在時，后者更容易發(fā)生。（3）芳環(huán)取代機制在催化反應中形成的芳香正離子自由基與溶劑水或其他親和試劑作用，隨底物的不同而發(fā)生不同類型的反應，例如，當苯環(huán)上的取代基是甲氧基時，就發(fā)生脫甲氧基反應，氧化形成相應的醌。（4）氧的活化在木質素模型化合物氧化中一種普遍現象是分子氧與羥基取代的苯自由基間的反應中能引起氧的活化，氧被還原成超氧離子，又與氫質子反應生成H2O2與O2，這個過程是發(fā)生在分子氧與苯基中間體之間的純化學過程。這個反應也出現在木質素過氧化物酶的催化循環(huán)中，其結果是O2成為最終的電子受體。（5）藜蘆醇及其衍生物的氧化藜蘆醇是黃孢原毛平革菌的一個次級代謝產物，又被木質素過氧化物酶所分解，分解產物主要是藜蘆醛，其次是開環(huán)產物和醌，產物的分布受pH值控制。（6）芳香環(huán)開裂利用標記底物和反應物的方法對許多模型化合物進行芳香環(huán)的開裂反應研究表明，藜蘆醇開環(huán)反應的機制也適用于木質素單體、二聚體和低聚體模型化合物，在大多數請況下都得到了多種產物的混合物。（7）單甲氧基芳香物的氧化對于3,4-二甲氧基芳香環(huán)，非但可被Phanerochaetechrysosporium代謝，而且可被LiP氧化，單甲氧基芳香環(huán)雖然可被Phanerochaetechrysosporium代謝，卻不被LiP氧化，然而加入少量的藜蘆醇或其他的二甲氧基芳香物，則能大大提高單甲氧基芳香物的反應速度。（8）醌／氫醌的形成漆酶是一種含銅的酚氧化酶，它能催化酚型二聚體模型物b-1和b-O-4結構經過Ca-芳烴斷裂，產生甲氧基取代的醌／氫醌。辣根過氧化物酶（HRP）也能得到類似的結果。單體木質素模型物如香草酸、香草醛、香草醇等也能被氧化成甲氧基取代的醌／氫醌。余惠生等[23]用定量13C-NMR技術研究了稻草經白腐菌Panusconchatus降解后木質素的高分子部分的結構特征變化，發(fā)現發(fā)酵稻草木質素的13C-NMR圖譜出現新的吸收峰以及某些吸收峰的強度有明顯變化，這些變化證實了在生物作用過程中木質素大分子中形成了醌類。（9）漆酶催化木質素氧化的機制漆酶以O2作電子受體催化多酚化物經四次單電子傳遞形成醌及自由基的含銅的酚氧化酶，而且不需要H2O2參與，對于木質素而言，其反應包括脫甲氧基、脫羥基、C-C鍵斷裂過程等。3木質素微生物降解的意義木質素是自然界可再生的含量豐富的天然高分子聚合物，也是化學制漿工業(yè)中重要的廢棄物和污染物。（1）應用于污染治理與環(huán)境保護傳統的化學制漿會帶來大量的工業(yè)廢水，污染環(huán)境，將木質素的生物降解應用于生物制漿及造紙廢水的處理，不僅可以極大地改善造紙工業(yè)的環(huán)境污染問題，還有利于減少能耗創(chuàng)造經濟價值。GaryWard[24]利用木素過氧化物酶處理2,4二溴苯酚等工業(yè)廢水，在氧化的過程中伴隨二聚體、三聚體和四聚體的形成，消除了廢水的毒性。我國的紡織業(yè)和印染業(yè)非常發(fā)達，印染廢水的污染成為水污染的一個重要來源，陳葉福等[25]綜述了木質素生物降解與紙漿工業(yè)廢水脫色，認為白腐真菌能降解木質素和相關化合物，有可能成為傳統處理方法的替代方法。據文獻報道，黃孢原毛平革菌在產酶條件下可以降解偶氮染料、蒽醌染料以及三苯甲烷等多種類型的染料。張朝暉等[26,27]研究了黃孢原毛平革菌所產木質素過氧化物酶系對染料降解的研究，建立了木質素過氧化物酶降解偶氮染料卡布龍紅的動力及過程模型。（2）應用于造紙工業(yè)木素酶的生物漂白技術是通過生物木素酶直接作用于紙漿的殘余木質素，并使之發(fā)生降解溶出，從而有利于紙漿的進一步漂白。林鹿等[28]研究了降解木素酶和降解木聚糖酶對硫酸鹽漿的生物漂白及機理，結果顯示，木素酶降低了紙漿的卡伯值，提高了紙漿的白度。（3）應用于化工產品木質素微生物降解有可能使其轉化為重要的化工產品、微生物蛋白飼料或有機肥料，使其變廢為寶。例如，用木質素降解菌處理飼料，可提高動物對飼料的消化率。目前，以木素酶、纖維素酶和植酸酶等組成的飼料復合多酶添加劑已達到商品化程度。當然，木質素的生物降解研究與應用最活躍的領域是生物制漿、工業(yè)廢水的處理，而應用于食品與發(fā)酵工業(yè)、飼料工業(yè)已經顯現出誘人的前景。4結語木質素是第二大可再生天然高聚合物，結構復雜，降解緩慢。研究木質素的降解對促進資源的高效利用、減輕環(huán)境污染有極其重要的意義。目前木質素的降解研究主要集中在木質素的生物降解機制、微生物種類及其產生的相關酶類、微生物的代謝調控機理等方面；在木質素降解酶系的協同作用機理、降解菌酶系的高效基因表達與調控方面研究成果還較少。通過人工誘變、基因重組、克隆技術篩選出特效高酶活降解菌，大規(guī)模應用于生物制漿、紙漿的酶法漂白、工業(yè)有機廢水的高效處理應成為木質素微生物降解研究的熱點領域。參考文獻：[1]謝君,任路,李維,等.白腐菌液體培養(yǎng)產生木質纖維素降解酶的研究[J].四川大學學報(自然科學版),2000,37(增刊):161-166.[2]LEVINL,FORCHIASSINF.LigninolyticenzymesofthewhiterotbasidiomyceteTrametestrogii[J].ActaBiotechnol,2001,21(2):179-186.[3]MingTien,TKentKirk.LignindegradingenzymefromthehymenomycetePhanetochaeteChrysosporiumBurds[J].Science,1983,221:661-665.[4]蔣挺大.木質素[M].第1版.北京:化學工業(yè)出版社,2001.[5]丁少軍,宋美靜.云芝漆酶的培養(yǎng)和分離純化的研究[J].纖維素科學與技術,1998,6(3):16-20.[6]林鹿,高楊,周學飛,等.白腐菌對制漿黑液中硫酸鹽木素的降解[J],環(huán)境科學,1997,18(1):23-26.[7]AndrzejLeonowicz,NamSeokCho,JolantaLuterek,etal.Fungallaccase:propertiesandactivityonlignin[J].JournalofBasicMicrobiology,2001,41(3-4):185-227.[8]付時雨.漆酶與助劑氧化體系降解葦漿殘余木素的研究[J].纖維素科學與技術,2001,9(2):8-16.[9]付時雨,楮青峰,詹懷宇.漆酶/助劑體系降解葦漿殘余木素的研究[J].中國造紙,2001(4):17-20.[10]徐海娟,梁文芷.白腐菌降解木素酶系及其作用機理[J].環(huán)境污染治理技術與設備,2000,1(3):51-54.[11]黃峰,方靖,盧雪梅,等.纖維二糖脫氫酶對過氧化物酶降解木素的促進作用[J].科學通報,2001,46(18):1523-1528.[12]HuangFeng,FangJing,LuXuemei,etal.Synergisticeffectsofcellobiosedehydrogenaseandmanganese-dependentperoxidasesduringlignindegradation[J].ChineseScienceBulletin,2001,46(23):1956-1962.[13]VincentJHSewalt,WolfgangGGlasser,JosephPFontenot,etal.Ligninimpactonfibredegradation:1-quinonemethideintermediatesformedfromligninduringInVitrofermentationofcornstover[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,1996,71(2):195-203.[14]謝君,孫迅,任路,等.側耳菌與粗毛栓菌在麥草培養(yǎng)基中產生木質纖維素降解酶的研究[J].生物工程學報,2001,17(5):575-578.[15]PKGill,DSArora.Effectofcultureconditionsonmanganeseperoxidaseproductionandactivitybysomewhiterotfungi[J].JIndMicrobiolBiotechnol,2003,30:28-33.[16]MemoryTekere,RemigioZvauya,JohnSRead.Ligninolyticenzymeproductioninselectedsub-tropicalwhiterotfungiunderdifferentcultureconditions[J].JournalofBasicMicrobiology,2001,41(2):115-129.[17]王宜磊.碳源和氮源對彩絨革蓋菌Coriolusversicolor木質纖維素酶和木質素酶分泌的影響[J].微生物學雜志,2000,20(1):19-31.[18]王佳玲,余惠生,黃秀瑜,等.碳源和Mn(Ⅱ)對白腐菌Panusconchatus產木素降解酶的影響[J].纖維素科學與技術,1998,6(3):27-31.[19]王佳玲,付時雨,余惠生,等.氮源濃度和芳香化合物對白腐菌Panusconchatus產木素降解酶的影響[J].纖維素科學與技術,1997,5(4):25-32.[20]余惠生,付時雨,王佳玲.銅（Ⅱ）對白腐菌Panusconchatus